Ringkasan.

Fraksinasi subselular merupakan teknik penting untuk analisis proteom

fungsional. Dalam penelitian saat ini, dilakukan cara peningkatan untuk isolasi protein
membran integral, karena ini sangat penting untuk fungsi otak. Dengan menguji 2 cara
terhadap kapasitasnya untuk memperkaya protein membrane yang adad ala fraksi
membrane dan organel. Yaitu dengan cara:
1. didasarkan pada pelarutan sekuensial menggunakan peningkatan dari kondisi
chaotropic seperti urea, sehingga mempartisi protein hidrofobik dari yang
hidrofilik.
2. Menerapkan pencucian tinggi garam dan pH tingi untuk menghilangkan protein
non membrane.

Pengayaan membran protein dengan prosedur ini, dibandingkan dengan membran asli
dan fraksi organel, dievaluasi dengan 16-BAC-SDS-PAGE diikuti dengan spektrometri
massa dari titik-titik yang dipilih secara acak.

*daktau pake dak Dalam fraksi yang larut dalam urea, 4 dari 33 protein yang
diidentifikasi terwakili protein membran integral, dan 10 adalah protein membran
perifer. 45 protein yang diidentifikasi adalah protein membran integral dan 13
mewakili protein membran perifer. Selama analisis, beberapa protein yang terlibat
dalam neuroeksositosis terdeteksi, termasuk syntasin, NSF, dan protein interaksi
Rab3 2. 

-Pengantar

Identifikasi sebagian besar gen dalam banyak organisme model, dalam kombinasi
dengan kemajuan dalam teknik pemisahan protein dan peptida dan spektrometri
massa, menawarkan potensi untuk melakukan analisis profil protein ekstensif .
Kemungkinan lebih dari 100.000 isoform protein yang berbeda ada dalam sel dan
menampilkan rentang dinamis 7-10 kali lipat dalam konsentrasi . Mereka
diasumsikan membentuk sekitar 20-30% protein seluler dan terbagi dalam dua
kelompok

Protein membran integral mengandung domain transmembran, sedangkan protein

membran perifer berhubungan dengan membrane jangkar atau melalui non-kovalen
mengikat protein membran integral. Protein membran terlibat dalam banyak proses
seluler yang penting, misalnya transpor aktif, aliran ion, transduksi energi, atau
transduksi sinyal. Dalam sistem saraf, protein membran sangat penting untuk proses
fundamental seperti pembentukan sirkuit saraf dan transmisi saraf. Contohnya termasuk
reseptor neurotransmiter, saluran ion, transporter, dan protein dari mesin
neuroexocytosis.
Beberapa cara telah dibuat untuk meningkatkan protein membran. Salah satu cara
tersebut menerapkan
 pencucian tinggi garam dan pH tinggi pada sampel protein dengan menghilangkan
protein sitosol dan luminal . Selain itu, penanganan ini menurunkan jumlah protein
membran perifer dengan mengurangi interaksi protein-protein non-kovalen .
Akhirnya, pH tinggi menyebabkan penghilangan ikatan aktin melalui
depolimerisasinya .
 Pendekatan lain didasarkan pada pelarutan sekuensial protein mencakup empat
langkah pelarutan dengan peningkatan selanjutnya dari kondisi chaotropic,
sehingga memisahkan protein hidrofobik dari yang hidrofilik.

Kami baru-baru ini menetapkan cara untuk fraksinasi subselular dari sejumlah kecil
sampel biopsi, misalnya 500 mg jaringan otak . menghasilkan tiga fraksi: fraksi inti,
fraksi sitosol, dan membran komposit dan fraksi organel (M=O-fraksi).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan protein membran integral dari
fraksi M=O. Untuk mengejar tujuan kami, pertama-tama kami meningkatkan hasil
membran dan organel dengan menambahkan langkah ekstraksi ulang ke protokol
sentrifugasi diferensial awal. kemudian menerapkan fraksi M=O baik pada cara pelarutan
sekuensial atau pada pencucian dengan pH tinggi dan garam tinggi.
Untuk mengevaluasi pengayaan periferal dan integral protein membran dengan dua
prosedur, sampel protein dipisahkan oleh 16-BAC- SDS-PAGE, dan bintik-bintik yang
dipilih secara acak diidentifikasi dengan matriks dibantu laser desorpsi = ionization-time
of flight (MALDI-TOF) spektrometri massa.

Bahan dan metode

Hewan
Tikus Sprague-Dawley (berusia 8-9 minggu dari kedua jenis kelamin) dibius dalam dengan injeksi
peritoneal 700 mg=kg chloral hydrate dan dikorbankan dengan pemenggalan kepala. Batang otak yang
diisolasi segera dibekukan dalam nitrogen cair dan kemudian disimpan pada suhu 80 C.
Bahan kimia
Asetonitril dan asam trifluoroasetat dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman) dan asam a-siano-4-hidroksisinamat dari
Bruker Daltonics (Bremen, Jerman).
Prefraksiasi subselular
Jaringan beku (2 g) dipindahkan ke 4 ml buffer CLB dan dihomogenisasi . Suspensi diinkubasi di atas es selama 10
menit, diikuti dengan 6 langkah homogenizer bermotor pada 250 rpm. Setelah restorasi dengan 0,1 volume 2,5 M
sukrosa sentrifugasi diferensial dilakukan pada 6.300 g selama 10 menit. Supernatan dikumpulkan dan disimpan
dalam es. Sedimen disuspensikan kembali dalam 4 ml buffer CLB isotonik, yang mengandung 0,1 volume 2,5 M
sukrosa, dan disentrifugasi pada 6.300 g selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan digabungkan dengan
supernatan pertama dan diendapkan pada 107.000 g selama 30 menit dalam rotor Beckman SW40. Sedimen yang
dihasilkan mewakili fraksi M=O(fraksi organel) dan disimpan pada suhu 80 C sampai digunakan lebih lanjut.

Tes enzim penanda

Jumlah protein ditentukan dengan menggunakan metode Bradford (1976) dengan albumin serum sapi sebagai
standar. Enzim penanda untuk berbagai kompartemen seluler adalah sebagai berikut: alkaline phosphatase [EC
3.1.3.1] digunakan sebagai penanda membran plasma (Graham, 1993), dan suksinat dehidrogenase [EC
1.3.5.1] sebagai penanda mitokondria (Graham, 1993). ). Semua hasil mewakili nilai rata-rata standar deviasi

dari tiga percobaan independen.

Pelarutan protein berurutan

 Pelarutan protein berurutan dilakukan dengan sedikit modifikasi. Fraksi M=O disuspensikan kembali dalam
buffer yang mengandung 40 mM Tris, pH 9,5 (Tris-buffer) dan kemudian disentrifugasi pada 24.000 g
selama 10 menit. Supernatan mewakili protein yang larut dalam Tris. Endapan disuspensikan kembali
dalam urea 8 M,4% (w=v) 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]- 1-propanesulfonate (CHAPS), dan
40 mM Tris, pH 9.5.
 Setelah sentrifugasi di bawah kondisi yang sama seperti yang dijelaskan di atas, supernatan disimpan
sebagai fraksi yang larut dalam urea. Sedimen diekstraksi dalam 5 M urea, 2 M tiourea, 2% (w=v) CHAPS,
dan 40 mM Tris pH 9,5. Supernatan, diperoleh setelah putaran sentrifugasi, mewakili fraksi larut tiourea.
Endapan akhir disuspensikan kembali dalam 1% SDS, 40 mM Tris, pH 9,5 dan mewakili fraksi larut SDS.
 Fraksi M=O disuspensikan kembali dalam larutan sedingin es 1 M KCl dan 15 mM Tris, pH 7,4
(ekstraksi garam tinggi). Setelah 15 menit di atas es, larutan disentrifugasi pada 233.000 g selama satu
jam dalam rotor SW40. Sedimen diekstraksi kembali dua kali dengan larutan garam tinggi. Endapan yang
dihasilkan dicuci tiga kali dengan 0,1 M Na2CO3, pH 11,5 (ekstraksi pH tinggi) seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Fujiki et al., 1982 tem tidak membedakan antara protein hidrofobik dan protein hidrofilik
(Hartinger et al., 1996).

Singkatnya, protein dipisahkan dua kali oleh massa molekul menggunakan deterjen(larutan buffer) yang berbeda.
Dalam dimensi pertama, benzildimetil-n-hexadecylammonium klorida (16-BAC) digunakan sebagai deterjen, dan
pemisahan dilakukan dalam gel poliakrilamida 7,5% dalam kondisi asam pada 10 mA sampai pewarna telah
bermigrasi ke ujung bawah dari gel. Pada dimensi kedua, pemisahan dalam kondisi basa dilakukan dengan natrium
dodesilsulfat (SDS) sebagai deterjen dalam gel poliakrilamida 8% (25 mA selama sekitar 6 jam). Karena efek yang
berbeda dari dua deterjen pada protein dengan massa yang sama atau sama, metode ini memungkinkan pemisahan
protein tersebut yang tidak mungkin dalam gel satu dimensi.

Identifikasi protein dengan spektrometri massa

 Bintik-bintik yang dipotong dicuci dua kali secara bergantian dengan 50 mM NH4HCO3 dan 25 mM
NH4HCO3=50% aseto-nitril. Protein disulfida direduksi dengan 10 mMdithiothreitol pada 57 C untuk30
 menit, diikuti oleh karbamidometilasi dengan 5 mM iodasetamida selama 30 menit. Akhirnya, noda dicuci
dua kali seperti yang dijelaskan di atas dan dikeringkan. Protein dicerna dalam gel dengan menambahkan
3,5 ml larutan tripsin 25 mg = ml dalam 50 mM NH4HCO3 semalaman pada suhu 37 C.
 Peptida diekstraksi dengan menginkubasinya dengan asam trifluoroasetat 0,1% selama 45 menit. Peptida
yang diekstraksi dipekatkan menggunakan ujung Perfect Pure C-18 (Eppendorf, Jerman) dan dielusi
kepelat target jangkar MALDI menggunakan asam a-cyano-4-hydro-xycinnamic sebagai matriks. Spektrum
diperoleh menggunakan instrumen Ultraflex MALDI-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Jerman).
Seribu spektrum per sampel dijumlahkan dan diproses dengan Analisis Flex 2.2 (Bruker Daltonics,
Bremen, Jerman) untuk menghasilkan daftar massa. Sidik jari massa peptida dianalisis dengan Biotools 2.2
(Bruker Daltonics, Bremen

Hasil
Peningkatan hasil di M=O-fraksi dengan pengenalan satu langkah ekstraksi ulang.
 Untuk mengevaluasi pemulihan membrane organel dari poses asli dilakukan aktivitas
enzim fostase alkali membrane plasma dan enzim penanda mitokondria suksinat
dehydrogenase.
 Ketika menerapkan cara awal untuk sentrifugasi diferensial melihat 21,3 ± 3,8%
aktivitas penanda membran plasma dan 3.40 ± 4% aktivitas penanda mitokondria di
supernatan (membran, organel, dan sitosol), sedangkan 78,73,8% aktivitas penanda
membran plasma dan 96.60 ± 4% aktivitas penanda mitokondria ditemukan di
sedimen
 Untuk meningkatkan pemulihan protein dalam supernatan, kami mengekstraksi
kembali inti dan sedimen yang mengandung puing-puing dengan resuspensi dalam
CLB isotonik dan menentukan aktivitas penanda enzim di supernatant
 Melalui pengenalan langkah ekstraksi ulang, hasil protein membran plasma dan
protein mitokondria meningkat sebesar 49,5% dan 13,5%, masing-masing.
 Langkah ekstraksi ulang lebih lanjut dari inti dan sedimen yang mengandung puing-
puing tidak banyak meningkatkan hasil.
 Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa penambahan satu langkah ekstraksi ulang
sudah cukup untuk meningkatkan keluaran protein dari prefraksinasi subselular

Pengayaan protein membran di M=O-fraksi dengan pelarutan berurutan

 Untuk menentukan pengayaan protein membran integral yang diperoleh dengan cara
pelarutan berurutan, fraksi M=O pertama kali dilarutkan dalam buffer-Tris.
 Deteksi protein oleh 16-BAC-SDS-PAGE dari dua sedimen terakhir (fraksi larut tiourea
dan fraksi larut SDS) tidak layak karena jumlah protein gabungan dari dua fraksi ini
kurang dari 3% dari jumlah total protein yang terlihat. dalam bahan awal (yaitu, fraksi
M=O).
 Oleh karena itu difokuskan analisis lebih lanjut pada fraksi yang larut dalam urea dan
memisahkan proteinnya dengan 16-BAC-SDS-PAGE

 Empat dari sampel (12%) mewakili protein membran integral dan 10 (30%) adalah
protein membran perifer (Tabel 3).
  Oleh karena itu, baik protein membran perifer maupun protein membran integral tidak
dapat diperkaya dengan pelarutan urea. Karena: pelarutan berurutan dihasilkan dalam
jumlah protein yang tidak cukup rendah di kedua fraksi yang larut tiourea (2,1 1,2%)
dan fraksi larut SDS (0,6 0,2%),
 Oleh karena itu kami menganalisis fraksi yang larut dalam Tris dan mengidentifikasi
persentase protein membran yang sangat tinggi [8 (16%) protein membran perifer
dan 4 (8%) protein membran integral dari 50 protein].

Pengayaan protein membran di M= pecahan O oleh garam tinggi= ekstraksi pH

tinggi
 Untuk melakukannya, fraksi M=O dilarutkan 3 kali dalam 1 M KCl, diikuti
dengan 3 langkah pencucian dalam 0,1 M Na2CO3. Setelah 6 langkah ini, fraksi
protein yang tidak larut (fraksi tahan garam tinggi=pH tinggi) mengandung 44,5
2,1% dari jumlah protein awal fraksi M=O, sedangkan 6 supernatan gabungan
secara total berisi 55,5 2,1% sisanya (Gbr. 3). Fraksi tahan tinggi-garam=pH
tinggi dipisahkan oleh 16-BAC-SDS-PAGE
 Kelas terbesar mewakili 13 (29%) protein membran perifer. Kelas terbesar kedua
terdiri dari protein membran integral dengan 12 (27%) anggota
 Di antara protein yang tersisa, 9 adalah sitosol, 5 sitoskeleton (-terkait), satu dari lumen
retikulum endoplasma, dan satu dari matriks mitokondria. Empat protein memiliki
beberapa tugas subseluler (Tabel 4).
 ekstraksi tinggi garam = pH tinggi menghasilkan pengayaan 2 kali lipat protein
membran integral dalam sedimen akhir.

Analisis protein yang relevan dengan pemrosesan saraf

 analisis apakah setiap protokol mampu mendeteksi protein yang relevan dengan
pemrosesan saraf
 Kami mengidentifikasi 13 protein (29%) dari jenis ini setelah ekstraksi tinggi garam =
pH tinggi, namun hanya 7 (21%) dalam fraksi yang larut dalam urea.
 Empat dari mereka ditemukan dengan kedua protokol: nama gen mereka adalah DYN1,
VDAC1, STX1C, dan ATP6V1A1
 Nama gen dari 9 protein yang ditemukan secara unik dengan menerapkan protokol
ekstraksi high-salt=high-pH adalah SYT1, SYT2, AP2MU2, CLIC4, VATB2, AT1A2,
AT1A3, VPP1, dan NSF.
 Akhirnya, nama gen dari 3 protein yang diidentifikasi secara unik dalam fraksi yang larut
dalam urea adalah MYP0, RIMS2, dan CLH.
KESIMPULAN
 Tujuan dari penelitian ini adalah pengayaan protein membran dari membran dan fraksi
organel (M=O) yang diperoleh dari jaringan otak.
 menilai kualitas dari dua teknik pengayaan yang berbeda, yaitu pelarutan sekuensial
dan ekstraksi tinggi garam=pH tinggi.
 Sebagai kriteria pertamaa dilakukan analisis jumlah protein dalam berbagai fraksi
dengan uji Bradford.
 Ditemukan bahwa jumlah protein dalam fraksi akhir yang diperoleh melalui
pelarutan berurutan jauh lebih rendah daripada yang diperoleh melalui
ekstraksi tinggi-garam = pH tinggi (0,6% berbanding 44,5%) hal menunjukkan
kerugian yang signifikan dari cara sebelumnya
 Pada kedua fraksi, jumlah protein terlalu rendah untuk memungkinkan deteksi spot
dengan pewarnaan Coomassie koloid dalam gel 16-BAC-SDS-PAGE ukuran standar
dan identifikasi dengan spektrometri massa. Hal ini menunjukkan bahwa protokol
pelarutan sekuensial menyediakan dalam fraksi yang paling chaotropic hanya jumlah
protein yang tidak cukup untuk menganalisis protein membran
 Karena jumlah protein secara umum bukan satu-satunya kriteria yang dengannya
kualitas kedua cara dapat dinilai, kami juga membandingkan kinerjanya terkait
pengayaan protein membran.
 Pelarutan berurutan tidak meningkatkan hasil protein membran integral (12%, seperti
yang dinilai dalam fraksi larut urea yang menghasilkan jumlah protein yang cukup
tinggi 25%).
 Sebaliknya, ekstraksi tinggi garam=pH tinggi menyebabkan pengayaan sekitar 2 kali
lipat (dari 14 menjadi 27%).
 Protein membran perifer tidak diperkaya dalam fraksi yang dianalisis dengan kedua
teknik.
 Data ini memberikan bukti tambahan bahwa ekstraksi tinggi garam = pH tinggi lebih
unggul daripada pelarutan sekuensial ketika bertujuan pada analisis protein membran
integral yang diperoleh dari sejumlah kecil jaringan otak.
 Dalam fraksi M=O yang diperoleh dengan sentrifugasi diferensial, kami menemukan
14% protein membran integral dan 30% protein membran perifer di antara 50 protein
yang diidentifikasi. . Hasil ini merupakan peningkatan yang cukup besar dibandingkan
dengan laporan kami sebelumnya yang telah menemukan 6% integral dan 22% protein
membran perifer di antara 18 protein yang diidentifikasi
 Perbedaannya dapat dijelaskan dengan fakta bahwa semua bercak protein diambil dari
gel 16-BAC- SDS-PAGE dalam penelitian ini, sedangkan setengah dari bercak protein
telah dipilih dari gel dua dimensi konveional dalam laporan kami sebelumnya. Gel
konvensional ini tidak cocok untuk memisahkan hidrofobik, protein membran integral
 Berbeda dengan pengayaan sekitar 2 kali lipat protein membran integral, protein
membran perifer tidak diperkaya dengan ekstraksi garam tinggi=pH tinggi yang
diterapkan pada fraksi M=O (awalnya 30%, setelah ekstraksi 28%).
Kondisi pencucian yang keras dalam buffer tinggi garam dan pH tinggi digunakan
untuk menghilangkan protein sitosol, luminal, dan non-kovalen terkait dari fraksi.
 Meskipun kondisi ini tampaknya tidak mempengaruhi protein membran integral, mereka
cenderung menghilangkan beberapa protein membran perifer.
 Pelarutan berurutan menghasilkan jumlah protein yang cukup rendah baik pada fraksi
larut tiourea (2,1%) dan fraksi larut SDS (0,6%), dan tidak ada pengayaan protein
membran yang ditemukan pada fraksi larut urea.
 Untuk mengatasi masalah ini, kami menganalisis fraksi larut Tris dan mengidentifikasi
persentase protein membran yang sangat tinggi. Hal ini dapat dikaitkan dengan
pemisahan yang tidak sempurna antara protein hidrofilik dan hidrofobik karena gaya
sentrifugal yang rendah. Sentrifugasi dilakukan pada 12.000 g oleh Molloy et al.
(1998), dan meskipun gaya sentrifugal meningkat menjadi 24.000 g dalam penelitian
ini, ini mungkin masih tidak cukup untuk secara kuantitatif mengendapkan vesikel
membran dalam fraksi M=O
 Mengenai protein yang relevan dengan neurotransmisi, rasio yang lebih tinggi dari
protein tersebut diidentifikasi oleh ekstraksi tinggi-garam = pH tinggi daripada yang
terlihat pada fraksi larut-urea yang diperoleh dengan pelarutan berurutan (29% versus
21%) memberikan bukti lebih lanjut dalam support keunggulan cara ekstraksi
sebelumnya
 Cara untuk meningkatkan rendemen membran plasma pada fraksi M=O dapat berupa
modifikasi pada kondisi sentrifugasi dan ekstraksi ulang. Perbaikan ke arah ini sangat
diinginkan jika seseorang mempertimbangkan bahwa sekitar 20-30% dari total
kandungan protein dibentuk oleh protein membrane
 Singkatnya, data penelitian menunjukan bahwa kombinasi prefraksinasi subseluler
dengan sentrifugasi diferensial dengan ekstraksi tinggi garam=pH tinggi memberikan
pengayaan yang efisien untuk protein membrane integral dari area otak