Apuntes - Medios de Cultivos - Lab

Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo.
- 1
Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso. U.T. 14 - 1 Bloque temático III
I. INTRODUCCIÓN
Los gérmenes, patógenos o no, buscan generalmente el hábitat más idóneo para su supervivencia y
multiplicación. En el hombre existen diversas localizaciones que por su temperatura, humedad, nutrientes, etc.,
les proporcionan el lugar más adecuado para su establecimiento y supervivencia.
Una vez allí, como ya sabéis, pueden quedar como simples comensales, o esperando la oportunidad de
progresar, afectando a los tejidos, bien sea localmente o mediante toxinas. En caso de producir enfermedad,
estos microorganismos se multiplican rápidamente en el interior del huésped, desapareciendo, en general, en
cuanto el organismo es capaz de desarrollar los mecanismos adecuados de contención de esa multiplicación.
Uno de los pilares del desarrollo de la moderna microbiología, apoyado en los postulados de Koch, fue
posibilitar la recuperación del microorganismo presuntamente responsable del cuadro infeccioso a partir de
muestras obtenidas del paciente infectado.
El número de bacterias que es posible recuperar de un tejido infectado puede variar desde pocos cientos
a miles de millones. Si tenemos en cuenta el pequeño tamaño de las bacterias (en torno a los 2 µm de longitud
y 2 fl de volumen) podremos comprender la gran cantidad de individuos necesarios para poder hacer visible
una población bacteriana.
Los microorganismos crecen fácilmente cuando se les facilitan todas las condiciones necesarias para su
multiplicación (tipo de atmósfera, grado de humedad, temperatura, elementos nutritivos, etc.). De esta manera
una sola bacteria puede dar lugar a la generación de miles de millones de individuos en pocas horas. Estas
células, creciendo y acumulándose por superposición sobre una superficie sólida, dan lugar a una masa de
bacterias que conocemos con el nombre de colonia, cuyo tamaño pude oscilar entre 0,1 mm y 1 cm (o más),
dependiendo de la rapidez de reproducción y del tiempo transcurrido.
Si al inocular la muestra en el medio, las bacterias quedan depositadas sobre la superficie del medio de
cultivo con una separación pequeña, lo más probable es que las colonias se mezclen y no podamos distinguir
claramente sus características morfológicas. Si la separación entre una bacteria y otra es mayor que el tamaño
de la colonia, entonces sí es posible la obtención de colonias aisladas, para utilizarlas posteriormente en los
procedimientos de identificación y determinación de susceptibilidad antimicrobiana.
La inoculación de una muestra en un medio debe procurar, aparte del crecimiento bacteriano, el aislamiento
de colonias, lo cual nos permitirá, además de diferenciar floras polimicrobianas, trabajar con una gran cantidad
de células bacterianas con las mismas características.
Al laboratorio le corresponde simular experimentalmente las condiciones óptimas para el crecimiento de
estos gérmenes. Si tenemos en cuenta que a veces tendremos que aislar un único microorganismo de una
población muy diversa, o que en otras ocasiones debemos buscar gérmenes cuyas condiciones de crecimiento
desconocemos, podremos comprender que la empresa que intentamos acometer es más ardua de lo que en
principio podría parecernos.
Para poder comprender mejor todo este complejo proceso, vamos a empezar hablando de las
características generales del crecimiento bacteriano y de la fisiología de su crecimiento; a continuación
hablaremos de los medios de cultivo, su clasificación, y explicación técnica de los más importantes. Por último
abordaremos la preparación práctica de un medio de cultivo como el agar nutritivo.
Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

I. E. S. Jaime Ferrán Clúa. San Fernando de Henares. (28830 Madrid) Código 28038616
Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo. - 2
II. CRECIMIENTO BACTERIANO

El crecimiento de los microorganismos es la síntesis equilibrada y específica de los componentes
protoplasmáticos a partir de las sustancias nutritivas presentes en el medio externo. Además, los compuestos
sintetizados deben ser reunidos y almacenados adecuadamente para producir réplicas exactas de la unidad
funcional. Este complicado proceso depende de los tipos y concentraciones de las sustancias nutrientes
disponibles, y del aporte continuo de energía necesaria para llevar a cabo las reacciones de síntesis.
El crecimiento de las bacterias puede ser considerado desde dos puntos de vista: el primero es el
ensanchamiento o alargamiento de la célula individual, acompañado de la síntesis de nuevos constituyentes
citoplasmáticos y celulares; el segundo es el aumento del número de células que se produce cuando la célula
madre se divide para dar dos células hijas.
En general, la forma más común de multiplicación bacteriana es la fisión binaria. El tamaño máximo que
debe alcanzar la célula antes de la división suele ser constante. El tiempo de generación en fisión binaria, es
decir, el tiempo transcurrido entre dos divisiones celulares, es variable, pudiendo oscilar entre 10 minutos y
varios días. De esto depende que el crecimiento de una bacteria sea rápido o lento.
Como curiosidad, podríais calcular el tamaño que alcanzaría una colonia bacteriana compuesta por
individuos de 1 pg de masa y cuyo tiempo de generación fuese cada 20 minutos, al cabo de 48 horas.
II.A FASES DE CRECIMIENTO

El crecimiento de las bacterias en cultivo puede determinarse midiendo experimentalmente el incremento
de la materia celular o el incremento del número de células. La curva de crecimiento bacteriano se divide en
segmentos o fases de crecimiento. Las partes más significativas son la fase de latencia, durante la cual no
existe aumento cuantitativo o éste es muy pequeño; la fase logarítmica o de crecimiento exponencial, durante
la cual las bacterias se multiplican a la máxima velocidad; y la fase estacionaria, en la que se alcanza el
máximo de crecimiento.
Siguiendo a la fase estacionaria se produce generalmente la muerte de parte de las células presentes, de
forma rápida o lenta pero siempre exponencialmente.
La fase de latencia es el período necesario para que las células viables del inóculo acumulen enzimas e
intermediarios esenciales para la síntesis de componentes celulares a concentraciones compatibles con el punto
de máxima síntesis. Cuando el inóculo se ha tomado de un cultivo en fase exponencial, se elimina en gran
medida o totalmente el período de latencia, debido a que las células se encuentran ya en estado de equilibrio
fisiológico, lo que hace posible la síntesis máxima.
La fase de crecimiento exponencial representa una situación prácticamente estable en cuanto a la relación
de las bacterias con su entorno. Esta estabilidad es aproximada, debido a que el medio es alterado
continuamente por los microorganismos, y limitada, porque se mantiene sólo durante una parte de la vida del
cultivo. La tasa de crecimiento está determinada por factores ambientales tales como la concentración de algún
nutriente esencial, la cantidad de sustrato oxidable o el grado de difusión del oxígeno dentro del cultivo.
El final de la fase de crecimiento exponencial, está marcado por un descenso relativamente rápido de la tasa
de división celular, lo que señala el comienzo de la fase estacionaria. En dicha fase no se para por completo
la división, pero las células comienzan a morir, y las divisiones ocasionales contrarrestan estas muertes, de
forma que el número de microorganismos viables permanece relativamente constante durante un tiempo.
Actualmente existen sistemas automatizados que nos permiten conocer la velocidad de crecimiento de un
cultivo bacteriano en medio líquido mediante la medición del ATP bacteriano (bioluminiscencia).

II.B REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS BACTERIAS

Las bacterias utilizan para su metabolismo diferentes sustancias que les permiten desarrollarse sin dificultad.
Las bacterias que utilizan nutrientes simples y no dependen casi para nada de la célula huésped se denominan
autótrofas; aquellas que son incapaces de utilizar estos compuestos y necesitan sustancias previamente
sintetizadas por otra célula se denominan heterótrofas.
Algunas bacterias son bastante restrictivas con respecto a la clase de sustancias que utilizan para la
obtención de energía (p.ej. sólo hidratos de carbono ); otros sin embargo, pueden utilizar aminoácidos, ácidos
grasos, hidratos de carbono y hasta compuestos aromáticos como fuentes de energía.
La mayor parte de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre que el medio de cultivo les
proporcione todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicación en una forma asimilable. A
este respecto, las necesidades de las bacterias son extremadamente variables y pueden dividirse en:
1) Necesidades elementales:
Son los elementos que entran a formar parte de la composición del microorganismo, es decir, aquellos
que constituirán las proteínas, ácidos nucléicos, glúcidos, lípidos, etc. Los más importantes son:
Carbono puede ser obtenido a partir del CO2 atmosférico, o más habitualmente suele ser
proporcionado por una fuente orgánica, como proteínas, glúcidos, etc.
Nitrógeno se obtiene de los grupos amino, sales de amonio, N orgánico, nitratos o N
atmosférico
Hidrógeno y oxígeno obtenido de las fuentes anteriores, y principalmente del agua
Azufre generalmente obtenido de los sulfatos
Fósforo generalmente obtenido de los fosfatos
Metales son utilizados en forma iónica
.K, Mg, Ca, Fe.- deben ser añadidos al medio.
.Oligoelementos (Mn, Zn, Co, Cu, etc.).- Están generalmente presentes
como impurezas en los componentes del medio.
2) Necesidades energéticas:
Son indispensables para cubrir los gastos que lleva consigo la síntesis. Las fuentes utilizadas para
obtenerla son la energía luminosa, y más normalmente la energía química, liberada a través de las
reacciones redox.
3) Necesidades de factores de crecimiento:

En ocasiones es necesario suministrar a las bacterias determinados compuestos que ellas no son
capaces de sintetizar. Son los llamados factores de crecimiento: aminoácidos, bases púricas y
pirimidínicas, vitaminas, etc. Estas necesidades específicas son más frecuentes, y ciertos gérmenes
exigen la presencia de muchos de estos factores.

II.C ATMÓSFERA DE CRECIMIENTO.

Las bacterias necesitan para su crecimiento no sólo una temperatura óptima y la presencia de unos
nutrientes adecuados; la existencia de ciertos compuestos gaseosos puede facilitar o impedir su crecimiento.
El gas o la mezcla de gases más importante en la naturaleza es el aire. Las bacterias se clasifican en
aerobias y anaerobias en función de su capacidad para crecer o no en presencia de oxígeno. Las bacterias
aerobias pueden obtener la energía necesaria para el crecimiento gracias al oxígeno, ya que utilizan a éste
como aceptor final de electrones. Al grupo de bacterias que pueden obtener energía del oxígeno, pero también
son capaces de crecer en ausencia de éste se les denomina anaerobias facultativas. Las bacterias que
requieren O2 para crecer, pero a unas concentraciones menores del 20% se denominan microaerófilas.
Recordad que éstas NO crecen en ambientes totalmente anaerobios.
Las bacterias anaerobias sí pueden obtener energía en ausencia del oxígeno ya que el aceptor final de
electrones es un compuesto diferente. Los microorganismos que no pueden vivir en presencia de oxígeno se
denominan anaerobios estrictos; los aerotolerantes son aquellos microorganismos anaerobios que no
utilizan el oxígeno pero no son perjudicados por él.
La mayoría de las bacterias necesitan además, para un óptimo crecimiento, de un 5 a un 10% de CO2 en
la atmósfera de incubación.
Los sistemas utilizados para conseguir la atmósfera más apropiada para cada gérmen son muy diversos.
Vamos a describir brevemente los más utilizados:
1) Frasco hermético con vela encendida.-
Es el método más antiguo y clásico. En estas condiciones se producía una pequeña
cantidad de CO2 junto con vapor de agua a la vez que disminuía ligeramente la presión de O2.
2) Generadores de gases.-
Existen preparados comerciales que producen una cantidad determinada de gas(es) al ser
hidratados. Teniendo en cuenta que estos generadores se introducen en unos recipientes
herméticos de volumen conocido, la concentración de gases obtenida puede ser
perfectamente calculada por el fabricante para que coincida con nuestras necesidades o,
mejor dicho, con las del microorganismo que pretendemos cultivar.
Los generadores de gases se presentan en forma de sobres con un contenido pulverulento,
para facilitar la reacción de la mezcla con el agua.
Los recipientes más utilizados son las "jarras" cilíndricas en las que es posible introducir
de 10 a 20 placas. Sin embargo, en los laboratorios que no tienen mucho volumen de
muestras, se utilizan unos sobres de plástico que se cierran herméticamente mediante un clip
y que permiten la producción de una atmósfera determinada para una o dos placas.
Los generadores más utilizados son los que proporcionan una atmósfera con una
concentración de CO2 entre el 5 y el 10% y los que producen una atmósfera pobre en O2
para cultivo de anaerobios.
3) Estufas de CO2
Algunas estufas de cultivo vienen preparadas para conectarse a bombonas de CO2 de
manera que, mediante una serie de manómetros y reguladores, es posible conseguir una
concentración determinada de este gas en el interior.

II.D METABOLISMO BACTERIANO.

Las bacterias utilizan una gran cantidad de fuentes de energía: unas recurren a la luz, y otras a componentes
químicos, orgánicos o inorgánicos. Casi todas las vías de formación de energía conducen a la formación de
ATP o PNH ( NADH y NADPH ). El ATP proporciona la energía necesaria para la creación de nuevos
enlaces, y los PNH son una excelente fuente de electrones para la mayoría de las reacciones que requieren
un agente reductor.
II.E TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.

Las bacterias pueden clasificarse según su temperatura óptima, que generalmente se toma como aquella
a la cual se produce el máximo crecimiento.
Bacterias sicrófilas son aquellas que se desarrollan entre 0 y 20º C. En el extremo opuesto se encuentran
las bacterias termófilas, cuya temperatura óptima supera los 45ºC, soportando un máximo de 75º C.
Las bacterias mesófilas son aquellas cuya temperatura óptima alcanza valores medios, generalmente unos
37ºC, englobándose la gran mayoría de las bacterias dentro de este grupo. La mayor parte de las bacterias
patógenas son mesófilas, y su temperatura óptima se halla con frecuencia próxima a la de su huésped natural.
La temperatura óptima se consigue en estufas de cultivo, que normalmente son capaces de regularla entre
los 20 y los 60º C.
II.F OTRAS CONDICIONES NECESARIAS PARA EL CRECIMIENTO.

La composición del medio de cultivo no es la única condición necesaria para un buen cultivo microbiano.
Este no se producirá si no se respetan además ciertas condiciones físico-químicas:
1) Hidratación:
La cantidad de agua presente en el medio es fundamental para la reproducción óptima de las
bacterias.
2) Presión osmótica:
La mayor parte de las bacterias son muy tolerantes a las variaciones de presión osmótica,
debido a la presencia de una pared celular extraordinariamente rígida.
Aunque se trabaja habitualmente en isotonía, las bacterias presentan una gran resistencia a la
hipotonía (suspensión de gérmenes en agua destilada), aunque no toleran concentraciones
osmóticas extremadamente elevadas.
3) pH:
Tiene una gran importancia, fundamentalmente porque permite un óptimo funcionamiento de
los sistemas enzimáticos encargados de la síntesis. En condiciones normales el pH óptimo es
normalmente cercano a la neutralidad. Por tanto y salvo excepciones, el pH de los medios se
ajustará entre 6 y 7.
4) Potencial redox:
Aunque en condiciones normales no se tiene mucho en cuenta, si se hace en condiciones
experimentales, donde la presión parcial de oxígeno juega un papel determinante.

III. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos
que se basan en:
a) su consistencia
b) su utilización
c) su composición
III.A SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios líquidos:
Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más
utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua.
Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una
determinada concentración.
2) Medios sólidos:
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más
utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina:
Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada
por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a
temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la temperatura
óptima de crecimiento para muchos microorganismos.
Agar-agar:
Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble en
agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y no
se funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene
el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados
de las necesidades nutritivas de un microorganismo.
Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:
- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y
- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas.
La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen.
El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial
para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para
electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo
microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.
3) Medios semisólidos:
Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una
proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la
movilidad de las bacterias.

III.B SEGÚN SU UTILIZACIÓN.
1) Medios comunes:
Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de
bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar
nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de
este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento:
Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores
indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por
adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan
dichos factores.
En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento
del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)
El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son
aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos:
Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población
polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de
una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza
para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores:
Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una
población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una
variante más restrictiva de los medios selectivos.
Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de
cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio
inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el
crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales:
Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o
especies. La adición de un azucar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin.
El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan
la lactosa de aquellos que no lo hacen.
También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es
doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificación:
Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la
identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar
el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el
indicador que nos muestre el resultado.
El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un
elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación.
Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de
identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo

y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto último los medios CPS ID3 o Uriline ID
(Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa
de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.
7) Medios de multiplicación:
Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Se
emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados
para la multiplicación suelen ser líquidos.
El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
8) Medios de conservación:
Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener.
Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el
Laboratorio de Microbiología.
En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a) haciendo pases periódicos de placa a placa,
b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.
9) Medios de transporte:
Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su
utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del
medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,
Cary-Blair, etc.
III.C ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser
clasificados en:
1) Medios complejos:
Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más
raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales,
donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes
resultados y son los más empleados.
2) Medios sintéticos:
Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y
disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición
perfectamente definida.
3) Medios semisintéticos:
El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de
un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los
factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura,
extracto de tejidos, etc.).
Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo
exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son,
aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

IV. DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
IV.A MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más
conocidos en un laboratorio de Microbiología.
Agar nutritivo:
Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares.
No es diferencial.
Agar sangre:
Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis
(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos.
Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico
o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja.
La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de
los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este
es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se
destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.
La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en
algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las
reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias
inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes.
Agar chocolate:
El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón
el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el
factor X o hemina termoestable.
El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos y
meningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes.
El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una
mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente
según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que
confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias.
Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el
crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el
aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido una
mezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante.
Agar MacConkey:
Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de
los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su
contenido en sales biliares.
En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un
medio diferencial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen
aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras,
apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).

Agar C.L.E.D.:
El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e
identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita
la invasión de los cultivos por Proteus.
La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la
interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol.
Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color
verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S.:
El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de
muestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes
y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que
fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).
Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es
excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito.
El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los
gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico,
que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia.
Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será
exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie.
El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies
de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos
inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen :
Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento
de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder
diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS.
Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el
efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).
El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más
numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre
E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien
en este medio.
C.P.S. ID3. :
Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilis
y E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azul
o marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie
sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej)
Granada, Islam o New GBS:
Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato
cromogénico específico de este microorganismo.
Agar Mueller-Hinton:
Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidad
a los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente.

IV.B OTROS MEDIOS DE CULTIVO.
Agar Tripticase de soja:

Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o
Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial.
Caldo tioglicolato con resazurina:
Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobios
y microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.
Agar Chapman:
Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico
permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a
este medio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que este
gérmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).
Agar Baird-Parker:
Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.
Medio de Loeffler:
Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.
Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):
Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez.
Agar Kligler:
Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos con
más detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se trata
de un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares
(glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfato
ferroso a partir del tiosulfato sódico.
Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):
Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y
diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico.
Caldo selenito-F:
Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.
Agar Cetrimida. Agar King:
Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.
El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.
Agar Schaedler:
Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios.
Agar Gardnerella:
Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias beta
hemolíticas características de Gardnerella vaginalis
Agar CIN, Skirrow o Campylosel:
Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia.
Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):
Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella
Löwenstein-Jensen:
Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita para
inhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

V. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Actualmente pocos laboratorios conservan la pesada e ingrata tarea de hacer sus propios medios de
cultivo. Esta labor, que hasta hace pocos años era habitual en laboratorios pequeños y grandes, ha sido
sustituida por la compra de los medios ya emplacados, más baratos, más homogéneos y con mayores
garantías de calidad. Sin embargo, hemos de tener en cuenta que, aunque el proceso de fabricación masiva
de placas está totalmente automatizado, no podemos descartar que alguna vez trabajemos en un laboratorio
que conserve esta labor tradicional. Por ello y aunque sólo sea a modo de prueba, tenéis que saber preparar
un agar nutritivo. Esta es la razón por la que os damos unas breves nociones sobre la preparación de medios
de cultivo.
Las casas comerciales proporcionan los extractos secos necesarios para la fabricación de cualquier tipo
de medio. En general se suministran en forma de polvo o en tabletas. Esta segunda modalidad nos evitará la
tarea de tener que pesar los componentes, pues las tabletas contienen la cantidad exacta de polvo desecado
para ser disuelta en un volumen concreto de líquido. No obstante el procedimiento de preparación es idéntico
para ambos.
La preparación de los diferentes medios de cultivo ha de hacerse siguiendo la instrucciones específicas para
cada uno de ellos. No obstante existen unas cuantas normas generales que han de tenerse muy presentes:
1) Debe emplearse vidrio perfectamente limpio.
2) Es imprescindible una correcta pesada de los componentes y una perfecta medición del volumen
de agua.
3) Es aconsejable utilizar agua destilada o desmineralizada.
Para la preparación de medios se parte de mezclas deshidratadas de los compuestos que la integran.
Habitualmente sólo es necesario añadir el agua y esterilizar en autoclave, pero en algunas ocasiones es
necesario añadir después de la esterilización algún componente termolábil que no hubiera resistido el calor.
Los medios deshidratados presentan numerosas ventajas:
1) Son muy estables.
2) Su utilización es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su utilización.
3) Una pequeña cantidad de producto permite la preparación de una importante cantidad de medio,
no necesitando un gran volumen de almacenamiento.
4) Son muy económicos.
La técnica utilizada para rehidratar los medios de cultivo desecados es muy importante para obtener
productos de buena calidad.
Es conveniente disolver todo el medio en menos de la mitad del agua que corresponda. Mezclar bien hasta
disolver totalmente y por último completar con agua destilada el volumen necesario.
Es posible acelerar la disolución utilizando agua caliente a 45 o 50 ºC. El calentamiento es necesario a
veces para obtener una disolución completa.
Si el medio contiene agar conviene homogeneizar completamente la mezcla antes de llevar a ebullición. No
sobrecalentar inútilmente (de uno a dos minutos de ebullición son suficientes).
Verificar rápidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el fabricante. Es indispensable
efectuar esta verificación, pues el pH del agua destilada puede variar según las condiciones de obtención y
almacenamiento. El ajuste de pH debe hacerse siempre a temperatura ambiente.
Una vez preparados, los medios se esterilizan generalmente en el autoclave a unos 120 C durante 15 ó 20

minutos, para volúmenes de hasta 500 ml. Para volúmenes mayores se requieren tiempos superiores.
Si el medio no resiste las altas temperaturas se puede esterilizar a vapor fluente o tyndalización.
Una vez preparados, los medios no necesitan ser filtrados.
En ningún caso conviene sobrepasar la temperatura de esterilización.
Los medios sólidos se reparten cuando todavía están fundidos y se dejan solidificar en su envase definitivo
(placa, tubo).
Si hay que añadir al medio sustancias de enriquecimiento termolábiles, se hace después de la esterilización,
y con el medio refrigerado, pero aún fundido. La adición debe ser aséptica y lenta, para conseguir una
homogeneidad sin grumos ni burbujas.
Los medios deshidratados son muy higroscópicos; es indispensable que los frascos permanezcan abiertos
solo durante el tiempo necesario para la obtención del producto. No deben utilizarse medios rehidratados
ambientalmente. Por eso su conservación y almacenamiento debe hacerse lejos de la luz y de fuentes de calor,
en lugar fresco y seco.
Los medios preparados deben conservarse en buenas condiciones tras su esterilización. Si han de ser
almacenados deben ser etiquetados con su nombre y fecha de fabricación; han de protegerse contra la
desecación y la luz, para lo que es conveniente introducirlos en bolsas estériles y herméticas. Un refrigerador
a 4ºC es un buen lugar para almacenar las placas preparadas.
Los medios solidificados deben ser puestos a temperatura ambiente y despojados de la humedad que
pudiesen tener antes de su utilización.
Los medios deben someterse a un control de calidad que abarcará diferentes aspectos:
Control de esterilidad:
Se efectúa incubando algunas placas del lote escogidas al azar y verificando la ausencia de
crecimiento bacteriano.
Control de composición:
Se realiza para comprobar que el medio posee los componentes que lo caracterizan de
manera que permita el crecimiento de determinados gérmenes.
Control de caducidad:
Se realiza para utilizar las placas durante el tiempo que garantice su correcta utilización. Por
término medio las placas preparadas pueden conservarse entre 15 días y dos meses.

VI. PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR AGAR NUTRITIVO
Como ejercicio práctico de este tema vamos a preparar 5 placas por alumno de agar nutritivo. Vamos
a enumerar el material necesario y el procedimiento que vamos a emplear.
Material necesario
- Autoclave
- Balanza electrónica
- Papel indicador de pH
- Matraz Erlenmeyer de 250 ml perfectamente lavado y seco
- Pipetas no terminales de 1, 2 5 y 10 ml
- 10 placas de Petri estériles
- Algodón graso
- Agua destilada
- Solución de NaOH 0,5 N
- Solución de ClH 0,1 N
Fórmula:
Para obtener un litro de agar nutritivo es necesario pesar 23 g de producto preparado comercialmente.
Instrucciones:
1. En un matraz Erlenmeyer se ponen de 100 a 150 ml de agua destilada y se añade la cantidad de
producto necesario para preparar 250 ml de medio (5,75 g).
2. Se calienta hasta que hierva, removiendo hasta disolver por completo.
3. Se mide el pH con papel indicador, procurando ajustarlo a 7,4 con las soluciones de clorhídrico
y sosa preparadas al principio.
4. A continuación se termina de aforar hasta 250 ml, procurando mantener el medio sin que
solidifique. Una vez aforado se le da el último hervor.
5. Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15', taponando la boca del matraz con algodón.
6. Una vez esterilizado, y mientras el medio esté fundido (¡prohibido quemarse!), se deposita sobre
cada placa aproximadamente unos 25 ml de medio, evitando la formación de burbujas o
desniveles en el medio.
7. Las placas no se cerrarán completamente, para evitar la condensación de agua en la tapa superior.
(Para evitar contaminaciones habrá que trabajar en un ambiente estéril o evitar corrientes de aire).
8. Cuando el medio se haya enfriado y solidificado (20 minutos aproximadamente), procederemos
a dar la vuelta a las placas, rotulándolas con el nombre del medio, la fecha de elaboración y el
grupo al que pertenece.
9. Las placas, guardadas en bolsas de plástico (para evitar la desecación) pueden conservarse hasta
30 días en refrigerador, siendo conveniente someterlas a los controles de calidad establecidos por
el laboratorio.
10. Para preparar un caldo nutritivo utilizaremos el mismo procedimiento, excepto la adición de agar.
En este caso el medio se reparte en tubos.


Apuntes - Medios de Cultivos - Lab

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Apuntes - Medios de Cultivos - Lab

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

II. CRECIMIENTO BACTERIANO

II.A FASES DE CRECIMIENTO

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

II.B REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS BACTERIAS

3) Necesidades de factores de crecimiento:

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

II.C ATMÓSFERA DE CRECIMIENTO.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

II.D METABOLISMO BACTERIANO.

II.E TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.

II.F OTRAS CONDICIONES NECESARIAS PARA EL CRECIMIENTO.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

III. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

III.A SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

III.B SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

III.C ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

IV. DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

IV.A MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

IV.B OTROS MEDIOS DE CULTIVO.

Agar Tripticase de soja:

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

V. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

VI. PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR AGAR NUTRITIVO

Gustavo A. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Curso 2004-2005

Anda mungkin juga menyukai