Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69

Daftar isi tersedia di SainsLangsung

Ekspresi dan Pemurnian Protein

beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/yprep

Ekspresi dan pemurnian insulin manusia rekombinan dari E. coli 20

regangan
Marcin Zielinmain ski*, Agnieszka Romanik-ChruScielewska, Diana Mikiewicz, Natalia Łukasiewicz,
Iwona Sokołowska, Jarosław Antosik, Agnieszka Sobolewska-Ruta, Anna Bierczynska-Krzysik, Piotr
Zaleski, Andrzej Płucienniczak
Institut Bioteknologi dan Antibiotik, StaroScinska 5, Warszawa, 02-516, Polandia

INFO ARTIKEL ABSTRAK

Kata kunci: Jumlah penderita diabetes diperkirakan lebih dari 370 juta, pada tahun 2030 akan meningkat menjadi 552 juta. Di
Diabetes Polandia, jumlah penderita diabetes diperkirakan 3,5 juta (9,1%). Menurut perkiraan Federasi Diabetes
Hiperglikemia Internasional, persentase pasien dalam populasi Polandia dewasa akan meningkat menjadi sekitar 11% selama 20
Vektor ekspresi pIBAINS insulin
tahun ke depan. Terlepas dari munculnya analog insulin di pasar farmasi, pengiriman insulin masih merupakan
manusia rekombinan
metode farmakoterapi yang paling efektif dalam kasus hiperglikemia yang sangat tinggi.
Escherichia coli 20 badan
Strain inang bakteri baru (Escherichia coli 20) diperoleh di Institut Bioteknologi dan Antibiotik
Inklusi regangan
dan vektor ekspresi pIBAINS baru dibuat yang memberikan efisiensi yang lebih besar dalam produksi insulin
manusia rekombinan. Di Departemen Bioengineering IBA, upaya yang berhasil dilakukan untuk memproduksi
insulin manusia rekombinan pada skala laboratorium dan seperempat teknis, dan beberapa batch dilakukan pada
skala semi-teknis. Proses produksi telah dibagi menjadi beberapa tahap: 1. biosintesis insulin dalam fermentor, 2.
isolasi, pemurnian dan pembubaran badan inklusi, 3. renaturasi protein, 4. reaksi enzimatik dengan tripsin, 5.
pemurnian multi-tahap insulin menggunakan teknik tekanan rendah dan HPLC. Pada setiap tahap produksi insulin,
analisis kualitatif dan kuantitatif dilakukan untuk mengkonfirmasi identitas dan kemurnian. Secara khusus, berat
molekul insulin, jumlah insulin dan kandungan pengotor protein dipelajari. Hasil percobaan ini disajikan dalam
karya ini.

1. Perkenalan pengembangan teknologi DNA rekombinan, insulin manusia rekombinan

Defisit insulin dalam suatu organisme atau kurangnya respon sel
terhadap hormon yang diproduksi menyebabkan diabetes mellitus. Penyakit
yang biasanya tidak dapat disembuhkan ini bermanifestasi sebagai gula
darah tinggi (hiperglikemia). Hiperglikemia kronis dapat menyebabkan
gangguan dan disfungsi berbagai organ termasuk ginjal, jantung, pembuluh
darah, sistem saraf dan retina.1]. Menurut perkiraan MFD (International
Diabetes Federation), persentase pasien pada populasi dewasa Polandia
akan meningkat menjadi sekitar 11% selama 20 tahun ke depan.2]. Populasi
ini mungkin di masa depan menjadi penerima hasil proyek kami. Terapi
penggantian insulin adalah standar perawatan untuk pasien dengan
diabetes mellitus tipe 1 dan tipe 2 lanjut. Pemberian insulin masih
merupakan metode farmakoterapi yang paling efektif dalam kasus
hiperglikemia yang sangat tinggi. Jaringan pankreas babi dan sapi adalah
sumber hormon selama bertahun-tahun, diikuti oleh insulin manusia
semisintetik yang diperoleh dengan modifikasi insulin hewan. Dengan
(biosintetik) menjadi tersedia dalam jumlah besar melalui biosintesis dalam
mikroorganisme (Escherichia coli, ragi) menyediakan pasokan hormon yang
andal di seluruh dunia dengan harga terjangkau. Insulin manusia
rekombinan adalah salah satu produk pertama bioteknologi. Kemurnian dan
kualitas farmasi dari insulin manusia rekombinan terbukti lebih unggul
daripada insulin hewan dan semisintetik dan pasien dengan diabetes dapat
dengan aman dan efektif ditransfer dari insulin hewan atau semisintetik
manusia ke insulin manusia rekombinan tanpa perubahan yang diharapkan
dalam dosis insulin.3].
Insulin manusia adalah hormon yang diproduksi di sel pulau
pankreas, bertanggung jawab untuk regulasi metabolisme glukosa.4].
Insulin manusia adalah polipeptida dengan massa molekul 5808 Da.
Hormon terdiri dari dua rantai: rantai A (21 asam amino) dan rantai B
(30 asam amino) yang dihubungkan oleh dua jembatan disulfida. Selain
itu, rantai A mengandung ikatan disulfida intrarantai [5]. Strain inang
bakteri baru (E. coli 20) diperoleh di Institut Bioteknologi dan

* Penulis yang sesuai.

Alamat email: marcinzielinski2@wp.pl (M. Zielinmain ski).

https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.02.002
Diterima 8 November 2018; Diterima dalam bentuk revisi 4 Februari 2019; Diterima 4 Februari 2019
Tersedia online 05 Februari 2019
1046-5928/ © 2019 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-ND (http://
creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0/).
M. Zielinski dkk.
Antibiotik. Juga, vektor ekspresi pIBAINS baru dibangun. Strain baru
dan vektor ekspresi telah dilaporkan di kantor paten Polandia. Hasil
percobaan ini disajikan dalam karya ini.
2. Bahan dan metode
2.1. Bahan:
Escherichia coli 20 Strain IBA 1 adalah turunan laboratorium dari E.coli
CSH50R [ATCC: 39111] [6–8]. Antifoam 204, L-prolin, tiamin
hidroklorida, tetrasiklin hidroklorida, basa trizma, Triton X-100, lisozim,
EDTA, natrium bikarbonat, citrakonat anhidrida, etanolamin, aprotinin
dibeli dari Sigma. Magnesium sulfat heptahidrat, glukosa, amonium
klorida, isopropil alkohol, asetonitril berasal dari Avantor Performance
Materials Poland SA Kalsium klorida dihidrat berasal dari JTBaker.
Natrium klorida, natrium hidroksida, di-kalium hidrogen fosfat, kalium
dihidrogen fosfat, 37% asam klorida, tripsin, karboksipeptidase B, seng
klorida, natrium sulfat dibeli dari Merck. DEAE Sepharose Fast Flow, Q
Sepharose Fast Flow, Sephadex G-25 berasal dari GE Healthcare. Ferric
amonium sitrat dibeli dari Alfa Aesar. Ekstrak ragi berasal dari Becton
Dickinson.
2.2. Ketegangan tuan rumah
NS E. coli 20 strain IBA 1 (F- lambda-ara (pro lac) rpsL thi recA cytR)
adalah turunan dari E. coli strain CSH50R. Ini adalah strain laboratorium
yang berasal dari E.coli K-12, Gram (-) bakteri negatif milik
Enterobacteriaceae keluarga. Ini adalah strain yang digunakan untuk
transformasi. Tumbuh dalam bentuk suspensi seragam dalam media cair LB
(lysogeny broth). Suhu pertumbuhan optimal adalah 37 °C. Strain juga
tumbuh pada medium minimal (MM) dengan adanya tiamin (2 g/ml) dan L-
prolin (dalam kisaran konsentrasi 50-200 g/ml). Strain membentuk koloni
bulat, rata, bermata halus pada substrat TSA (trypticase soy agar) yang kaya.
NSE. coli strain IBA 1 memiliki delesi pada operon prolinelaktosa. Mutasi
pada gen rpsL yang mengkode protein ribosomal S12 dikaitkan dengan
resistensi streptomisin (pertumbuhan pada media dengan streptomisin
pada konsentrasi akhir 50 mg/ml). Strain juga memiliki mutasi pada gen cytR
yang mengkode regulator transkripsi yang mengikat DNA. Dari sekuens gen,
panjangnya 1026 bp, dipotong 145 bp. Metode yang efisien untuk
memproduksi insulin manusia rekombinan menggunakanE. coli 20 strain
bakteri yang tidak memiliki represor cytR dijelaskan dalam paten Polandia
No. PL 180.818 [9].
2.3. Konstruksi gen insulin manusia
Ekspresi plasmid pIBAINS adalah turunan dari plasmid pBR322 [ATCC:
31344]. Secara singkat, pIBA dibuat dengan ligasi duaHindIII/SmaI fragmen
dan diamplifikasi oleh PCR, menggunakan plasmid pBR322 sebagai
template. Kemudian, dengan menggunakan metode PCR, 63 nukleotida
dengan situs kloning molekuler pendek dan terminator transkripsi sintetik
trpA (Pharmacia Biotech 1995) dimasukkan ke dalam plasmid ini. Plasmid
pIBA-1 yang dihasilkan dibelah denganEcoRI/NdeI dan kemudian fragmen
PCR 945 bp yang terdiri dari deoP1P2 promotor (juga dicerna dengan EcoRI/
NdeI) diligasi searah jarum jam untuk menghasilkan plasmid pIBA-2. Urutan
darideoP1P2 wilayah promotor diamplifikasi dari DNA kromosom E.coli
Strain K12 berdasarkan urutan nukleotida dari database gen [GenBank:
AP009048]. Plasmid pIBA-2 diperlakukan lebih lanjut denganNdeI/XbaI dan
diikat dengan 363 bpNdeI/XbaI insert, terdiri dari protein hibrida SOD_INS [
10]. Penggunaan kodon dari gen protein hibrida dioptimalkan untuk
ekspresi diE.coli.PIBAINS plasmid yang dihasilkan membawa resistensi
terhadap tetrasiklin. Inisiasi transkripsi berada di bawah kendaliE.coli
deoP1P2 promotor. NS
64
Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69
plasmid pIBAINS yang dibangun digunakan untuk mengubah E. coli 20 strain
diperoleh di Institut kami. Kami menggunakan IBAE. coli 20 strain dan vektor IBA
karena kepemilikan strain yang dipatenkan memungkinkan penemuan untuk
dikomersialkan.
2.4. Budaya sel
Sel bakteri untuk kultur berasal dari stok gliserol yang disimpan di
80 °C. E. coli 20 sel, menyimpan plasmid pIBAINS dengan manusia
gen insulin, ditumbuhkan selama 18 jam pada suhu 30 °C dalam labu
pengocok yang berisi 50 mL medium GMS [11] ditambah dengan tetrasiklin
(100 g/mL), prolin (600 g/mL) dan tiamin (2 g/mL) hingga kerapatan optik
pada 600 nm sekitar 0,5-1,0. Labu tersebut digunakan sebagai inokulum
untuk fermentor Bioflo Celligen 310 7,5 L (mulai GMS medium volume 4 L).
Dalam fermentor antibiotik tidak digunakan. Sel ditumbuhkan selama 15-16
jam pada 37 ° C. Selama tahap pertumbuhan kultur, 40% glukosa dan 12
mg/mL prolin ditambahkan secara eksponensial sebagai sumber karbon
(untuk mempertahankan kisaran konsentrasi glukosa 70-120 mg/dL). pH
dikontrol selama seluruh proses dengan penambahan 16% NH4OH. Ketika
OD 600 nm mencapai sekitar 25-35, pemberian glukosa dibatasi sampai
konsentrasinya dalam medium dikurangi menjadi 0 g/dL. Kemudian,
pemberian glukosa dihubungkan ke pompa dengan asam (kontrol pH-stat
menggunakan kaskade). Glukosa ditambahkan secara otomatis oleh
pengontrol setiap kali pH melebihi titik setel (pita mati adalah 0,01). Tingkat
glukosa dipertahankan oleh pH-stat dalam kisaran konsentrasi 30-50 mg/dL.
Setelah induksi, kultur ditumbuhkan selama 4-5 jam sampai OD 600 nm
sekitar 50-60, mencapai fase pertumbuhan stasioner.
2.5. Isolasi badan inklusi
Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 15.000 xg selama 15 menit pada
suhu 4 ° C. Sel-sel pelet disuspensikan dalam buffer lisis (50 mM Tris-HCl pH
8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,043% lisozim). Suspensi bakteri diaduk
perlahan selama 30 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan 20 ml
Triton X-100 dan suspensi diaduk selama 10 menit. Sel dilisiskan dengan
homogenizer bertekanan tinggi, dan disentrifugasi pada 18.400 xg selama
15 menit pada suhu 4 ° C. Pelet yang dihasilkan dicuci dengan 50 mM Tris-
HCl pH 8,0, 500 mM NaCl dan 1% Triton X-100 dan disentrifugasi lagi pada
18.400 xg selama 15 menit pada suhu 4 °C. Selanjutnya, pelet dicuci dua kali
dengan 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM buffer NaCl. Akhirnya, suspensi
badan inklusi disentrifugasi pada
15.000 xg selama 15 menit pada suhu 4 °C. Badan inklusi yang diperoleh dibekukan pada
suhu -30 ° C untuk persiapan lebih lanjut.
2.6. Pembubaran badan inklusi
Badan inklusi yang mengandung insulin dilarutkan dalam buffer karbonat 12
mM (NaHCO3) dengan 0.2 mM EDTA. PH larutan diatur menjadi sekitar 11,9
dengan NaOH 5 M dan diaduk selama 45 menit pada suhu kamar. Kemudian pH
diatur menjadi 10,8 dengan HCl 2 M. Akhirnya, suspensi disentrifugasi pada
24.000 xg selama 15 menit pada suhu 4 ° C untuk menghilangkan puing-puing
yang tidak larut.
2.7. renaturasi
Setelah larut, sampel dibiarkan terlipat selama periode 18 jam
berikutnya dengan pengadukan dan aerasi yang kuat. Pada akhir
renaturasi, pH diatur menjadi 9,0 dengan HCl 2 M. Renaturasi dipelajari
pada suhu kamar dan pada 8 °C.
2.8. Reaksi citrakonilasi
Prekursor insulin diperlakukan dengan citraconic anhydride untuk
mengontrol pencernaan enzimatik yang diperlukan untuk membentuk
insulin dan untuk mencegah degradasi insulin. 1 ml citrakonat anhidrida dan
5 M NaOH ditambahkan ke dalam larutan protein dalam porsi sehingga pH
M. Zielinski dkk.
solusinya tetap dalam kisaran 8,7-9,3. Jumlah anhidrida dihitung
menurut rumus: larutan 0,2 × V (dm3) x A280nm. Setelah penambahan
jumlah total citrakonat anhidrida, larutan diaduk selama 2,5 jam.
Kemudian ditambahkan 3 ml larutan etanolamin 2 M. Jumlahnya
dihitung menurut rumus: 3 × V citraconic anhydride dan dicampur
selama 45 menit.
2.9. Tripsinisasi
Setelah citrakonilasi pH larutan diatur menjadi 8,8 dengan HCl 2 M
dan diencerkan sehingga konduktivitasnya di bawah 5 mS. Kemudian
70 l larutan tripsin 1% ditambahkan dan larutan dicampur selama
sekitar 16-18 jam pada suhu kamar. Jumlah tripsin dihitung menurut
rumus: larutan A280 nm x V (dm3)/75. Reaksi dihambat dengan 1 mg/
ml aprotinin. Jumlah aprotinin yang ditambahkan dihitung dari rumus:
V tripsin/21.
2.10. Kromatografi tekanan rendah pada DEAE Sepharose
Sampel protein diterapkan ke kolom yang dikemas dengan DEAE
Sepharose dan diseimbangkan dengan 0,5 M Tris pH 8,6, diikuti oleh 20
mM Tris pH 8,6, sampel protein diterapkan. Setelah aplikasi, kolom
dibilas dengan buffer: DW I - 20 mM Tris pH 8,6 (konduktivitas 6 mS)
dan DW II - 20 mM Tris pH 8,6 + 20% isopropanol (konduktivitas 3 mS).
Insulin dielusi dengan buffer DE - 20 mM Tris pH 8,6 + 30% isopropanol
(konduktivitas 6 mS).
2.11. Desitrakonilasi
Fraksi utama yang dielusi dari kolom diencerkan 2 kali dengan H2O dan
pH diturunkan menjadi 2,9 dengan HCl 2 M. Sampel diaduk selama 1 jam
dan dibiarkan pada suhu 4 °C semalaman.
2.12. Pengendapan insulin
Larutan seng klorida 1M ditambahkan ke sampel dan pH diatur
menjadi 5,9. Larutan diaduk selama 1 jam. Jumlah seng klorida yang
ditambahkan dihitung menurut rumus: 2 × V cm3 solusi/100. Kemudian
sampel disentrifugasi pada 18.400 xg selama 15 menit pada suhu 4 °C.
Endapan dapat disimpan pada suhu 4 °C hingga 30 hari.
2.13. Melarutkan garam seng
Endapan insulin tersuspensi dalam air. Volume dihitung dari rumus:
jumlah total protein yang diperoleh setelah DEAE/7. Kemudian 1M Tris
pH 8,6 ditambahkan ke konsentrasi 30 mM dan 0,2 M EDTA (jumlah
yang dihitung dari rumus: jumlah total protein yang diperoleh setelah
DEAE/190). Konduktivitas sampel di bawah 3 mS.
2.14. Kromatografi tekanan rendah pada Q Sepharose
Sampel protein diaplikasikan pada kolom yang dikemas dengan Q
Sepharose dan diseimbangkan dengan 0,5 M Tris pH 8,6, diikuti oleh 20
mM Tris pH 8,6. Setelah aplikasi, kolom dibilas dengan buffer: QW - 20
mM Tris pH 8,6 + 20% isopropanol (konduktivitas 0,5 mS). Protein
dielusi dengan buffer QE1 - 20 mM Tris pH 8,6 + 30% isopropanol
(konduktivitas 0,42 mS) dan buffer QE2 - 20 mM Tris pH
8,6 + 30% isopropanol (konduktivitas 3 mS).
2.15. Reaksi dengan karboksipeptidase B
Fraksi utama yang dielusi dari kolom diencerkan 2 kali dengan H2O
dan 50 l karboksipeptidase B (2,5 mg/ml) ditambahkan (10 l untuk
setiap 150 AU protein total yang ditentukan dalam fraksi utama). PH
sampel diatur menjadi 8,8. Reaksi dilakukan untuk
65
Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69
16-18 jam pada suhu kamar.
2.16. Kromatografi RP-HPLC
Pemisahan dilakukan pada kolom ACE 5C18-300 menggunakan gradien
asetonitril. Fase gerak A: 2000 ml larutan natrium sulfat 0,2 M pH 2,3
dipanaskan sebelumnya dalam air hangat hingga 25 °C - 30 °C dengan 440
ml asetonitril, pH 2,3. Fase gerak B: 1250 ml larutan natrium sulfat 0,2 M pH
2,3 dipanaskan sebelumnya dalam air hangat hingga 25 °C - 30 °C dengan
1250 ml asetonitril, pH 2,3. Fraksi utama yang dielusi dari kolom diencerkan
3 kali dengan H2O dan kemudian insulin diendapkan dengan seng klorida.
2.17. Kromatografi Sephadex G-25
Endapan insulin disuspensikan dalam air dan pH diatur menjadi 3,0.
Untuk menukar buffer sampel, sampel protein diaplikasikan pada
kolom yang dikemas dengan Sephadex G-25 yang diseimbangkan
dengan 5 mM amonium asetat pH 4,0. Insulin dielusi dengan buffer
yang sama.
2.18. Pengukuran konsentrasi protein
Konsentrasi protein diukur pada panjang gelombang 280 nm.
Spektrofotometer dikalibrasi dengan air.
3. UHPLC kromatografi tandem spektrometri massa MALDI-
TOF/TOF
3.1. Kromatografi UHPLC
Pemisahan sampel dilakukan menggunakan Waters Acquity UHPLC
System dengan Software Empower 3, dilengkapi dengan ACQUITY UPLC®
CSH™ C18 1,7 m, kolom 2,1 × 50 mm. Analisis dilakukan pada 23 °C
pada laju aliran 0,713 ml/menit dan deteksi spektrofotometri pada 220
nm. Volume injeksi adalah 2 l. Gradien dua buffer A1 dan B1 digunakan.
Eluen A1 adalah 9,66 g NaH2PO4 x H2O dan 24,58 g NaClO4 x H2O dalam
1000 ml air, pH 2.5. Eluen B1 adalah 9,66 g NaH2PO4 x H2O dalam 1000
ml air, pH 2,5, dicampur dengan asetonitril 1:1 (v/v).
3.2. Spektrometri massa MALDI-TOF/TOF
Spektrum massa diperoleh menggunakan 4800 MALDI TOF/TOF analyzer
(Applied Biosystems). Instrumen dioperasikan dalam mode reflektor ion
positif. 0,5 l sampel diteteskan pada pelat 384 Opti-TOF MALDI dan dicampur
dengan 0,5 l larutan jenuh matriks alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid
(CHCA) dari Sigma-Aldrich, dilarutkan dalam 50:50 air/asetonitril dengan
0,1% TFA – konsentrasi akhir (Sigma-Aldrich). Kalibrasi dicapai dengan
campuran kalibrasi penganalisis proteomik 4700 yang disediakan oleh
Applied Biosystems. Perangkat Lunak Data Explorer, Versi 4.9, diterapkan
untuk memproses spektrum yang diperoleh.
Seluruh proses produksi insulin rekombinan diilustrasikan dalam
Gambar 1.
4. Hasil dan diskusi
4.1. Konstruksi genetik plasmid pIBAINS
Gen insulin manusia disusun menurut rumus berikut: LBXA. Dalam
rumus, L adalah peptida pemimpin yang diwakili oleh gen SOD yang
dimodifikasi, B adalah rantai insulin manusia B, X adalah peptida pendek
Lys-Arg yang menghubungkan rantai B dengan rantai A, A adalah rantai
insulin manusia A. Hal ini dijelaskan dalam paten [12]. PIBAINS plasmid,
ukuran 4354 bp, terdiri dari sekuens dan gen pengatur berikut: dari 7 bp
hingga 942 bp sebuah wilayah pengatur dengan promotor deoP1P2 terletak,
M. Zielinski dkk.
Gambar 1. Diagram blok dari proses untuk mendapatkan insulin manusia rekombinan dari E. coli 20 sel.
Gambar 2. Skema konstruksi untuk plasmid pIBAINS. Plasmid pIBAINS
mengandung protein hibrid SOD: gen INS di bawah kendalideoP1P2promotor.
Singkatan yang digunakan: deoP1P2 -deoP1P2 promotor; TetR - tahan tetrasiklin;
trpA - terminator transkripsi trpA; SOD - gen superoksida dismutase; Rantai, rantai
B - rantai gen insulin manusia; ORI - asal replikasi.
dari 946 bp hingga 1137 bp, ada urutan yang mengkodekan fragmen gen
SOD manusia, dari 1138 bp hingga 1299 bp urutan yang mengkodekan
Rantai A, B dan rantai C (dalam bentuk Lys-Arg linker) INS insulin
manusia rekombinan disertakan (urutan nukleotida insulin telah
diubah sesuai dengan frekuensi kodon dalam E.coli), dari 1312 bp
hingga 1338 bp, wilayah pengkodean terminator transkripsi ter trpA
berada, dari 1508 bp hingga 2698 bp, gen resistensi tetrasiklin Tet
berada. Struktur plasmid pIBAINS yang mengandung pengkodean gen
untuk protein insulin manusia rekombinan (insulin INS) ditunjukkan
secara skematis diGambar 2..
4.2. Budaya sel
Sebagai hasil dari E. coli 20 kultur sel dalam fermentor (dijelaskan dalam
Bahan & Metode) kami memperoleh sekitar 224 g biomassa basah (56 g dari
1 L media kultur). Contoh kurva pertumbuhan ditunjukkan padaGambar 3.
OD maksimum 600 nm adalah 54,4.
4.3. Isolasi badan inklusi
Setelah isolasi dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan
dalam Bahan & Metode, kami memperoleh sekitar 58 g badan inklusi
(14,5 g dari 1 L media kultur).
4.4. Pembubaran badan inklusi
Sebuah alikuot dari 17,9 g badan inklusi dilarutkan seperti yang dijelaskan
dalam Bahan & Metode dan kami memperoleh 5460 AU protein.
66
Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69
4.5. renaturasi
Dalam kasus renaturasi pada suhu kamar, hasil sekitar 95-96% dan
pada 7-8 °C hasil sekitar 99%. Kami memperoleh 5450 AU protein.
Proses pelipatan ulang selesai setelah 18-19 jam dan terbukti
bergantung pada potensial redoks dan nilai pH, tetapi tidak pada suhu.
4.6. Reaksi citrakonilasi dan tripsinisasi
Citraconic anhydride memungkinkan pemblokiran reversibel dari residu
asam amino Lys/Arg untuk melakukan pencernaan tryptic yang terkontrol.
Kebenaran reaksi citrakonilasi dan tripsinisasi diperiksa dengan
spektrometri massa.
4.7. Kromatografi tekanan rendah pada DEAE Sepharose
Segera setelah reaksi dengan tripsin, protein diaplikasikan pada
kolom yang diisi dengan DEAE Sepharose. Hasilnya, 250 ml fraksi
insulin diperoleh. Konsentrasi protein adalah 8,57 AU/ml. Sebuah
kromatogram dari DEAE Sepharose Fast Flow kromatografi insulin
ditunjukkan pada:Gambar 4.
4.8. Desitrakonilasi
Fraksi utama yang dielusi dari kolom diencerkan 2 kali dengan H2O dan
pH diturunkan menjadi 2,9 dengan HCl 2 M. Citraconic anhydride (2-
methylmaleic anhydride) digunakan untuk memblokir gugus amina primer
pada nilai pH basa (pH 7-9). Pada pH asam (3–4), ikatan amida dihidrolisis
dan asam sitratonat dilepaskan, menghasilkan amina asli.
4.9. Pengendapan insulin dan melarutkan garam seng
10 ml larutan seng klorida 1 M ditambahkan ke sampel dan pH
diatur menjadi 5,9. Larutan diaduk selama 1 jam. Setelah sentrifugasi
(seperti yang dijelaskan dalam Bahan & Metode) endapan insulin
disuspensikan dalam 285 ml air. Kemudian 9,2 ml 1 M Tris pH 8,6
ditambahkan ke konsentrasi 30 mM dan 11,3 ml 0,2 M EDTA.
4.10. Kromatografi tekanan rendah pada Q Sepharose
Segera setelah melarutkan garam seng, protein diaplikasikan pada
kolom yang diisi dengan Q Sepharose. Hasilnya, diperoleh 226 ml fraksi
insulin. Konsentrasi protein adalah 2,77 AU/ml. Kromatogram dari Q
Sepharose Fast Flow kromatografi insulin ditunjukkan padaGambar 5.
4.11. Reaksi dengan karboksipeptidase B dan kromatografi RP-HPLC
Carboxypeptidase B mengkatalisis hidrolisis lisin dan arginin
M. Zielinski dkk. Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69

Gambar 3. Escherichia coli 20 kurva pertumbuhan. Nilai sumbu X adalah jam budaya, nilai sumbu y adalah kerapatan optik (OD) 600 nm.

Ara. 4. Kromatogram dari DEAE

Sepharose Fast Flow kromatografi insulin.
Langkah pertama adalah 3 CV 100% DW I dan 3
CV 100% DW II untuk mengelusi protein yang
tidak terikat. Langkah kedua adalah 2 CV DE
100% untuk mengelusi protein yang diinginkan.
Puncak insulin berkisar antara 2650 hingga 3200
ml (sumbu x). Langkah selanjutnya adalah 2 CV
dari 1 M NaCl dan kemudian 0,5 M NaOH untuk
mengelusi semua protein dari kolom. Penyangga
DW I: 20 mM Tris pH 8,6 (konduktivitas 6 mS),
penyangga DW II: 20 mM Tris pH 8,6 + 20%
isopropanol (konduktivitas 3 mS), penyangga DE:
20 mM Tris pH 8,6 + 30% isopropanol
(konduktivitas 6 mS ), aliran: 15 ml/menit.

Gambar 5. Kromatogram dari Q Sepharose Fast

Flow kromatografi insulin. Langkah pertama
adalah 2 CV 100% QW untuk mengelusi protein
yang tidak terikat. Langkah kedua adalah 2 CV
dari 100% QE I untuk mengelusi protein yang
terikat lemah dan 2 CV dari 100% QE II untuk
mengelusi protein yang diinginkan. Puncak
insulin adalah dari sekitar 1400 hingga 1800 ml
(sumbu x). Langkah selanjutnya adalah 1 CV 1 M
NaCl dan kemudian 0,5 M NaOH untuk mengelusi
semua protein dari kolom. Buffer QW: 20 mM Tris
pH 8,6 + 20% isopropanol (konduktivitas 0,5 mS),
buffer QE I: 20 mM Tris pH 8,6 + 30% isopropanol
(konduktivitas 0,42 mS), buffer QE II: 20 mM Tris
pH 8,6 + 30% isopropanol (konduktivitas 3 mS),
aliran: 10 ml/menit.

(peptida pendek Lys-Arg yang menghubungkan rantai B dengan rantai A).
Setelah reaksi dengan karboksipeptidase B dijelaskan dalam Bahan &
Metode, sampel diaplikasikan pada kolom RP-HPLC ACE 5C18-300. Hasilnya,
diperoleh 97 ml fraksi insulin. Konsentrasi protein adalah 2,42 AU/ml.
Sebuah kromatogram dari kromatografi RP-HPLC insulin ditunjukkan pada:
Gambar 6.
4.12. Kromatografi Sephadex G-25
Untuk menukar buffer sampel dan menghilangkan sisa asetonitril,
sampel protein diaplikasikan pada kolom yang dikemas dengan Sephadex
G-25 yang diseimbangkan dengan 5 mM amonium asetat pH 4,0. Hasilnya,
31 ml fraksi insulin diperoleh. Konsentrasi protein adalah 3,59 AU/ml.

67
M. Zielinski dkk. Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69

Gambar 6. Kromatogram dari RP-HPLC. Insulin

dimurnikan dalam kondisi isokratik - fase gerak A:
2000 ml larutan natrium sulfat 0,2 M pH 2,3
dipanaskan dalam air hangat hingga 25 °C - 30 °C
dengan 440 ml asetonitril, pH 2,3. Fase gerak B:
1250 ml larutan natrium sulfat 0,2 M pH 2,3
dipanaskan sebelumnya dalam air hangat hingga
25 °C - 30 °C dengan 1250 ml asetonitril, pH 2,3.
Panjang gelombang detektor: 214 nm. Puncak
insulin adalah dari sekitar 90 hingga 105 menit
(sumbu x).

Gambar 7. Analisis UHPLC dari insulin manusia rekombinan yang dimurnikan. Nilai RT insulin adalah 3,748 menit. Kemurnian protein sekitar 99%.

Gambar 8. Spektrum massa insulin manusia rekombinan. Berat molekul yang diperoleh untuk insulin dengan metode ESI-MS adalah 5807,5 Da. Massa yang dihitung secara teoritis adalah 5807,63 Da.

4.13. Ringkasan pemurnian 5. Kesimpulan

Pada akhir seluruh proses, kami memperoleh rata-rata 2700 IU insulin
manusia rekombinan dengan kemurnian 99% dari 1L media kultur dengan
prosedur pemurnian tiga langkah yang terdiri dari DEAE/Q Sepharose dan
kromatografi RP-HPLC. Berat molekul yang diperoleh untuk insulin dengan
metode ESI-MS adalah 5807,5 Da. Massa rata-rata yang dihitung secara
teoritis adalah 5807,63 Da. Contoh hasil UHPLC dan spektrometri massa
ditunjukkan pada:Gambar 7 dan Gambar 8.
Diabetes termasuk dalam apa yang disebut “gaya hidup” atau “penyakit peradaban”
– ini merupakan ancaman utama bagi kesehatan dan kesejahteraan manusia secara
global. Sampai saat ini, metode yang paling efektif untuk mengobati penyakit ini pada
kasus hiperglikemia adalah pemberian insulin. Dengan demikian, penting untuk
menetapkan protokol yang efektif dan ekonomis untuk produksi insulin. Sebagai
kesimpulan, kami melaporkan di sini pembangunan vektor ekspresi pIBAINS baru dan
pembentukan strain inang bakteri baruE. coli 20, yang mampu memproduksi insulin
manusia dengan efisiensi tinggi. NS

68
M. Zielinski dkk.
plasmid tidak berintegrasi ke dalam genom dan tetap stabil setidaknya
selama 80 generasi tanpa pemilihan antibiotik. Kami menggambarkan
seluruh proses dari kultur sel melalui isolasi tubuh inklusi dan
pembubaran hingga pemurnian protein. Dalam kasus renaturasi pada
suhu kamar, hasil sekitar 95-96% dan pada suhu 7-8 °C hasil sekitar
99%. Proses pelipatan ulang selesai setelah 18-19 jam dan terbukti
bergantung pada potensial redoks dan nilai pH, tetapi tidak pada suhu.
Sebagai hasil kultur bakteri, kami memperoleh rata-rata 56 g biomassa
basah dan 14,5 g badan inklusi, sedangkan pada akhir keseluruhan
proses rata-rata 2700 IU insulin manusia rekombinan dengan
kemurnian hingga 99% dari 1 L media kultur dengan prosedur
pemurnian tiga langkah yang terdiri dari DEAE/Q Sepharose dan
kromatografi RP-HPLC,13]. Manfaat menggunakan kamiE. coli 20 strain
adalah bahwa kepemilikan strain yang dipatenkan memungkinkan
penemuan untuk dikomersialkan di pasar industri farmasi. Menurut
perkiraan MFD, persentase pasien diabetes pada populasi dewasa
Polandia akan meningkat menjadi sekitar 11% selama 20 tahun ke
depan. Populasi ini mungkin di masa depan menjadi penerima hasil
proyek kami.
Referensi
[1] M. Bliss, Penemuan Insulin, University of Chicago Press, Chicago, 1982 155 p.
69
Ekspresi dan Pemurnian Protein 157 (2019) 63–69
[2] https://www.idf.org.
[3] W. Landgraf, J. Sandow, insulin manusia rekombinan – kemanjuran klinis dan keamanan
dalam terapi diabetes, Eur. Endokrinol. 12 (1) (2016) 17-12.
[4] P. Wang, NM Fiaschi-Taesch, RC Vasavada, DK Scott, A. García-OcanA,
AF Stewart, Diabetes mellitus-kemajuan dan tantangan dalam proliferasi sel
manusia, Nat. Pdt. Endokrinol. 11 (4) (2015) 201–212.
[5] R. Hilgenfeld, G. Seipke, H. Berchtold, DR Owens, Evolusi glargine insulin dan kontribusinya
yang berkelanjutan untuk perawatan diabetes, Obat-obatan 74 (8) (2014) 911-927.
[6] YS Cheng, DY Kwoh, TJ Kwoh, BC Soltvedt, D. Zipser, Stabilisasi protein yang dapat
terdegradasi dengan ekspresi berlebih di Escherichia coli, Gen 14 (1–2) (1981) 121–
130.
[7] YA. Cheng, Pemisahan kepadatan bakteri penghasil protein yang berlebihan, paten
Amerika Serikat US 4, 480, 038, 1984.
[8] JH Miller, Eksperimen dalam Genetika Molekuler, Cold Spring Harbor N. Y, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1972 466 p.
[9] Hartman JR, Mendelovitz S., Gorecki M.: Sposób Wytwarzania Insuliny Ludzkiej, Oraz
Polipeptyd Hybrydowy. BIO-TEKNOLOGI GENERAL CORR, Iselin (AS), Patent PL
180818.
[10] RA Hallewell, FR Masiarz, RC Najarian, JP Puma, MR Quiroga, A. Randolph, et al.,
Manusia Cu/Zn superoksida dismutase cDNA: isolasi klon yang mensintesis enzim
aktif atau tidak aktif tingkat tinggi dari perpustakaan ekspresi, Res Asam Nukleat .
13 (6) (1985) 2017–2034.
[11] Jr. Hartman, S. Mendelovitz, M. Gorecki, Generasi Insulin Manusia, Internasional
nomor publikasi: Worldwide International Property Organization WO96/20724 A1.
[12] P. Borowicz, A. Płucienniczak, J. Mikołajczyk, T.Glabski, D. Kurzynoga, D. Mikiewicz-
Syguła, dkk. Analog insulin baru dari aktivitas berkepanjangan. Aplikasi Paten Eropa
EP 2321344A2, 2009.
[13] NA Baeshen, MN Baeshen, A. Sheikh, dkk., Pabrik sel untuk produksi insulin, Microb.
Pabrik Sel 13 (2014) 141.