LAPORAN FARMAKOKINETIK

- Validasi Metode Analisis Penentuan Kurva Kalibrasi dengan Spektrofotometri

Disusun Oleh :

Ela Fitri Nuryana

11181015

4FA1

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS BHAKTI KENCANA

TAHUN AJARAN

2020 – 2021
 I. TUJUAN
Melakukan validasi metode analisis sampel, penentuan kalibrasi dengan
spektrometri untuk memastikan bahwa metode tetap yang digunakan sudah sesuai
dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan hasi yang dapat dipercaya

II. PRINSIP
Validasi metode analisis sampel Paracetamol menggunakan Spektrofotometri
dengan parameter linieritas, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ).

III. DASAR TEORI

Tahap awal dalam penelitian farmakokinetik adalah penentuan kadar obat dalam
sampel biologis, karena parameter farmakokinetik obat tersebut diperoleh berdasarkan
hasil pengukuran kadar obat utuh dan atau hasil uraian (metabolitik) dalam sampel
biologis seperti darah, urine, saliva, dan lain-lain. Metode analisis yang digunakan untuk
menentukan kuantitatif kadar obat dalam sampel biologis merupakan hal yang sangat
penting dalam evaluasi dan intepretasi data farmakokinetik. Oleh karena itu metode
analisis yang tervalidasi merupakan suatu kebutuhan mutlak untuk memperoleh hasil
yang dapat dipercaya.
Tahap untuk mendapatkan metode analisis yang valid untuk diaplikasikan dalam
suatu penelitian farmakokinetik meliputi pengembangan metode analisis dan validasi
metode analisis yang digunakan. Dalam tahap pengembangan perlu diperhatikan apakah
untuk obat yang akan diteliti belum pernah ada metode analisis untuk penentuan kadar
obat tersebut dalam matriks biologis yang akan digunakan. Jika memang belum ada
metode analisis yang telah dikembangkan, maka perlu diperhatikan struktur dan sifat
fisikokimia obat yang akan diteliti. Apakah ada metode analisis untuk metode lain
dengan struktur yang mirip dengan matriks biologis yang sama. Jika ada, data ini
merupakan suatu awal untuk memulai suatu pengembangan metode analisis. Dalam
banyak kasus, metode analisis untuk penelitian farmakokinetik dapat diadaptasi dari
suatu atau beberapa metode analisis yang telah dipublikasikan dengan melakukan sedikit
ataupun berbagai modifikasi untuk mendapatkan hasil yang diinginkan.
Metode analisis yang umum digunakan dalam penelitian farmakokinetik adalah
1. Metode kimia, contohnya : HPLC (High Performance Liquid Chromatography),
GC (Gas Chromatography), LC-MS (Liquid Chromatography Mass
Spectrophotometry).
2. Metode bilogis, yang didasarkan pada prosedur immunoassay (RIA,
radioimmunoassay), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan metode
mikrobiologi.
 Pengembangan metode analisis meliputi evaluasi dan optimasi berbagai tahapan,
seperti penyiapan sampel, pemisahan analit atau obat yang diteliti, deteksi dan
kuantifikasi.
Validasi suatu metode anlisis dilakukan untuk menjamin bahwa metode yang akan
digunakan adalah valid dan terpercaya. Beberapa parameter digunakan untuk
mengevaluasi validitas dan metode yang dikembangkan, antara lain: perolehan kembali
(recovery) obat dari matriks biologi yang digunakan, presisi dan akurasi. Persyartan yang
dituntut bagi suatu metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang
tinggi (75-90% atau lebih), kesalahan acak dan kesalahan sistemik kurang dari (10%).
Kepekaan dan selektivitas peralatan merupakan kriteria lain yang penting, hal mana
nilainya akan sangat tergantung dari alat pengukur yang digunakan. Stabilitas obat akan
diteliti dalam matriks sampel juga harus diperhatikan.
Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar obat dalam tubuh
untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh : darah, urin, feses, saliva, jaringan
tubuh, cairan blister, cairan spinal, dan cairan sinovial. Darah merupkan sampel biologis
yang paling umum digunakan dan mengandung berbagai protein seperti albumin dan
globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum
yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah
untuk menggumpal dan supernatan yang dikumpulkan setelah sentrifugasi adalah serum.
Sedangkan plasma diperoleh dengan penambahan antokoagulan pada darah yang diambil
dan supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi merupakan plasma. Jadi plasma dan
serum dibedakan dari protein yang dikandungnya.
Adanya kandungan protein dalam sampel biologis yang akan dianalisa menyebabkan
dibutuhkannys suatu tahap perlakuan awal dan atau penyiapan sampel sebelum
penentuan kadar obat dapat dilakukan. Hal ini untuk mengisolasi atau memisahkan obat
akan diteliti dari matriks sampel yang diperoleh. Protein, lemak, garam, dan senyawa
endogen dalam sampel akan mengganggu penetuan kadar obat yang bersangkutan.
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji
yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi
yangmenghubungkan antara respon (Y) dengan konsentrasi (X). Linieritas dapat diukur
dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang
diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat
ditentukan nilai kemiringan (Slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Linieritas juga dapat dilakukan dengan mengukuran absorbansi larutan pembanding,
kemudian dibuat kurva hubungan antara kadar vs serapan dan ditentukan persamaan
regresi linier serta koefesien korelasi (x) dan koefesien korelasi dari fungsi (Vxo).
Koefesien fungsi regresi dapat dihitung menggunakan rumus dibawah ini (Harmita,
2004):
∑(y – y1) 2
Sy/x = √
𝑛−2

Keterangan : Sy/x : Simpangan Baku residual

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang
masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Definisi batas deteksi
yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi
merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko (yb) ditambah
dengan 3 simpangan baku blanko (3Sb).
Limit Of Detection seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada
rasionya 2 atau 3 dibanding 1. ICH mengenalkan suatu konvensi metode signal to noise
ratio ini, meskipun demikian ICH juga menggunakan 2 metode pilihan lain untuk
menentukan LOD yakni metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan.
Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan pada
metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD)
respon dan kemiringan (Slope,S) kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai
dengna rumus, LOD = 3,3 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan
pada SD blanko, pada SD residual dari garis regresi atau standar deviasi intersep y pada
garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel
yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan. LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi
(dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal tunoise 10:1
digunakan untuk menentukan LOQ. Perhitungan LOQ dengan rasio signal to noise 10:1
merupakan aturan umum, namun LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi
dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Sehingga konsentrasi LOQ menurun
maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ
yang lebih tinggi harus dilaporkan
ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini, namun sebagai mana dalam
perhitungan LOD, ICH juga menggunakan 2 metode untuk menentukan LOQ yaitu
metode non instrumental visual dan metode perhitungan. Metode perhitungan didasarkan
pada standar deviasi respon (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai dengan rumus: LOQ =
10 (SD/S) standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan standar deviasi blanko
pada standar deviasi residual garis rekresi linier atau dengan standar deviasi intersep-y
pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007).
 Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki khasiat sebagai analgesik,
antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol merupakan analgesik non-opioid sering dicoba
pertama untuk pengobatan gejala berbagai tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.
Pemerian : serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.
Berat jenis : 1.263 g/cm3
Titik lebur : 169°C (336°F)
Kelarutan : dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20°C); larut dalam air medidih, dan dalam NaOH
1 N; mudah larut dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform, praktis tidak larut dalam eter,
pentana dan benzene
Nama Kimia : N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau 4- hidroksiasetanilida
Rumus Empiris: C8H9NO2
Berat Molekul : 151,16 Jarak lebur : antara 168-172 (Depkes RI, 1995).
Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 245 nm
(A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257nm (A11=715a) sedangkan pada
inframerah memperlihatkan puncak pada 1506, 1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat dkk, 2005).
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar
ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel. Spektrofotometer UV-Vis biasanya
digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada
pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang
400-800 nm. Sebagai sumber cahaya biasanya di gunakan lampu hydrogen atau deuterium untuk
pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak (Dachriyanus, 2004).
IV. TUGAS PENDAHULUAN
1. Tuliskan pembuatan dapar phospat pH 7,4 dan perhitungannya!
Jawab :
Dibuat dengan mencampur 50mL KH2PO4 0,2 M dengan sejumlah 39,1mL NaOH
0,2N dan diencerkan dengan air bebas karbondioksida P secukupnya hingga 200mL
(Source: FI edisi III hal 755).
Pembuatan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 2 L
2000𝑚𝐿
KH2PO4 = 𝑥 50𝑚𝐿 = 500𝑚𝐿
200𝑚𝐿
𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
KH2PO4 = 𝑥
𝑀𝑟 𝑉𝑜𝑙
𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
0,2 M = 𝑥
136,08 500
136,08 𝑥 500 𝑥 0,2
Gram KH2PO4 =
1000
Gram KH2PO4 = 13,608 gram

2000𝑚𝐿
NaOH = 𝑥 39.1𝑚𝐿 = 391𝑚𝐿
200𝑚𝐿
𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
NaOH = 𝑥
𝑀𝑟 𝑉𝑜𝑙
𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
0,2 N = 𝑥
40 391
40 𝑥 391 𝑥 0,2
Gram NaOH =
1000
Gram NaOH = 3,128 gram
Jadi pembuatan dapar phospat pH 7,4 sebanyak 2 L dibuat dengan menimbang
KH2PO4 sebanyak 13,608 gram kemudian dilarutkan dalam 500mL air bebas
karbondioksida, menimbang NaOH sebanyak 3,128 gram kemudian dilarutkan dalam
391 mL air bebas karbon dioksida. Campurkan kedua larutan dan tambahkan air
bebas karbondioksia secukupnya hingga 2L.

2. Jelaskan perhitungan dan pembuatan larutan induk Paracetamol 1000 bpj sebanyak
100mL!
Jawab :
Paracetamol 1000 bpj = 1000 μg / mL
Pembuatan untuk volume 100 mL
Paracetamol 1000 bpj = 100.000 μg /100 mL
= 100 mg / 100 mL
 Jadi penimbangan paracetamol untuk pembuatan larutan induk paracetamol 1000 bpj
sebanyak 100mL adalah 100mg, kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai
secukupnya hingga 100mL.

3. Jelaskan perhitungan 1 seri set pengenceran larutan induk konsentrasi 2,4,6,10, 12

ppm sebanyak 50mL!
Jawab :
Pengenceran Paracetamol induk 1000 bpj menjadi 100 bpj sebanyak 100mL
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 1000 bpj = 100mL . 100 bpj
V1 = 10 mL
Pengenceran paracetamol 100 bpj menjadi beberapa seri konsentrasi :
Pengenceran konsentrasi 2 bpj
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 100 bpj = 50mL . 2 bpj
V1 = 1 mL
Pengenceran knsentrasi 4 bpj
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 100 bpj = 50mL . 4 bpj
V1 = 2 mL
Pengenceran konsentrasi 6 bpj
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 100 bpj = 50mL . 6 bpj
V1 = 3 mL
Pengenceran konsentrasi 10 bpj
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 100 bpj = 50mL . 10 bpj
V1 = 5 mL
Pengenceran konsentrasi 12 bpj
V1 . C1 = V2 . C2
V1 . 100 bpj = 50ml . 12 bpj
V1 = 6 ml
V. ALAT & BAHAN
Alat 1. Mikropipet
2. Spektrofotometri UV-Vis
3. Kuvet
4. Beaker glass
5. Pengaduk kaca
Bahan 1. Paracetamol
2. NaOH
3. KH2PO4
4. Aquadest
5. HCl
6. NaNO3
7. Asam amidosulfonat

VI. PROSEDUR KERJA

1. Pembuatan larutan baku dapar phospat pH 7,4

Larutkan dengan
Kalibrasi wadah 2L Timbang 13,608
aquades hingga
gram KH2PO4
volume 500mL (A)

Campurkan
larutanA dan B, Larutkan dengan
tambahkan aquades hingga Timbang 3,128
aquadest sebelum volume 391mL (B) gram NaOH
tanda batas

Tambahkan aquades
Ukur pH hingga hinggatanda batas.
pH ± 7,4
2. Pembuatan pereaksi warna

Vortex selama 1
Tambahkan 0,5mL Tambahkan 1 mL menit, lalu
HCL 6N diamkanselama 5
NaNO3 10% menit

Tambahkan 2,5 mL Tambahkan 1mL

Diamkan 3 menit asam
didalam es NaOH 10% amidosulfonat15%

3. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 1

Lakukan Encerka PCT 1

Membuat larutan
pengenceran ml sebanyak
induk PCT 1000bpj
PCT 100 bpj 10ml menjadi
sebanyak 50 mL
dalam 50mL 100 ppm
beberapa seri

Tambahkan Membuat
Aduk masing- masing
masing-masing larutan2, 4, 6,
larutan hingga homogen
dapar posphat 10, dan 12 ppm
pH7,4 10mL sebanyak50mL

Ukur absorbansi larutan tersebut

menggunakan spektrofotmetri
UVdengan λ 243nm
4. Pembuatan kurva kalibrasi Paracetamol 2

Membuat Encerka PCT Membuat larutan

larutan induk 1000 bpj 20, 40, 60, 100,
PCT 1000bpj menjadi dan 120 bpj
sebanyak 50 mL beberapa seri sebanyak 10mL
konsentrasi

Aduk masing- Tambahkan

Tambahkan masing-masing
masing larutan pereaksi
hingga homogen dapar posphat
warna pH7,4 10mL

Ukur absorbansi larutan tersebut

menggunakan spektrofotmetri
Visdengan λ 435nm