Buku Penuntun Lab Mikro S1 REG INT1

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019
PENUNTUN DAN LAPORAN

PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
FARMASI
Tim Penyusun:
Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt.
Popi Patilaya, S.Si., M.Sc., Apt.
Imam Bagus Sumantri, S.Si., M.Si., Apt.
Dra. Erly Sitompul. M.Si., Apt.
Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt.
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI)
FARMASI
PROGRAM STUDI S1-REGULER-INTERNASIONAL
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UITARA
MEDAN 2019
0|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM
BIODATA PRAKTIKAN
Pas
Foto
3x4
Terbaru
(tidak boleh foto
Berpakaian seragam
Sekolah)
Nama Lengkap : ................................................................
NIM : ................................................................
Hari Praktikum : ................................................................
Gelombang : ................................................................
Kelompok : ................................................................
Asal Sekolah : ................................................................
Tanda tangan :

PERCOBAAN I
TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA
Sterilisasi Alat
Cara sterilisasi alat yang digunakan selama praktikum terdiri dari dua cara,
yaitu Sterilisasi Uap menggunakan Autoklaf dan Sterilisasi Panas Kering
menggunakan Oven. Cara dan Ketentuan sterilisasi mengacu pada Farmakope Edisi IV
(1995). Proses sterilisasi uap (panas basah) menggunakan Autoklaf bila tidak
dinyatakan lain berlangsung sclama 15 menit pada suhu 121°C. Autoklaf merupakan
proses sterilisasi yang paling banyak digunakan. Autoklaf dapat digunakan untuk
sterilisasi bahan dan alat. Proses sterilisasi panas kering menggunakan Oven umumnya
berlangsung selama l jam pada suhu 170°C. Oven umumnya digunakan untuk
sterilisasi alat-alat ataupun bahan-bahan yang tahan suhu tinggi.
Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan pada keseluruhan percobaan adalah Batang
pengaduk, Beaker Glas, Botol Akuades, Botol Semprot, Cawan Petri, Erlenmeyer,
Gelas Ukur, Inkubator suhu 35±2°C dan 25±2°C, Jamm Ose, Kompor Gas, Labu
Tentukur, Lampu Bunsen, Lemari Pendingin dilengkapi freezer, Mikro Pipet,
Autoklaf, Oven, Pencadang Logam/Kaca, Pinset, Rak Tabung Reaksi, Tabung
Durham, Tabung reaksi, Timbangan Digital.
Alat dan Bahan yang Harus Selalu Dibawa (Praktikan)

Alat dan bahan yang harus selalu dibawa setiap percobaan adalah aluminium
foil, gunting, hekter, kain kasa steril, kapas, kertas label, kertas perkamen kajang,
mancis/korek api, pipet tetes berkaret merah, pulpen, sabun/cairan antiseptis, selotip,
serbet/lap tangan, spuit jarum suntik, tali (benang bola), tisu gulung, tisu lensa
(percobaan pengecatan gram dan pemeriksaan jamur), wipol (desinfektan) dan
sejenisnya.
Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah akuades, etanol 70%,
spiritus KOH.
Cara Kerja
1. Dilakukan pengemasan alat-alat yang disterilisasi dan pembuatan media
2. Memilih metode sterilisasi yang tepat untuk alat-alat dan bahan-bahan yang
disterilisasi
Alat-alat yang disterilisasi

Alat-alat yang disterilisasi meliputi batang pengaduk, Beaker glas, botol
akuades, botol semprot, cawan petri, erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, labu tentukur,
mikro pipet, pecadang logam/kaca, pinset, pipet tetes, tabung durham, tabung reaksi.

Pertanyaan Penuntun (wajib isi sebelum praktikum):
1. Apa pengertian sterilisasi?

. .
. .
2. Apa pengertian steril?
. .
. .
3. Apa pengertian sterilitas?
. .
. .
4. Jelaskan pengertian dan prinsip kerja aseptis!
. .
. .
. .
. .
5. Jelaskan metode-metode sterilisasi dan sebutkan cara mensterilkan peralatan
dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

Hasil dan Pengamatan
No. Nama Alat Metode Sterilisasi Suhu dan Waktu Alat Sterilisasi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Pertanyaan Tambahan (wajib isi setelah praktikum):
Apa dasar pemilihan metode sterilisasi (oven atau autoklaf) dalam sterilisasi alat?
Medan, 2019
Pengawas Praktikum, Praktikan,
Tanggal ACC:
( ) ( )
Nama lengkap dan tanda tangan Nama lengkap dan tanda tangan


Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

PERCOBAAN I
TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA
Sterilisasi Bahan Media dan Larutan Pengencer
Cara sterilisasi bahan yang digunakan selama praktikum umumnya
menggunakan metode Sterilisasi Uap memakai Autoklaf. Bahan yang digunakan untuk
keseluruhan praktikum umumnya menggunakan media mikrobiologi. Cara sterilisasi
dan pembuatan media mikrobiologi diambil dari prosedur literatur ataupun pada label
kemasan media yang dipakai karena setiap pabrik yang memproduksi media
mikrobiologi mempunyai formula masing-masing yang harus dipatuhi setiap peneliti
atau penggunaan media mikrobiologi tersebut. Proses sterilisasi uap menggunakan
Autoklaf untuk media mikrobiologi dan larutan pengencer bila tidak dinyatakan lain
umumnya beriangsung selama 15 menit pada suhu 121°C.
Alat-Alat
Alat-Alat Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah Batang
pengaduk, Beaker Glas, Botol Akuades, Botol Semprot, Erlenmeyer, Gelas Ukur,
Kompor Gas, Lampu Bunsen, Lemari Pendingin dilengkapi freezer, Autoklaf, Rak
Tabung Reaksi, Tabung reaksi, Timbangan Digital.

sejenisnya.
Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah akuades steril, etanol
70%, seluruh media yang digunakan selama praktikum, spiritus KOH.
Cara Kerja
1. Dilakukan pembuatan media dan larutan pengencer mikrobiologi sesuai dengan
literatur atau pada label kemasan media dan larutan pengencer mikrobiologi
2. Dilakukan sterilisasi yang tepat sesuai dengan literatur atau pada label kemasan
media dan larutan pengencer mikrobiologi.
3. Dilakukan pembuatan agar miring dan agar tegak.
Bahan-bahan yang disterilisasi

Bahan-bahan yang disterilisasi adalah akuades, larutan pengencer

mikrobiologi, dan media mikrobiologi.
1. Mengapa bahan-bahan mikrobiologi harus disterilkan?

. .
. .
. .
2. Dapatkah media mikrobiologi disterilkan dioven? Berikan penjelasan yang
tepat!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan pengertian dan fungsi media pertumbuhan?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Sebutkan 5 media agar dan 5 media cair!
. .
. .
. .
. .
. .
5. Jelaskan cara pembuatan media Nutrient Agar, Nutrient Broth dan Larutan
Natrium Klorida 0,9% serta fungsinya masing-masing!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

No. Nama Bahan Formula Metode sterilisasi Suhu dan Waktu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1. Bagaimana membuat media agar miring dan agar tegak?
.
.
2. Kapan digunakan agar miring dan agar tegak?
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )

10 | B U K U P E N U N T U N D A N L A P O R A N P R A K T I K U M
PERCOBAAN II
TEKNIK INOKULASI
Berdasarkan bentuk media:
Inokulasi aerob (Agar miring)
Inokulasi anaerob (Agar tegak)
Sumber Buku: Buku Bibiana W. Lay, serta buku mikrobiologi yang mendukung
lainnya.
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik

penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
l. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar
tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam laboratorium
pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam scbuah
kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui
suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.
2. Pemindahan dengan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum, misalnya pada penyelidikan
diambil l ml contoh, lalu diencerkan dengan akuades sebanyak 9 ml murni.
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi
Kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikel, ujungnya boleh lurus juga
boleh berupa kolongan yang diameternya 1-3 mm. Dalam melakukan penanaman
bakteri, kawat ini terlebih dahulu dipijarkan pada api bunsen.
Metode Inokulasi Mikroba

Ada beberapa teknik menggores yang biasa digunakan :
1. Metode Gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan
}ang sempuma akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di
permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup
inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah
sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium
pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang
paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing
laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin
pada lempeng medium pembiakan. Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni:
goresan T, goresan radian, goresan kuadran dan goresan sinambung.
2. Metode tebar
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan
petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu
disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan
pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran baktcri yang merata dengan baik.
Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.
3. Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan
pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat
hanya ditemukan satu sel di dalam tabung.
4. Metode tusuk
Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum
ose yang didalamnya terdapat inokolum kemudian dimasukkan kc dalam media.
Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri

Pengenceran suspensi bakteri dari sampel sumber isolat dari lingkungan dilakukan
sebagai upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang dapat
terhitung. Seperti yang telah diketahui bahwa dalam sampel lingkungan komunitas
bakteri berada dalam kuantitas yang sangat melimpah. Selain mendapatkan kuantitas
yang dapat terhitung, pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari
alam juga diperlukan dalam rangka memudahkan dalam pengamatan koloni, terutama
dalam kegiatan betahap pemurnian isolat (sub-kultur). Koloni yang tumbuh terpisah
dalam kuantitas yang dapat dihitung memudahkan peneliti untuk memilih koloni yang
akan dipisahkan (disub-kultur). Pengenceran suspensi bakteri dari sampel / sumber
isolat dari lingkungan pada umumnya dilakukan dengan teknik pengenceran berseri
(series of dilution).
Cara Kerja :
1. Masukkan Nutrient Broth (NB) ke dalam masing-masing tabung reaksi dengan
ketentuan sebagai berikut : satu tabung pertama diisi dengan 10 mL Nutrient
Broth dan enam tabung berikutnya masing-masing diisi dengan 9 ml Nutrient
Broth
2. Sterilisasi Seri Tabung pengenceran di atas beserta Mortar Keramik dan
Penumbuknya serta Pipet Volumetrik ke dalam Autoclave
3. Gerus sampel di alas Mortar Keramik steril.
4. Timbang l (satu) gram sampel (di atas alumumium foil) kemudian masukkan
ke dalam tabung I vortex sebentar agar suspense homogen;
5. Ambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I dengan menggunakan Pipet
Volumetrik steril, kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex sebentar agar
suspensi homogeny
6. Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV, V, VI, dan VII.
Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah:

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose berbentuk batang. Hifa yang
berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose dan mudah sekali
tumbuh di dalam suatu media.
2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose
yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif
banyak.
Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah beaker glas, botol akuades,
botol semprot, cawan petri, gelas ukur, inkubator suhu 350C dan 250C, kompor gas,
lampu bunsen, ose, autoklaf, rak tabung reaksi, tabung reaksi.

sejenisnya.
Bahan-Bahan:
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan adalah akuades, biakan murni
bakteri, biakan murni jamur, etanol 70%, media nutrient agar (NA), media nutrient
broth (NB), media potato dextrose agar (PDA), peptone dillution fluid (PDF)/ pepton
water, Spiritus KOH.
1. Jelaskan perbedaan inokulasi dan isolasi bakteri!

. .
. .
. .
. .
. .
. .
2. Jelaskan metode-metode inokulasi!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan karakteristik pertumbuhan mikroba dalam media padat dan media
cair?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

Hasil dan Pengamatan Inokulasi
No. Metode Jenis media yang Jenis biakan yang Adanya koloni
Inokulasi digunakan digunakan spesifik
1
2
3
4
5
Hasil dan Pengamatan Suspensi Bakteri dan Jamur
No. Konsentrasi Jenis media Jenis biakan Pengamatan
Pengenceran Bakteri yang yang digunakan
(Formula) digunakan
1
2
3
No. Konsentrasi Jenis media Jenis biakan Pengamatan
Pengenceran Jamur yang yang digunakan
(Formula) digunakan
1
2
3
1. Mengapa Bakteri dapat tumbuh pada media yang digunakan?
.
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN IV
Pengecatan Gram dan Pemeriksaan Jamur
Pengecatan Gram
Tujuan Praktikum :
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa memiliki keterampilan untuk :
1. Melakukan pengecatan Gram
2. Mengidentifikasi morfologi bakteri Gram positif
Prinsip
Daya ikat dari sifat dinding sel dan membran luar dari suatu bakteri gram (+)
dan gram (-) terhadap larutan zatr warna yang disebabkan sifat kepolarannya.
Cara Kerja :
1. Objek glass dicuci alkohol 70% lalu difiksasi.
2. Satu tetes akuades steril diteteskan pada objek glass lalu kedalamnya
dimasukkan satu ose biakan murni kemudian dihomogenkan, lalu dikeringkan
dengan fiksasi
3. Ditambahkan satu tetes larutan gentian violet lalu ditambahkan satu tetes
larutan lugol, diratakan lalu dikeringkan dengan cara fiksasi.
4. Dicuci objek glass dengan alkohol 70 % sampai tetesan terakhir tidak
berwama, kemudian dikeringkan.
5. Diteteskan satu tetes safranin, dibiarkan 15-30 detik, dicuci larutan safranin
dengan akuades steril, kemudian dikeringkan.
6. Diteteskan 1-2 tetes minyak imersi (Imersi Oil).
7. Dilihat pada mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x.
8. Diamati dengan melihat wama dan bentuk bakteri.
9. Ditentukan jenis bakteri berdasarkan pewamaan gram yang diamati.
Ketentuan : Bakteri gram (+) berwama ungu/violet.
Bakteri gram (-) berwarna merah jambu/pink
Pemeriksaan Jamur
Tujuan Praktikum :
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa memiliki keterampilan untuk melihat
morfologi jamur secara mikroskopik
Cara Kerja :
1. Gelas objek yang dicuci dengan alkohol 70% kemudian difiksasi dengan cara
dipanaskan di api bunsen
2. Diteteskan satu tetes aquades steril
3. Diambil inokulum jamur dengan menggunakan jarum ose dan diletakkan diatas
gelas objek lalu dihomogenkan
4. Dikeringkan dengan cara fiksasi
5. Ditambahkan satu sampai dua tetes minyak imersi
6. Diamati dibawah mikroskop
Alat-Alat
Gelas objek, jarum ose, bunsen, botol air suling, pinset, dan mikroskop.
Bahan
Biakan bakteri gram positif , alkohol, gentian violet, lugol, safranin, air suling dan
minyak imersi.
Pertanyaan Penuntun (wajib diisi sebelum praktikum) :

1. Jelaskan morfologi bakteri Gram Positif ?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
2. Apa tujuan fiksasi dan bagaimana cara melakukannya ?
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan fungsi penambahan reagensia pada percobaan ini ?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan guna alkohol 70% dan jelaskan cara pembuatan alkohol 70% ?
. .
. .
. .
. .
5. Bagaimana bentuk morfologi jamur ?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
6. Jelaskan fase hidup dari jamur mikroskopik dan makroskopik ?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

Hasil dan Pengamatan Pengecatan Gram
No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan
Hasil dan Pengamatan Jamur
No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan

1. Apa perbedaan mendasar antara bakteri Gram + dengan bakteri Gram – serta
dengan Jamur, jelaskan!
.
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
Percobaan V
Penetapan Angka Lempeng Total
Angka Lempeng Total (ALT)
Uji Angka Lempeng Total (ALT) dilakukan untuk menentukan jumlah atau
angka bakteri aerob mesofil yang mungkin mencemari suatu produk, baik itu makanan-
minuman, obat tradisional ataupun kosmetika. Media yang digunakan untuk uji ALT
adalah PCA (Plate Count Agar). Masa inkubasi dilakukan dengan membalik cawan
petri yang berisi biakan. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari jatuhnya butir air
hasil pengembunan disebabkan suhu inkubator. Apabila sampai terdapat air yang
jatuhmaka akan merusak pembacaan angka lempeng total dari sampel yang diuji. Cara
inokulasi yang dipilih adalah cara tuang, dimana hal ini dimaksudkan untuk melihat
pertumbuhan baketri aerob mesofil, yang membutuhkan oksigen dalam
pertumbuhannya, sehingga akan teramati bahwa pertumbuhan bakteri aerob mesofil
tersebut akan berada dipermukaan lempeng agar. Untuk sampel makanan-minuman,
obat tradisional, dan kosmetik yang diduga menggunakan pengawet digunakan
pengencer yaitu Letheen Broth (LB) yang dapat menginaktivasi pengawet dalam
sampel karena mengandung lesitin 0,5% yang berfungsi sebagai inaktivator, sehingga
hasil pengujian yang negatif dari sampel benar-benar menunjukkan hasil yang negatif
bukan karena aktifitas dari pengawet. Sedangkan untuk sampel tanpa pengawet,
pengenceran dilakukan dengan menggunakan Pepton Dilution Fluid (PDF).
Pada pengujian angka kapang/khamir digunakan pengencer PDF yang

mengandung nutrisi pepton yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir serta
menggunakan media Potato Dextrose Agar (PDA) yang merupakan media padat (agar)
dengan kandungan nutrisi karbohidrat (dekstrosa) yang baik untuk pertumbuhan
kapang dan khamir. Inkubasi sampel dilakukan pada suhu 20-25°C yang merupakan
suhu optimum untuk pertumbuhan kapang dan khamir. Inkubasi sampel tidak boleh
diposisikan terbalik karena kapang/khamir akan tumbuh dan memiliki spora yang terus
dan berkembangbiak, jika posisi cawan dibalik maka spora fungi tersebut akan
bertebaran dan tumbuh dimana-mana pada media agar, sehingga jumlah koloni mfungi
yang tumbuh akan semakin banyak dari jumlah koloni sebenarnya, hal ini dapat
menyebabkan kesalahan perhitungan koloni kapang/khamir. Pada media PDA
ditambahkan klorampenikol sebanyak 10mg/100ml dengan tujuan untuk menghambat
pertumbuhan bakteri sehingga yang akan tumbuh pada media tersebut hanya kapang
dan khamir.
Cawan yang dipilih untuk perhitungan koloni adalah yang mengandung antara
30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan mengandung
koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan
pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor
pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Tabel Pengamatan
Pengenceran Cawan I Cawan II Keterangan
10-2 150 300 Dipilih koloni cawan I
10-3 20 25 Dipilih koloni cawan II
Perhitungan:
Kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 25-250 koloni
percawan. dalam perhitungan percobaan ini, lihat kembali bahan kuliah anda!
 Jumlah koloni rata-rata = jumlah kedua cawan dikalikan dengan faktor

pengencerannya
 Maka Angka Lempeng Total adalah : 150+250 x 102= 200 x 102
2
Prinsip Percobaan
Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil dan jamur setelah cuplikan

diinokulasi pada media agar lempeng dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang
sesuai
Tujuan Percobaan
Untuk menghitung angka lempeng total bakteri dan jamur
Media dan pengencer

Plate Count Agar (PCA)
Pepton Dilution Fluid (PDF)
Pereaksi
1% Triphenyltertrazolium Chloride (TTC)
Prosedur
Dengan cara aseptikm dipipet 10ml sampel kedalam kantong stomaker steril yang
sesuai. Ditambhakan 90ml PDF, dihomogenkan selama 30 detik hingg terbentuk
suspensi 10-1. Disiapkan 5 buah tabung reaksi steril yang masing-masing telah diisi
dengan 9ml PDF, dihomogenkan hingga diperoleh suspensi homogen pengenceran 10-
2
. Lalu selanjutnya hingga pengenceran 10-6. Setiap pengenceran dipipet 1ml kedalam
cawan petri steril dan dibuat duplo. Kedalam tiap cawan petri dituang 15-20 ml media
PCA. Cawan petri diputar dan digoyang sedemikian rupa sehingga suspensi tersebar
merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan larutan pengencer dibuat uji blanko.
Setelah media memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35°C-37°C selama 24-48 jam
dalam posisi dibalik. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung
Interpretasi
1. Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkanjumlahkoloniantara 30
-300. Jumlahkoloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu dikalikan dengan
faktorpengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap
mL contoh.
2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau 300. Hitung
jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil
dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap mL contoh.
3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingka tpengenceran yang berurutan

menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, maka hitung jumlah koloni dari masing –
masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya.
Apabila hasi lperhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni
rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni rata-rata dari pengenceran
dibawahnya, maka angka lempeng total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih
rendah (missal pada pengenceran 10-2 jumlahkoloni rata-rata 140, pada
pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140 x
102).
4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah
koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di
bawahnya, maka angka lempeng total dihitung dari rata-rata jumlah koloni kedua
tingkat pengenceran tersebut. Misal, pada pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-
rata 293, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41, maka angka lempeng
total adalah:
293 + 41
𝑥 103 = 167 𝑥 102
2
5. Bila tidak ada satu pun koloni tumbuh dalam cawan, maka angka lempeng total
dinyatakan sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
6. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan dari
tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi menjadi beberapa sector
(2,4 atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sector, angka lempeng total adalah
jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sector, kemudian dihitung rata-rata dari
kedua cawan dan dikalikan dengan factor pengenceran.
7. Jika jumlah koloni rata-rata dari ¼ bagian cawan lebih dari 200, maka angka
lempeng total dinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan dengan factor
pengenceran.
8. Perhitungan dan pencatatan hasil angka lempeng total hanya ditulis dalam dua
angka. Angka berikutnya dibulatkan kebawah bila kurang dari lima dan dibulatkan
keatas bila lebih dari lima. Sebagai contoh 523 x 103dibulatkan menjadi 52 x 104,
sedangkan 83,6 x 103dibulatkan menjadi 84 x 103.
9. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian

cawan, maka diitung koloni yang tumbuh di luar daerah “spreader”. Jika 75% dari
seluruh cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keadaan di atas, maka dicatat
sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki
carakerjanya (pengujianulang).
10. Jika dijumpai “spreader” tipe rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah
dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok “spreader” terdiri dari
beberapa rantai dihitung sebagai satu kolon
1. Jelaskan Pengertian Angka Lempeng Total ?
. .
. .
. .
. .
. .
2. Mengapa cawan petri diletakan posisi terbalik saat diinkubasi?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Mengapa dipilih lempeng dengan julah koloni 30-300 ?
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan koloni “spreader”!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

Hasil dan Pengamatan Pengecatan Gram
No. Data Sampel Pengamatan Perhitungan Kesimpulan
Nama Sampel :
Tempat pengambilan
sampel:

1. Sebutkan sebab-sebab terjadinya koloni “spreader” ?
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN VI
UJI ANGKA PALING MUNGKIN (MPN) Bakteri Koliform)
Teori
Teknik Most Probable Number (MPN) merupakann metode untuk

memperkirakan populasi mikroorganisme terutama pada situasi dimana
mikroorganisme ada dalam jumlah yang sangat sedikit. Pengujian MPN Coliform dan
E. Coli menggunakan media Mac Conkey Broth (MCB) dan tabung durham. MCB
merupakan media perbenihan selektif yang mengandung garam empedu sebagai
penghambat bakteri bukan coliform. Tabung durham digunakan untuk mengetahui
adanya pembentukan gas oleh bakteri yang terdapat dalam sampel tersebut.
Terbentuknya gas dan asam menandakan adanya E.coli dan Coliform. Jika hanya ada
gas menandakan adanya coliformn tanpa ada e.coli. Terbentuknya asam ditandai
dengan perubahan warna biakan menjadi kuning.Tahap ini merupakan uji presumtif.
Sampel yang menunjukkan uji presumtif positif dilanjutkan ke uji konfirmasi.

Uji konfirmasi coliform menggunakan media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB)
dengan melihat terbentuknya gas dalam tabung durham. Uji konfirmasi e.coli
dilanjutkan dengan media ECB (E.Coli Broth) dan diinkubasi pada suhu optimumnya
yakni 44°C. Uji konfirmasi dinyatakan positif bila terbentuknya gas dalam tabung
durham, kemudian dilanjutkan dengan metode gores kemedia EMBA (Eosin Metylen
Blue Agar) yang merupakan media diferensial untuk e.coli. Koloni spesifik tumbuh
dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3mm, warna hijau dengan kilap logam dan
bintik biru kehijauan di tengahnya. Satu koloni spesiifk yang terpisah diinokulasikan
pada media NA miring untuk memperbanyak biakan koloni. Kemudian dilanjutkan
dengan uji biokimia yang terdiri dari uji indol, uji merah metil, uji sitrat.
Prinsip
Pertumbuhan bakteri koliform setelah cuplikan diinokulasi pada media cair yang
sesuai, dengan mengamati adanya reaksi fermentasi cara pembentukan gas didalm
tabung durham.
Pereaksi Khusus
Media dan pengencer
Mac Conkey Broth (MCB)
Brilian Green Lactose Broth (BGLB)
Peralatan Khusus
Tabung reaksi dilengkapi tabung durham
Prosedur
Dengan cara aseptik diitimbang 25 cuplikan kedalam kantong stomaker steril.

Ditambahkan 225 ml PDF dan dikocok homogen hingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 10-1 disiapkan 2 tabung reaksi, masing-masing-masing berisi 9ml PDF.
Diambil 1ml dari pengenceran pertama lalu dipindahkan ke tabung kedua hingga
didapatkan pengenveran 10-2. Dilakukan hingga 10-3.
Uji presumtif
Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi berisi 9ml MCB yang dilengkapi
tabung durham. Kedalam tiap tabung dari masing-masing seri dimasukkan 1 ml
suspensi pengenceran. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.
Setelah 24 jam dicatat dan diamati adanya gas yang terbentuk dalam tabung Durham
pada tiap tabung. Kemudiaan inkubasi dilanjutkan hingga 48 jam dan dicatat tabung-
tabung yang menunjukkan gas positif
Uji konfirmasi
Biakan dari tabung yang menunjukkan uji presumtif positif dipindahkan 1 sengkelit ke
dalam tabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dilengkapi dengan tabung durham.
Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Dilakukan pengamatan
terhadap pembentukan gas.
Pernyataan hasil
Jumlah tabung yang positif gas dari uji konfimasi dicatat dan dirujuk ke tabel MPN.
Angka yang diperoleh pada tabel MPN menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap
gram atau tiap ml contoh yang diuji
Tabel MPN ( Cara 3 Tabung )

Indeks MPN dan batas kepercayaan 95% bila digunakan 3 tabung
MPN per Batas
Jumlah Tabung Positif 95%
g/ml Kepercayaan
1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi
0 0 0 <3 -- --
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 >2400 -- --
Catatan :
Bila seri pengenceran yang digunakan melebihi dari yang tertera pada tabel, maka hasil
yang diperoleh dari tabel dikalikan faktor 10,100,1000 dan sebagainya. Misal: Bila
yang dipilih adalah dari pengenceran 10−2,10−3 , 10−4, maka hasilnya dikalikan
dengan 10, bila yang dipilih adalah pengenceran 10−3, 10−4, dan 10−5 maka hasil,
dikalikan dengan 100.

1. Sampel apa yang dapat diuji untuk melakukan uji angka paling mungkin ?
. .
. .
. .
. .
. .
2. Sebutkan media selektif yang digunakan pada pengujian angka paling
mungkin?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji presumtif !
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji konfirmasi!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

Pengamatan dan
No. Data Sampel Kesimpulan
Perhitungan
1
Nama Sampel :
Tempat pengambilan
sampel:

1. Mengapa terjadi perubahan warna dan pembentukan gelembung pada hasil
yang positif mengandung bakteri coliform ?
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN VII
Uji Biokimia terhadap Bakteri Salmonella
Uji Salmonella dalam sampel
Prinsip
Pemilihan Salmonella pada media pengkaya non selektif, dilanjutkan dengan
inokulasi pada media pengkaya selektif dan diinkubasi pada 43̊C, kemudian
dilakukan identifikasi terhadap koloni spesifik dari media selektif. Salmonella
dapat mereduksi bismuth, tidak memfermentasi laktosa, tetapi dapat menghasilkan
asam dari glukosa dan sukrosa serta dekarboksilasi lisin dan bersifat antigenik.
Pereaksi khusus
Media
Lactose Broth (LB)
Tetrathionate Brilliant Green Broth (TBGB)
Selenite Cystein Broth (SCB)
Brilliant Green Agar (BGA)
Bismuth Sulfite Agar (BSA)
Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
Lysine Iron Agar (LIA)
Nutrient Agar (NA)
Pereaksi
Larutan Natrium Klorida 0.85%
Salmonella antisera polivalen O
Peralatan Khusus
Stomaker
Prosedur
Pra-pengkayaan
Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong stomaker kering,
ditimbang 225 ml PDF. Dihomogenkan menggunakan stomaker selama 30 detik
kemudian dipipet 10 ml ke dalam 90 ml LB, diinkubasi pada suhu 35-37̊C selama
18-24 jam.
Pengkayaan
Dengan cara aseptik dipipet biakan pra-pengkayaan masing-masing 10 ml ke dalam
100 ml media TBGB dan 100 ml SCB. Kemudian keduanya diinkubasi pada 43̊C
selama 24 jam.
Isolasi
Dari biakan TBGB dan SCB diinokulasi masing-masing 1 sengkelit pada
permukaan BGA dan BSA, kemudian diinkubasi pada suhu 35̊-37̊ selama 24-48
jam, koloni yang tumbuh diaamati. Biakan diduga Salmonella positif jika :
Pada BGA: koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah, dari translusen
hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.
Pada BSA: koloni berwarna coklat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang
dengan kilap logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula coklat,jika masa
inkubasi ditambah warna koloni menjadi hitam.
Identifikasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan BSA, diinokulasi pada media
NA, TSIA dan LIA dengan cara tusukan dan goresan. Diinkubasi pada 35̊-37̊
selama 24 jam. Biakan diduga Salmonella positif jika :
Pada TSIA: terlihat warna merah pada permukaan miring,warna kuning pada
biakan di dasar tabung atau tanpa pembentukan hydrogen sulphide (hitam).
Pada LIA: terlihat warna ungu lebih tua, di seluruh biakan.
Uji Serologi
Diambil 1 sengkelit biakan dari biakan NA miring dan disuspensikan
dengan 1 tetes larutan NaCl 0,85% pada kaca objek. Jika terjadi segera aglutinasi,
suspens tersebut tidak dapat dipakai untuk uji serologi. Jika tidak terjadi aglutinasi
spontan, diteteskan antisera Salmonella polivalen O pada suspensi. Kemudian
dihomogenkan dengan cara menggoyangkaca objek atau menggunakan sengkelit.
Diamati selama 1 menit jika terjadi aglutinasi berarti Salmonella positif.

1. Sampel apa yang dapat diuji untuk melakukan uji angka paling mungkin ?
. .
. .
. .
. .
. .
2. Sebutkan media selektif yang digunakan pada pengujian angka paling
mungkin?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji presumtif !
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji konfirmasi!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .

No. Perlakuan Pengamatan Kesimpulan

Jelaskan perubahan warna yang terjadi pada setiap media selktif dan jelaskan
mengaja demikian!
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN VIII
Uji Angka Fenol
Prinsip
Membandingkan daya bunuh desinfektan dengan daya bunuh fenol baku
terhadap bakteri uji yang sama pada situasi dan kondisi yang sama dalam jangka
waktu kontak 10 menit dan tidak membunuh dalam waktu kontak 5 menit.
Tujuan Percobaan
Mengevaluasi daya anti mikroba suatu desinfektan, dengan memperkirakan
potensi dan efektifitas desinfektan berdasarkan konsentrasi dan lamanya kontak
terhadap kuman dan membandingkannya terhadap fenol standard yang disebut
koefisien fenol.
Teori
Bahan anti mikroba yang ditemukan memiliki keefektifan yang bermacam-
macam, dan penggunaannya pun ditujukan terhadap hal-hal yang berbeda-beda
pula. Salah satu jenis anti mikroba dikenal sebagai desinfektan, merupakan suatu
zat (biasanya kimia) yang dipakai untuk maksud desinfeksi pada bahan-bahan tidak
bernyawa.
Fenol adalah salah satu contoh desinfektan yang efektif dalam membunuh
kuman. Pada konsentrasi rendah, daya bunuhnya disebabkan karena fenol
mempresipitasikan protein secara aktif, dan selain itu juga merusak membran sel
dengan menurunkan tegangan permukaannya. Dengan persetujuan para ahli dan
peneliti, fenol dijadikan standar pembanding untuk menentukan aktivitas sesuatu
desinfektan.
Zat-zat antimikroba yang dipergunakan untuk disinfeksi harus diuji
keefektifannya. Cara menentukan daya sterilisasi zat-zat tersebut adalah dengan
melakukan tes koefisien fenol. Uji ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas
suatu produk (desinfektan) dengan daya bunuh fenol dalam kondisi tes yang sama.
Berbagai pengenceran fenol dan produk yang dicoba dicampur dengan suatu
volume tertentu biakan Salmonella thyposa atau Staphylococcus aureus.
Pereaksi Khusus
Media
Nutrient Broth (NB)
Nutrient Agar (NA)
Peralatan Khusus
Tabung reaksi berbibir ukuran (20x150) mm dan (25x250) mm
Sengkelit platina diameter mata 4 mm
Prosedur
Persiapan media
Media Nutrient Broth (NB) dibuat dengan melarutkan 10 gram Bacto Pepton, 5
gram Beef Extract, 5 gram NaCl dalam 1 liter air suling, dicampur homogeny dan
pH dibuat 6,8. Media dibuat dalam tabung reaksi ukuran 20x150 mm dengan
volume 10 ml tiap tabung. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada 121̊C selama
15 menit.
Persiapan bakteri uji
Digunakan bakteri Salmonella typhi ATCC 6539 pada media NA yang telah
diinkubasi 48 jam pada suhu 35-37̊ . dari biakan NA miring diinokulasi 1 sengkelit
dalam media NB dan diinkubasi pada suhu 35-37̊ selama 24 jam. Bakteri uji yang
digunakan untuk uji koefisien fenol adalah biakan berusia 24 jam dan telah
mengalami peremajaan selama 3 kali dalam 3 hari berturut-turut, batas maksimum
peremajaan adalah 30 kali.
Persiapan larutan fenol baku
Ditimbang 50 gram kristal fenol dalam gelas piala dilarutkan dengan air suling
hingga 1 liter dan dijadikan sebagai larutan A. kadar fenol dari larutan dibakukan
dengan 0,1 N KBr-KBrO₃ dengan cara sebagai berikut: dipipet 25 ml larutan A
ditambah air suling hingga 500 ml, dicampur homogeny sebagai larutan B. dipipet
15 ml larutan B dalam Erlenmeyer bertutup ditambah 30 ml baku KBr-KBrO₃
ditambah 5 ml HCl 0,1N segera ditutup, kemudian dikocok teratur selama 30 menit
dan didiamkan selama 15 menit. Tutup Erlenmeyer dibuka sedikit, ditambahkan
dengan cepat 5 ml larutan 20% KI, usahakan tidak ada uap Br yang keluar dan
segera ditutup rapat. Dikocok seksama, tutup Erlenmeyer dibuka sedikit dan
dibagian leher dibilas sedikit dengan air suling, dijadikan sebagai larutan C yang
dititrasi dengan 0,1 N Na₂S₂O₃.
1 ml 0,1 N KBr-KBrO₃ = 0,001569 gram fenol
Cara perhitungan kadar fenol :
% fenol dalam larutan sediaan baku:
(30 - ml Na₂S₂O₃) x 0,001569 x 1333 x 100/1000
30 : volume larutan 0,1 N KBr-KBrO₃ yang ditambahkan
0,001569 : gram fenol ekivalen terhadap 1 ml 0,1 N KBr-KBrO₃
1333 : faktor pengenceran
1000 : volume larutan sediaan fenol baku
Larutan baku ini harus disimpan rapat dalam tempat yang sejuk dan terhindar dari
cahaya .
Setelah diperoleh kadar fenol yang sebenarnya maka dibuat larutan baku fenol 5%
sebagai berikut :
Ditimbang seberat 5% kristal fenol baku sesuai kadarnya dalam 100 ml air suling
steril, dikocok homogen. Dibuat pengenceran 1:80, 1:90, 1:100 di dalam tabung
steril ukuran (25x150) mm masing-masing 5 ml.
Persiapan larutan desinfektan uji
Dibuat larutan desinfektan yang diencerkan sesuai dengan yang tertera pada etiket
kemasan atau dibuat sedemikian rupa sehingga berada pada kisaran pengenceran
dengan daya bunuh terhadap bakteri uji dalam waktu kontak 5-15 menit .
Pengenceran dibuat dalam tabung reaksi ukuran (25x150) mm dengan volume
masing-masing 5 ml. Untuk larutan desinfektan uji dibuat 7 tingkat pengenceran.
Inokulasi
Disiapkan rak tabung reaksi sesuai ukuran tabung dengan kapasitas 40 dalam 4
deretan. Deretan pertama untuk tabung fenol baku dan desinfektan. Deret ke 2,3,4
untuk tabung media NB untuk waktu kontak 5,10, dan 15 menit. Semua tabung dan
biakan bakteri uji dimasukkan dalam tangas air suhu 20̊ dan dibiarkan selama 5
menit. Ke dalam tiap tabung pengenceran fenol baku dan desinfektan dimasukkan
0,5 ml suspense bakteri uji yang telah dikocok homogen. Waktu memasukkan
bakteri uji pada tabung pengenceran pertama dicatat sebagai 0 menit. Interval waktu
inokulasi antar tabung adalah 30 detik,sehingga untuk 10 tabung dapat Diselesaikan
selama 4,5 menit , setiap kali inokulasi diusahakan ujung pipet mendekati
permukaan cairan dan tidak menyentuh dinding tabung.Lima menit setelah bakteri
uji diinokulasikan pada tabung pertama segera dikocok , tabung dipegang dalam
posisi miring ±60 didekatkan nyala api , tangan kanan memegang sengkelit platina.
Dengan cara aseptic pindahkan satu sengkelit suspensi kedalam media NB deret ke
2 satu persatu dengan selang waktu 30 detik sampai tabung ke 10. Sepuluh menit
setelah bakteri uji diinokulasikan pada tabung pengenceran pertama setelah dikocok
, pindahkan 1 sengkelit suspensi dalam media NB deret 3 sama seperti di atas. Lima
belas menit setelah bakteri uji diinokulasikan pada tabung pengenceran pertama
setelah dikocok , pindahkan 1 sengkelit suspense kedalam media NB deret ke 4.
Semua tabung yang telah diinokulasikan dikocok homogeny kenudian diinkubasi
pada suhu 35-37 0c selama 48 jam dan diamati adanya pertumbuhan bakteri pada
setiap tabung. Jika ada pertumbuhan yang masih meragukan maka dapat dilakukan
konfirmasi dengan uji serologi.
Perhitungan
Koefisien fenol adalah hasil bagi dari factor pengenceran tertinggi desinfektan
dengan factor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat
membunuh bakteri uji dalam masa kontak 10 menit tetapi tidak dalam masa kontak
5 menit (lihat table 1 dan 2)
Tabel 1
Contoh hasil pengamatan baku fenol
Baku Lama kontak
Pengenceran 5 menit 10 menit 15 menit
1:80 0 0 0
1:90 + 0 0
1:100 + + +
Tabel 2
Contoh hasil pengamatan desinfektan
Desinfektan x Lama kontak
Pengenceran 5 menit 10 menit 15 menit
1:100 0 0 0
1:150 0 0 0
1:200 0 0 0
1:250 + 0 0
1:300 + + 0
1:350 + + +
1:400 + + +
Koefisien fenol = 250/90 = 2,77 (2,8)
Pengujian dianggap memuaskan jika baku fenol memberikan hasil seperti pada
tabel 3,
Tabel 3
Tabel hasil uji baku fenol yang memenuhi syarat
Pengenceran Lama kontak
5 menit 10 menit 15 menit
1:80 +/0 0 0
1:90 +/0 +/0 0
1:100 + + +/0
Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenolyang diuji tidak ada satupun
tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5 menit dan
memberikan hasil pertumbuhan negative dalam masa kontak 10 menit,maka
diperkirakan bahwa pengenceran yang diharapkan berada di antara pengenceran
kedua (1:90) dan pengenceran ketiga ( 1:100) Lihat table 4 dan 5.
Tabel 4
Contoh hasil perkiraan uji baku fenol
1:80 0 0 0
1:90 0 0 0
1:100 + + 0
Tabel 5
Contoh hasil perkiraan uji desinfektan
1:80 0 0 0
1:90 0 0 0
1:100 + + 0
Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 0-100, untuk desinfektan antara 50-
400 koefisien fenol = 375/95 = 3,95

1. Jelaskan perbedaan desinfektan, aseptic dan sanitaizer!
. .
. .
. .
. .
. .
2. Mengapa pada uji koefisien fenol digunakan senyawa fenol sebagai
baku/pembanding?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Mengapa digunakan bakteri salmonella typhi pada pengujian koefisien fenol?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan kelemahan pengujian desinfektan dengan menggunakan metode
koefisien fenol!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .


1. Jelaskan metode-metode yang digunakan untuk pengujian desinfektan?
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN IX
Uji sterilitas
Prinsip
Pertumbuhan jasad renik pada media tertentu yang diinokulasikan dan diinkubasi
pada suhu yang sesuai.
Pereaksi khusus
Media
Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
Tryptic Soy Broth (TSB)
Peralatan Khusus
Laminar Airflow Cabinet (Lemari Aseptik), Pipet Kamagome Atau Alat Suntik
PROSEDUR
Uji Fertilitas Media
disiapkan 4 tabung berisi 15 FTM dan 2 tabung berisi 15 ml TSB . Ke dalam 2
tabung FTM diinokulasi masing-masing 0,1 ml suspensi Bacillus Substilis ATCC
6633 (1000 spora hidup per ml), ke dalam 2 tabung FTM lainnya 0,1 ml suspensi
Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml). Kedalam 2 tabung TSB
masing-masing diinokulasi 0,1 suspensi Candida Albicans NIHJ (1000 sel hidup
per ml). Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas contoh tabung-
tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 35 0-370 c dan tsb pada suhu 20-250 c
selama tidak kurang dari 7 hari.
Uji Efektivitas Media
Sebanyak 4 tabung berisi masing-masing 15 ml FTM dan 2 tabung berisi 15 ml
TSB diinokulasikan 1 ml contoh ke dalam semua tabung.pada 2 tabung FTM
diinokulasikan masing-masing 0,1 ml suspense Bascillus Susbtilis ATCC 6633
(1000 spora hidup per ml ), ke dalam 2 tabung FTM lainnya 0,1ml suspensi
Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml) ke dalam 2 tabung TSB
masing-masing diinokulasi 0,1 ml suspense Candida Albicans NIHJ (1000 sel
hidup per ml). pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas contoh
tabung-tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 350-370 c dan TSB pada suhu 20-
250c selama tidak kurang dari 7 hari.
Uji Sterilitas Media
Sebanyak 2 tabung berisi masing-masing media 15 ml FTM dan 15 ml daei bets
yang sama, diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang
digunakan untuk uji sterilitas.
Cara penetapan
Pengujian dilakukan dalam Laminar Airflow Cabinet yang sebelumnya telah
disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan benzalkonium klorida 0,2 % steril
dan telah dijalankan selama 30-60 menit. Secara aseptic diambil 2 bagian cuplikan
seberat 250-500 mg dari bagian paling dalam contoh atau kseluruhan contoh bila
ukurannya kecil kemudian masing-masing cuplikan dimasukkan kedalam 100 ml
FTM dan 100 ml TSB . Media FTM diinkubasi pada suhu 350-37 0 dan media TSB
20-25 0C selama tidak kurang 14 hari.
Pengamatan dan penafsiran hasil uji
Tahap pertama
Pada interval waktu tertentu dan akhir periode inkubasi, diamati secara
makroskopis dan pertumbuhan jasad renik didalam tabung.Bila tidak ada
pertumbuhan dikatakan bahwa sample memenuhi syarat sterilitas . bila ada
pertumbuhan dan dapat dibuktikan dari pemantauan bahwa pengujian , bahan yang
digunakan pengujian,maka dinyatakan tidak absah dan tahap pertama harus diulang
.Bila ada pertumbuhan dan terbukti pengujian tahap pertama absah, dilakukan tahap
kedua.
Tahap kedua
Jumlah contoh minimum dua kali dari jumlah contoh pada pengujian tahap
pertama.Bila tidak terdapat pertumbuhan jasad renik, maka dinyatakan sampel
memenuhi syarat sterilitas. Bila ada pertumbuhan maka dinyatakan sampel tidak
memenuhi syarat sterilitas kecuali dapat dibuktikan bahwa tahap kedua tidak absah.
Dalam hal ini pengujian tahap kedua dapat diulang dengan contoh dan cara yang
sama.

1. Jelaskan pengertian sterilitas, fetilitas dan efektivitas!
. .
. .
. .
. .
. .
2. Mengapa uji sterilitas perlu dilakukan terhadap sediaan farmasi dan alat
kesehatan steril?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Mengapa digunakan bakteri Bacillus substilis pada pengujian sterilitas?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan tujuan uji sterilitas, uji fertilitas, dan uji efektivitas, serta mengapa
dilakukan uji tersebut!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .


1. Jelaskan metode-metode yang digunakan untuk pengujian sterilitas?
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN X
Uji efektivitas pengawet
Tujuan
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Sarjana (S-1) Farmasi
Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk :
a. Melakukan pengujian efektivitas pengawet ;
b. Menentukan efektivitas pengawet terhadap bakteri uji.
Alat Yang Dibutuhkan

Vortex mixer, cawan petri , alat penghitung koloni dan neraca analitik.
Bahan Yang Digunakan
Triptic Soy, Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), Lactose Broth (LB),biakan
bakteri Staphylococcus Aureus , biakan jamur Candida Albicans
Prosedur
Ditimbang 1 gram atau ambil 1 ml sampel,dimasukkan ke dalam wadah steril.
Ditambahkan 0.1 ml suspensi inokulum bakteri atau jamur dan diencerkan dengan LB
hingga diperoleh pengenceran 10-1-10-6,diambil 1 ml dari setiap pengenceran dan
dipindahkan secara aseptis ke dalam petri (masing-masing duplo), ditambahkan 15 ml
media,dihomogenkan . dibiarkan media memadat, kemudian diinkubasi cawan pada
suhu 35±2 oC ( untuk bakteri) dan 35±2 oC untuk jamur selama 2 hari. Dihitung jumlah
koloni bakteri dan jamur pada hari ke 7,14,21 dan 28.
Suatu pengawet dikatakan efektif jika:
a. a.pada hari ke 14 jumlah koloni tidak lebih dari 0,1%dari jumlah awal.
b. b.selama 14 hari pertama jumlah koloni ragi atau kapang sama dengan atau
kurang dari jumlah awal.
jumlah mikroba uji selama waktu tersisa dari 28 hari tetap atau kurang dari
bilangan yang disebut pada a dan b.

1. Sebutkan 5 macam pengawet alami!
. .
. .
. .
. .
. .
2. Sebutkan 5 Macam Pengawet sintesis!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan syarat keberadaan pengawet dalam suatu sediaan farmasi dan
dalam makanan!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan syarat-syarat pengawet yang efektif!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .


1. Perlukah suatu pengawet ditambahkan pada makanan maupun sediaan
farmasi? Jelaskan pendapatmu!
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN XI
Uji Aktivitas Antimikroba
Prinsip
Uji aktivitas antimikroba dengan melakukan pengujian konsentrasi hambat
minimum (KHM) mikroba berdasarkan metode difusi agar menggunakan pencadang
logam/gelas/kertas, dimana konsentrasi senyawa obat tertentu dimasukkan kedalam
masing-masing pencadang kemudian diukur zona bening disekitar pencadang sampai
diperoleh konsentrasi senyawa obat terkecil yang masih memberikan daya hambat.
Pengujian Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri senyawa obat tertentu (antimikroba) dilakukan
dengan metode difusi agar menggunakan pencadang logam, bakteri yang digunakan
antara lain bakteri Salmonella, B.Subtilis. Staphylococus epidermidis, Klebsiella
pneumonia,M. lutea, P.acne, B.Pumilus, MRSA, Staphylococus aureus, E.coli. Jamur
yang digunakan antara lain Candida albicans, Rhizopus oryzae.
Pengenceran Senyawa Obat (Antimikroba)
Masing-masing bahan obat atau ekstrak bahan alam yang diduga mempunyai
aktivitas antibakteri ditimbang sebanyak 5 g kemudian dilarutkan dalam DMSO
dan/atau fenol (pa) pada labu tentukur 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 500 mg/ml
selanjutnya dibuat pengenceran 400 mg/ml, 300 mg/ml dan seterusnya sampai pada
konsentrasi tertentu yang tidak memberikan daya hambat lagi.
Sterilisasi Alat
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan
terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 170ºC
selama 1-2 jam dan alat-alat jenis lainnya disterilkan di autoklaf pada suhu 121ºC
selama 15 menit, jarum ose dibakar dengan lampu spiritus.
Media
Media yang digunakan:
1. Nutrient Agar (NA)
2. Nutrient Broth (NB)
3. Mueller Hinton Agar (MHA)
Larutan pengencer
1. Dimetil sulfoksida (DMSO)
2. Etanol (pa)
Pembuatan Inokulum
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu
disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth. Diinkubasi
pada waktu beberapa menit pada suhu 35±2ºC. Kemudian diukur kekeruhan larutan
pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25% (Ditjen POM,
1995).
Pengujian Antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml
MHA dicawan petri steril, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media
yang telah padat ditanam cincin pencadang logam/gelas atau kertas (dengan merendam
kertas selama 30 menit pada masing-masing konsentrasi uji), kemudian pada masing-
masing pencadang dimasukkan masing-masing larutan obat sebagai konsentrasi dan
larutan blanko (DMSO atau etanol), Kemudian diinkubasi pada suhu 36-37ºC selama
18-24 jam untuk bakteri dan 22-25ºC selama 36-48 jam untuk jamur. Selanjutnya
masing-masing petri diukur diameter daerah bening disekitar cincin pencadang
menggunakan jangka sorong dengan satuan mm. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali
(Ditjen POM, 1995).

1. Jelaskan prinsip pengujian konsentrasi hambat minimum (KHM) dengan
metode Kirby-Bauer!
. .
. .
. .
. .
. .
2. Jelaskan Mengapa inokulum harus diatur agar menghasilkan transmitan
25% pada panjang gelombang 580nm!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Jelaskan pengertian mikroba susceptible, intermediet, dan resisten terhadap
antibiotik!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
4. Jelaskan Metode-metode uji aktivitas antimikroba lainnya!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .


1. Jelaskan aplikasi uji kepekaan mikroba di bidang farmasi klinis!
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )
PERCOBAAN XII
Uji Potensi Antibiotik
Tujuan
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Sarjana (S-1) Farmasi
Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a. Melakukan pengujian potensi antibiotik dengan metode lempeng silinder
b. Menghitung potensi antibiotik terhadap mikroba
c. Mengevaluasi mutu produk antibiotik berdasarkan monografi uji potensi antibiotik
menurut Farmakope Indonesia Edisi IV.
Alat yang dibutuhkan
Cawan petri, pencadang logam/gelas/kertas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik dan
pipet mikro.
Bahan yang digunakan
Antibiotik uji dan baku (Kloramfenikol dan Tetrasiklin), Nutrient Agar, Air suling,
Natrium Klorida 0,9%, asam klorida 0,1 N, mikroba uji (Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus).
Prosedur
Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Kloramfenikol
Timbang teliti 1 g kloramfenikol baku, larutkan dalam air suling dan cukupkan hingga
100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diencerkan dengan air suling
(Perbandingan 1:1,25)
untuk memperoleh konsentrasi kloramfenikol 1,6;2,0;2,5;3,125 dan 3,906 µg/ml.
S1 (1,6 µg/ml) : ambil 1,600 ml LIB , diencerkan dengan air suling hingga 10 ml.
Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Tetrasiklin
Timbang teliti 1 g tetrasiklin, dilarutkan dalam asam klorida 0,1 N dan dicukupkan
hingga 100 ml (Konsentrasi 10 µg/ml). Diencerkan dengan air suling untuk
memperoleh konsentrasi 0,1536;0,192;0,24;0,30 dan 0,375 µg/ml.
S1 (0,1536 µg/ml) : ambil 0,1536 ml LIB , diencerkan dengan air suling hingga 10
ml.
Penyiapan Larutan Kloramfenikol Uji
Ditimbang sediaan setara dengan 1 g kloramfenikol, dilarutkan dalam air suling dan
dicukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diambil secara
aseptik 2,5 ml larutan dan diencerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk
memperoleh konsentrasi kloramfenikol 2,5 µg/ml.
Penyiapan Larutan Tetrasiklin Uji
Ditimbang sediaan setara dengan 1 g tetrasiklin, dilarutkan dalam asam klorida 0,1 N
dan dicukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diambil
secara aseptik 0,24 ml larutan dan diencerkan dengan asam klorida 0,1 N hingga 10 ml
untuk memperoleh konsentrasi tetrasiklin 0,24 µg/ml.
Penyiapan Inokulum E.coli dan S. aureus
Diambil sengkelit koloni E.coli dan S.aureus masing-masing dari biakan agar yang
telah diinkubasi selama 24 jam. Dipindahkan dalam tabung berisi larutan NaCl 0,9%,
dikocok hingga terdispersi secara merata. Diencerkan secara bertahap hingga diperoleh
inokulum yang menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.
Pengujian Potensi Antibiotik
Disiapkan 5 cawan petri, diambil 0,1 ml biakan bakteri dan dicampur dengan
15 ml media dalam masing-masing cawan, dibiarkan memadat. Ditanamkan 7
pencadang logam/gelas pada 4 cawan, dimasukkan 0,1 ml LIB kloramfenikol secara
berselang-seling dengan S3, 1 pencadang diisi dengan 0,1 ml air suling sebagai kontol.
Ditanamkan 7 pencadang logam/gelas pada 1 cawan sisa, isi dengan larutan
kloramfenikol uji (U3) dan LIB kloramfenikol (S3). Diinkubasi pada suhu 35±2ºC
selama 24-48 jam. Setelah inkubasi diukur diameter daerah hambat. Prosedur yang
sama dilakukan terhadap tetrasiklin (Depkes, 1995).

1. Jelaskan pengertian potensi antibiotik!
. .
. .
. .
. .
. .
2. Jelaskan prinsip uji antibiotik!
. .
. .
. .
. .
. .
. .
3. Mengapa uji potensi antibiotik dilakukan?
. .
. .
. .
. .
. .
. .
. .


1. Jelaskan mengapa pecadang kertas/logam/gelas dari masing-masing
konsentrasi diletakkan secara berselang-seling dengan dosis tengah (S3)!
.
Medan, 2019
Tanggal ACC:
( ) ( )

Buku Penuntun Lab Mikro S1 REG INT1

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Buku Penuntun Lab Mikro S1 REG INT1

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PENUNTUN DAN LAPORAN

Nama Lengkap : ................................................................

Hari Praktikum : ................................................................

Asal Sekolah : ................................................................

1|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Alat dan Bahan yang Harus Selalu Dibawa (Praktikan)

Alat-alat yang disterilisasi

2|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

Pertanyaan Penuntun (wajib isi sebelum praktikum):

1. Apa pengertian sterilisasi?

3|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

4|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

5|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

6|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

Alat dan Bahan yang Harus Selalu Dibawa (Praktikan)

Bahan-bahan yang disterilisasi

7|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

Bahan-bahan yang disterilisasi adalah akuades, larutan pengencer

1. Mengapa bahan-bahan mikrobiologi harus disterilkan?

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

9|BUKU PENUNTUN DAN LAPORAN PRAKTIKUM

Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik

Metode Inokulasi Mikroba

Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah:

Alat dan Bahan yang Harus Selalu Dibawa (Praktikan)

Pertanyaan Penuntun (wajib isi sebelum praktikum):

1. Jelaskan perbedaan inokulasi dan isolasi bakteri!

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

Bakteri gram (-) berwarna merah jambu/pink

Pertanyaan Penuntun (wajib diisi sebelum praktikum) :

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan

Hasil dan Pengamatan Jamur

No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan

Pertanyaan Tambahan (wajib isi setelah praktikum):

Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

Pada pengujian angka kapang/khamir digunakan pengencer PDF yang

 Jumlah koloni rata-rata = jumlah kedua cawan dikalikan dengan faktor

Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil dan jamur setelah cuplikan

Untuk menghitung angka lempeng total bakteri dan jamur

Media dan pengencer

1% Triphenyltertrazolium Chloride (TTC)

3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingka tpengenceran yang berurutan

9. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

No. Data Sampel Pengamatan Perhitungan Kesimpulan

Pertanyaan Tambahan (wajib isi setelah praktikum):

Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:

UJI ANGKA PALING MUNGKIN (MPN) Bakteri Koliform)

Teknik Most Probable Number (MPN) merupakann metode untuk

Sampel yang menunjukkan uji presumtif positif dilanjutkan ke uji konfirmasi.

Tabung reaksi dilengkapi tabung durham

Dengan cara aseptik diitimbang 25 cuplikan kedalam kantong stomaker steril.

Tabel MPN ( Cara 3 Tabung )

Pertanyaan Penuntun (wajib diisi sebelum praktikum) :

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

Pertanyaan Tambahan (wajib isi setelah praktikum):