LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

’’ ANTIOKSIDAN FRAKSI ’’

Disusun Oleh :

Alisa Adistia D (19012035)

Desi Kristina P (19012037)

S1 RK-B Semester 5

Dosen Pengampu: Lilik Sulastri,M.Farm

Tempat Praktikum : Laboratorium STTIF Bogor

PROGRAM STUDI S1 FARMASI REGULER KHUSUS

SEKOLAH TINGGI TEKNOLOGI INDUSTRI DAN FARMASI
BOGOR
2021
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa reaktif yang
secara umum diketahui sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak
berpasangan di kulit terluarnya (Winarsi,2007). Radikal bebas merupakan
atom molekul yang memiliki kereaktifantinggi, hal ini dikarenakan adanya
elektron yang tidak berpasangan. Keberadaan radikal bebas yang bersifat
sangat reaktif dan tidak stabil dalam tubuh dapat mengakibatkan kerusakan
seluler, jaringan, dan genetik (Rohmatussolihat,2009).

Tubuh manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal radikal

bebas, yang secara kontinyu dibentuk sendiri oleh tubuh. Bila jumlah senyawa
oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh, kelebihnnya
akan menyerang komponen lipid, protein, maupun DNA sehingga akan
mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif (Winarsi,
2007). Tubuh memiliki sistem pertahanan alami untuk menetralisir radikal
bebas agar tidak berkembang dan menjadi berbahaya bagi tubuh. Namun,
tidak mampu menghadapi radikal bebas yang berjumlah besar. Sebab itu,
tubuh kita memerlukan suatu substansi penting yang dapat membantu
melindungi tubuh dari serangan radikal bebas yakni dengan pemberian
antioksidan atau dengan mengkonsumsi antioksidan (Toripah, et al., 2014).

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan

efek buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Berdasarkan sumbernya,
terdapat dua macam antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan
sintetik (buatan) (Dalimartha dan Sudibyo, 1999). Suatu antioksidan
umumnya memiliki kelebihan pasangan elektron bebas sehingga dapat
menyumbangkan elektronnya kepada suatu radikal dan dapat menstabilkan
radikal tersebut sehingga tidak lagi reaktif.

1.2 Tujuan Praktikum

1. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi sampel daun
ketepeng dan daun lamtoro dengan metode DPPH.
2. Mengukur aktivitas antioksidan fraksi sampel daun ketepeng dan
daun lamtoro dengan metode DPPH berdasarkan nilai IC50.
 BAB II
DASAR TEORI
2.1 Antioksidan
Definisi antioksidan secara umum adalah senyawa yang melawan
oksidasi atau menghambat reaksi yang dipicu oleh oksigen atau peroksida.
Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet
dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk
makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak
diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi) (Huang, Ou, dan Prior,
2005).
Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila
dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi,
dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell,
1994).
Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat
dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik.
Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoxyde
dismutase (SOD); glutation peroksidase, katalase, tioredoksin reduktase
dan peroksiredoksin (Masella, Di Benedeto, Vari, Filesi, dan Giovannini,
2005). Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat
cara, yaitu sebagai :
a) Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E.
b) Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA.
c) Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen.
d) Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai
kofaktor glutation peroksidase (Huang et al., 2005).

Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan

meliputi tiga mekanisme sebagai berikut :
a) Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS)
ataupun radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·,
RO·, dan ROO· dengan proses transfer elektron melalui atom
hidrogen.
b) Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal
seperti reaksi melalui khelasi metal.
 c) Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan
penggabungan dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi,
2000).

Antioksidan dan peredam radikal bebas biologis dapat

digolongkan sebagai berikut (Grieb, 1992 dan Himawati, 2001) :
a. Berdasarkan sasaran
 Preventative antioxidant, yaitu antioksidan yang dapat
mencegah terbentuknya oksidan dan mencegah
tertimbunnya oksidan. Misalnya : superoksida dismutase
(SOD), katalase, bermacam-macam enzim peroksidase
(misalnya glutation peroksidase), dan senyawa yang
mengandung gugusan sulfidril (glutation, sistein, dan
kaptopril).
 Chain-breaking antioxidant, mekanismenya sebagai berikut.
L· + AH → LH + A·
LO· + AH → LOH + A·

LOO· + AH → LOOH + A·
Antioksidan (AH) akan mencegah dua tahapan meliputi
tahapan inisiasi terjadi ketika radikal beraksi dengan Lipid (L) dan
proses propagasi (beraksi dengan alkoksi (LO·) ataupun peroksil
(LOO·) (Madhavi et al., 1996).
b. Berdasarkan mekanisme kerja
 Antioksidan enzimatik, misalnya : katalase (CAT),
superoxyde dismutase
(SOD), dan glutation peroksidase (GSH-Px).
 Antioksidan non-enzimatik, misalnya: vitamin E (α-
tokoferol), vitamin C (asam askorbat), dan β-karoten.
 c. Berdasarkan sifat-sifat fisiko-kimia
 Antioksidan hidrofilik, yaitu antioksidan yang bekerja
dalam sitosol dan cairan ekstrasel, misalnya: vitamin C,
asam urat, glutation, sistein, kreatinin.
 Antioksidan lipofilik, yaitu antioksidan yang bekerja
pada membran sel (terlarut dalam lipid membran),
misalnya: vitamin E, β-karoten, ubikuinon, bilirubin,
protein pengikat logam (transferin, laktoferin,
seruloplasmin, dan albumin).

2.2 Metode Pengujian Antioksidan

Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara
kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui
apakah suatu senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan
dengan metode kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kertas. Metode ini dapat untuk memisahkan campuran
antioksidan yang kompleks sekalipun.
Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan
menjadi empat kelompok, yaitu :
a) senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika
tereduksi (kalium permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil,
dan asam fosfomolibdat);
b) senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti
senyawa diazo, pereaksi diazo, magnesium sulfat,
anisaldehid, vanillin dan pereaksi Gibbs yang membentuk
indofenol (akan membentuk garam berwarna dalam kondisi
basa);
c) radikal bebas stabil yang menerima radikal hydrogen dari
antioksidan (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil);
d) senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang
berwarna (paladium klorida) (Davidek, 1997).
 Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri.
Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan
adalah sebagai berikut :
a) Pengujian penangkapan radikal (radical scavenging test)
Uji ini dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal
sintetik dalam pelarut organik polar seperti metanol atau etanol dalam
suhu kamar. Radikal sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil). Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa
untuk menangkap radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet pada
panjang gelombang 517 nm. Penangkapan radikal bebas menyebabkan
elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan
penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang
diambil.

Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal

DPPH oleh antioksidan

b) Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat tiosianat

Prinsip : pengukuran intensitas warna kompleks
feritiosianat yang terbentuk dari reaksi ion feri dengan amonium
tiosianat. Ion feri terbentuk dari oksidasi ion fero oleh peroksida
yang berasal dari oksidasi asam linoleat. Kompleks feritiosianat
yang berwarna merah diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah
yang terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak
peroksida yang terbentuk. Dengan adanya senyawa yang
berperan sebagai antioksidan intensitas warna yang terbentuk
semakin rendah.
 c) Pengujian dengan asam tiobarbiturat,

Prinsip uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam

tiobarbiturat menghasilkan kromogen merah muda yang dapat
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm.
Malondialdehid terbentuk dari asam lemak bebas tidak jenuh
dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap. Adanya
senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat
terbentuknya malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh.

d) Pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat

Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan
pemucatan warna β- karoten. Karotenoid dapat meredam oksigen
yang reaktif menghasilkan oksigen yang lebih stabil. Energi dari
oksigen tersebut dipindahkan ke senyawa karotenoid. Energi
tersebut dilepaskan melalui interaksi rotasional dan vibrasional
antara karotenoid dengan pelarut untuk mengembalikan
karotenoid ke ground state.

Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen

reaktif

2.3 Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model
dalam penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Windono et al., 2001).
DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom
N di tengah) serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat
mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian
 aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis,
Maderia, dan Almeida, 1994).
Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH
memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya
menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas,
maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah
elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat
mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning
(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).
Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan
secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai
penangkap radikal bebas (Dinis, et al., 1994). DPPH merupakan
metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas
antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van
Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002).

Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan (Windono et

al., 2001).

2.4 Daun Ketepeng

Klasifikasi Tanaman

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae (suku polong-polongan)

Genus : Cassia

Spesies : Cassia alata L.

2.5 Daun Lamtoro

Klasifikasi Tanaman

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Sub Divisio : Spermatophyta

Kelas : Magnolipsida

Ordo : Fabales

Suku : Fabaceae

Genus : Leucaena

Spesies : Leucaena leucocephal

 BAB III
ALAT DAN BAHAN
3.1 Daun Ketepeng
a) Alat
- Neraca analitik
- Labu ukur 50 ml
- Labu ukur 100 ml
- Pipet volume
- Balp
- Spatel
- Batang pengaduk
- Beaker glass
- Tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Botol semprot
- Spektrofotometri
- Kuvet

b) Bahan
- Sampel hasil partisi ketepeng fraksi etil asetat
- Methanol
- DPPH
- DMSO
- Alumunium foil

3.2 Daun Lamtoro

a) Alat
- Neraca analitik
- Labu ukur 50 ml
- Labu ukur 100 ml
- Pipet volume
- Balp
- Spatel
- Batang pengaduk
- Beaker glass
- Tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Botol semprot
- Spektrofotometri
- Kuvet

b) Bahan
- Sampel hasil partisi lamtoro fraksi air
- Methanol
- DPPH
- DMSO
- Alumunium foil
 BAB IV
METODE KERJA
4.1 Daun Ketepeng
1. Sampel partisi ketepeng ditimbang 0,1 gram dalam beaker glass.
2. Ditambahkan DMSO 1 ml, aduk hingga homogen.
3. Larutan tersebut dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml, ad
aquades sampai tanda batas (1000 ppm).
4. Dibuat deret konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160
ppm dan 320 ppm
5. Masing-masing larutan deret konsentrasi tersebut dipipet 3 ml ke
dalam tabung reaksi dan ditambah 3 ml DPPH.
6. Tabung reaksi ditutup dengan alumunium foil dan inkubasi
dalam ruangan tertutup selama 30 menit.
7. Di ukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri
UV-Vis.

4.2 Daun Lamtoro

1. Sampel partisi lamtoro ditimbang 0,1 gram dalam beaker glass.
2. Ditambahkan DMSO 1 ml, aduk hingga homogen.
3. Larutan tersebut dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml, ad
aquades sampai tanda batas (1000 ppm).
4. Dibuat deret konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160
ppm dan 320 ppm.
5. Masing-masing larutan deret konsentrasi tersebut dipipet 3 ml ke
dalam tabung reaksi dan ditambah 3 ml DPPH.
6. Tabung reaksi ditutup dengan alumunium foil dan inkubasi
dalam ruangan tertutup selama 30 menit.
7. Di ukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri
UV-Vis.
 BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil Data Pengamatan Daun Ketepeng
a. Perhitungan deret konsentrasi
Larutan induk = 1000 ppm
Larutan deret konsentrasi (menggunakan labu ukur 50 ml)
- 10 ppm
V1 . N1 = V2 . N2
X . 1000 = 50 . 10
50. 10
X= = 0.5 ml
1000
- 20 ppm = 1 ml
- 40 ppm = 2 ml
- 80 ppm = 4 ml
- 160 ppm = 8 ml
- 320 ppm = 16 ml

b. Pengamatan absorbansi antioksidan

%
konsentrasi 1 2 3 rata-rata
inhibisi
10 1.488 1.492 1.480 1.487 26.988
20 1.492 1.488 1.488 1.490 26.856
40 1.429 1.425 1.425 1.426 29.965
80 1.351 1.339 1.331 1.341 34.168
160 1.435 1.425 1.414 1.424 30.053
320 2.038 1.950 1.864 1.951 4.213
blanko 2.027 2.038 2.044 2.036  
 Perhitungan % inhibisi
blanko− sampel
% Inhibisi = x 100 %
blanko
- 10 ppm
2.036− 1.487
% Inhibisi = x 100 % = 26.988 %
2.036

- 20 ppm = 26.856 %
- 40 ppm = 29.965 %
- 80 ppm = 34.168 %
- 160 ppm = 30.053 %
- 320 ppm = 4.213 %
50. 10
1000

IC50 = y = 50
Y = -0.0724X + 32.971
50 = -0.0724X + 32.971
X = (50-32.971) / -0.0724
X = -235.20718

5.2 Hasil Data Pengamatan Daun Lamtoro

a. Perhitungan deret konsentrasi
Larutan induk = 1000 ppm
Larutan deret konsentrasi (menggunakan labu ukur 50 ml)
- 10 ppm
V1 . N1 = V2 . N2
X . 1000 = 50 . 10
50. 10
X= = 0.5 ml
1000
- 20 ppm = 1 ml
 - 40 ppm = 2 ml
- 80 ppm = 4 ml
- 160 ppm = 8 ml
- 320 ppm = 16 ml

c. Pengamatan absorbansi antioksidan

%
konsentrasi 1 2 3 rata-rata
inhibisi
10 1.323 1.321 1.321 1.322 35
20 1.514 1.476 1.460 1.483 27.17
40 1.411 1.404 1.405 1.407 30.91
80 1.386 1.391 1.361 1.379 32.27
160 1.367 1.349 1.326 1.347 32.52
320 1.307 1.309 1.307 1.308 35.78
blanko 2.027 2.038 2.044 2.036  

Perhitungan % inhibisi
blanko− sampel
% Inhibisi = x 100 %
blanko
- 10 ppm
2.036− 1.322
% Inhibisi = x 100 % = 35 %
2.036

- 20 ppm = 27.17 %
- 40 ppm = 30.91 %
- 80 ppm = 32.27 %
- 160 ppm = 32.52 %
- 320 ppm = 35.78 %
 Hubungan % Inhibisi dengan Konsentrasi
40.00
35.00
f(x) = 0.01 x + 30.74
30.00 R² = 0.32
% Inhibisi 25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
0 50 100 150 200 250 300 350
Konsentrasi

IC50 = y = 50
Y = 0.0147X + 30.736
50 = 0.0147X + 30.736
X = (50-30.736) / 0.0147
X = 1310.476

5.3 Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pengujian antioksidan
fraksi pada masing-masing sampel yaitu ketepeng fraksi etil asetat
dan lamtoro fraksi air. Metode yang digunakan untuk pengujian
antioksidan pada penelitian ini adalah metode DPPH (1,1 difenil-2-
pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini, kemampuan antioksidan
suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC50. Metode DPPH
memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu
radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang
gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal
bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian
menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah
elektron yang diambil (Sunarni, 2005). Nilai IC50 adalah parameter
konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% aktivitas antioksidan.
Pertama pembuatan larutan uji, larutan uji dibuat dengan
konsentrasi 1000 ppm sebagai larutan induk. Penyiapan larutan uji
 dilakukan dengan menimbang masing-masing sampel yaitu fraksi
ketepeng etil asetat dan fraksi lamtoro air sebanyak masing-masing 100
mg, dimasukan ke dalam masing-masing labu ukur 100 ml, ditambah
DMSO 1 ml dan ditambah air sampai 100 ml lalu di kocok hingga
homogen. Setelah itu, masing-masing sampel dibuatkan menjadi larutan
uji 1 0 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 8 0 ppm, 160 ppm dan 320 ppm.
Kemudian dilakukan operating time. Operating time
dilakukan dengan cara dipipet 3ml masing-masing fraksi uji dari
masing-masing sampel ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan
3 ml larutan DPPH. Inkubasi semua tabung reaksi dengan ditutup
alumunium foil di dalam ruang tertutup selama 30 menit. Kemudian
diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri UV-
Vis.
Hasil pengukuran absorbansi dengan menggunakan
spektrofotometer UV- Vis digunakan untuk menghitung persentase
peredaman radikal bebas DPPH (% inhibisi). Persen peredaman
radikal bebas DPPH dihitung dengan menggunakan rumus :
blanko − sampel
% Inhibisi = blanko x 100 %

Daya aktivitas antioksidan fraksi masing-masing dihitung nilai IC50

menggunakan analisis regresi linear
Y = a +bx

Hasil perhitungan dimasukkan kedalam persamaan regresi dengan

konsentrasi ekstrak sebagai absis ( sumbu X) dan presentase peredaman
sebagai ordinatnya (sumbu Y). Hasil analisis regresi linear berupa nilai x,
dimasukkan ke dalam rumus IC50 = Antilog x dan ditentukan dengan
tingkat kekuatan antioksidan berdasarkan nilai IC50.
 BAB VI
PENUTUP
6.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat ketepeng
berdaya antioksidan lebih kuat dati fraksi air lamtoro karena memiliki nila
IC50 lebih kecil.
6.2 Saran
Bagi peneliti selanjutnya dapat melakukan pengujian antioksidan
menggunakan metode pengujian yang lain dan metode ekstraksi yang berbeda
pula.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim,1985. Cara pembuatan simplisia. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta

--------,1986.Sediaan Galenik. Departemen Kesehatan

Republik Indonesia. Jakarta
 --------,1995.Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta. Departemen
Kesehatan Republik Indonesia
--------.1997. Materia Medika Indonesia. Jilid II. Departemen
Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta.
--------,2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat
Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia

--------,2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi I. Jakarta :

Departemen Kesehatan Republik Indonesia

Agoes, G.2009.Teknologi Bahan Alam.ITB.Bandung

Balachandran, S., S. E. Kentish and R. Mawson. 2006. The effect of
both preparation method and season on the supercritical
extraction of ginger. Sep. Purif. Technol. 48 (2)

Can-ake,R.,Gilda
E.R.,Filogonio,M.P.,and Luis,M.P.2004.Bioactive terpenoids
from roots and leaves of Jatropha gaumeri.Rev Soc Quim
Mex.48