ARTIKEL UTAMA

Variasi Gen Utama Glikoprotein Permukaan dalam

Pneumocystis jirovecii
Geetha Kutty,1 Frank Maldarelli,2 Guillaume Achaz,3 dan Joseph A. Kovacs1
1Departemen Kedokteran Perawatan Kritis, National Institutes of Health Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, dan 2Program Resistensi
Obat HIV, Institut Kanker Nasional, Institut Kesehatan Nasional, Frederick, Maryland; 3UMR 7138 dan Atelier de Bioinformatique dan Université Pierre &
Marie Curie, Paris, Prancis

Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015

genom dari Pneumocystis, yang menyebabkan pneumonia yang mengancam jiwa pada pasien imunosupresi, mengandung keluarga
gen multikopi yang mengkode glikoprotein permukaan utama (Msg). Pneumocystis dapat memvariasikan Msg yang diekspresikan,
mungkin sebagai mekanisme untuk menghindari respons imun pejamu. Analisis 24pesan-sekuens gen yang diperoleh dari isolat
manusia tunggal Pneumocystis menunjukkan bahwa urutan memisahkan menjadi 2 cabang. Hasil dari sejumlah analisis
menunjukkan bahwa rekombinasi antarapesan gen merupakan mekanisme penting untuk menghasilkan
pesan perbedaan. Rekombinasi intrabranch terjadi lebih sering daripada rekombinasi antarbranch. Pembatasan-
fragmen panjangpolimorfismanalisis isolat manusia dariPneumocystis menunjukkan variasi substansial dalam
repertoar pesan-keluarga gen, variasi yang tidak diamati pada isolat laboratorium Pneumocystis di ormice tikus; ini
mungkin hasil dari pemeriksaan populasi outbred versus captive. Peningkatan keragaman dalam repertoar Msg,
yang dihasilkan sebagian oleh rekombinasi, meningkatkan potensi variasi antigenik dalam
protein permukaan yang melimpah ini.

Pneumocystis menyebabkan pneumonia yang mengancam jiwa
pada pejamu yang mengalami imunosupresi. Protein
permukaan yang paling melimpah dariPneumocystis adalah
glikoprotein permukaan utama (Msg), yang dikodekan oleh
keluarga gen multikopi dengan 50-100 salinan (masing-masing
3000 kb) per genom yang berkerumun di tandemarray dekat
telomer dari setiap kromosom [1]. Gen-gen ini mengkodekan
protein tidak lengkap yang tidak memiliki peptida terminal-N
dan tidak diekspresikan kecuali mereka ditranslokasikan ke hilir
dari situs ekspresi subtelomer unik yang mengkode urutan
upstreamconserved (UCS) [2-7]. Hanya varian yang ada di situs
ekspresi yang diterjemahkan dalam organisme tertentu.
Namun, varian 50–100pesan
gen memberikan potensi besar untuk variasi antigenik [8-12].
Variasi dari Msg yang diekspresikan mungkin memfasilitasi
penghindaran respon imun pada inang. Karena
Diterima 6 Juli 2007; diterima 13 Maret 2008; diterbitkan secara elektronik 14 Juli
2008.
Potensi konflik kepentingan: tidak ada yang dilaporkan.
Dukungan keuangan: Program Penelitian Intramural dari National Institutes
of Health Clinical Center dan National Cancer Institute.
Cetak ulang atau korespondensi: Dr. Joseph A. Kovacs, Bldg. 10, Rp. 2C145, MSC
1662, Bethesda, MD 20892-1662 ( jkovacs@nih.gov ).
Jurnal Penyakit Menular 2008; 198:741–9
© 2008 oleh Masyarakat Penyakit Menular Amerika. Seluruh hak cipta.
0022-1899/2008/19805-0017$15.00
DOI: 10.1086/590433
Pneumocystis spesies haploid [13], organisme tunggal hanya dapat
mengekspresikan varian Msg tunggal. Namun, beberapa varian
dapat diekspresikan dalam satu paru yang terinfeksi dari host yang
mengalami imunosupresi [14, 15]. Mirippesan-organisasi gen telah
diidentifikasi dalam Pneumocystis pada manusia, tikus, mencit, dan
musang [4, 6, 7, 12]. Rekombinasi mungkin memainkan peran dalam
menghasilkan banyakpesan varian [3,
16, 17].
Variabilitas antigenik pada spesies lain, seperti tripanosom
Afrika dan Borelia, dikaitkan dengan penghindaran respon
imun pejamu—terutama antibodi. Potensi variasi antigenik
dalam organisme ini meningkat tidak hanya dengan adanya, di
setiap genom organisme, banyak salinan unik gen yang
mengkode protein permukaan mereka, tetapi juga oleh variasi
dalam repertoar gen multikopi ini (yaitu, isolat yang berbeda
memiliki set gen ini), yang kemungkinan lebih lanjut
berkontribusi pada penghindaran kekebalan yang berhasil
[18-20]. Untuk lebih mengkarakterisasi keluarga gen yang
menyusun
pesan repertoar dari Pneumocystis (P. jirovecii) pada manusia,
kami melakukan pengurutan individu pesan varian pada pasien
dengan Pneumocystis pneumonia dan untuk menentukan
hubungan mereka satu sama lain, secara khusus berfokus pada
kemungkinan rekombinasi antara pesan varian. Untuk melihat
apakah, seperti organisme lain,Pneumocystis spesies memiliki
repertoar variabelpesan-keluarga gen, kami menggunakan

pesan Repertoar dalam P. jirovecii ● JID 2008:198 (1 September) ● 741

Tabel 1. Urutan oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi
reaksi berantai polimerase Pneumocystis pesan.
Tabel tersedia secara keseluruhan di online
edisi Jurnal.
analisis restriksi-fragmen panjang polimorfisme (RFLP) untuk memeriksa
pesan repertoar dalam Pneumocystis pada manusia, tikus, dan mencit.
BAHAN DAN METODE
Persiapan untuk Pneumocystis DNA. Pada otopsi, sampel dari P.
jiroveciiparu-paru yang terinfeksi dari 6 pasien dengan
Pneumocystis pneumonia (5 di antaranya terinfeksi HIV)
dikumpulkan dan digunakan untuk ekstraksi DNA; untukP.murina,
sampel paru yang terinfeksi dari scid tikus digunakan; untuk
P.carini, sampel paru-paru yang terinfeksi diperoleh dari tikus
imunosupresi yang dipelihara di 2 fasilitas (Biocon dan kampus
Universitas Indiana di Indianapolis) dan sebagian dimurnikan
dengan sentrifugasi gradien kepadatan Ficoll-Hypaque [21]. DNA
genom diisolasi baik dengan menggunakan kit mini DNA QIAamp
(Qiagen) atau dengan pengobatan proteinase K [22]. Pedoman
eksperimen manusia dan hewan dari National Institutes of Health
diikuti dalam melakukan penelitian ini.
Amplifikasi reaksi berantai polimerase (PCR). Pneumocystis
DNA diperkuat dengan menggunakan TaqPlus Panjang (Stratagen) dan primer, dari
kawasan yang dilestarikan (berdasarkan penyelarasan yang tersedia pesan
urutan), dirancang untuk memperkuat seluruh 3,3 kb darib pesan
wilayah variabel (tabel 1 dan gambar 1, yang hanya tersedia dalam
versi elektronik) Jurnal). Kondisi PCR untuk keduanyaP. carinii
(primer GK521 dan GK527) dan P.murina (primer GK257 dan GK261) adalah
sebagai berikut: 2 menit 94°C; 35 siklus 30 detik pada 94°C, 30 detik pada
56°C, dan4 menit 72°C; dan ekstensi terakhir selama 10 menit 72°C.
PCRkondisi untukP.jirovecii (primerGK126danGK452) adalah sebagai berikut: 2
menit pada 95 °C; 10 siklus 30 detik pada 94°C, 1 menit pada 68°C dengan 1°C
langkah-langkah penurunan di setiap siklus, dan 4 menit 72°C; dan 35 siklus
30 detik pada 94°C, 30 detik pada 58°C, dan 4 menit pada 72°C.
Urutan dari pesan varian. DNA genom dari PCR bersarang
pasien yang terinfeksi dianalisis oleh tunggal menggunakan HotstarTaq
(Qiagen) setelah membatasi pengenceran dilakukan [23]. yang pertama
putaran seperti yang dijelaskan di atas tetapi dengan denaturasi awal 15
menit. Kondisi putaran kedua (primer GK508 dan GK506) adalah sebagai
berikut: 15 menit pada 95 °C; 35 siklus 30 detik pada 94°C, 30 detik pada
58°C, dan 4 menit pada 72°C; dan perpanjangan akhir selama 10 menit
pada 72°C. Untuk pengenceran yang membatasi, DNA diencerkan secara
serial (3– 10 kali lipat per pengenceran) dalam studi pendahuluan, dan
10 ulangan reaksi nested-PCR dilakukan pada setiap pengenceran.
Pengenceran di mana hanya 3 reaksi PCR yang menghasilkan produk
seperti yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
subkloning berikutnya [23]. Produk amplifikasi disubklon ke TOPO TA
kloning PCR 2.1 (Invitrogen), dan klon menunjukkan
742 ● JID 2008:198 (1 September) ● Kutty dkk.
urutan yang berbeda (variabilitas 1%) setelah pengurutan awal
dari ujung 3' dan 5' benar-benar diurutkan. Untuk memeriksa
kemungkinan rekombinasi yang dimediasi PCR antara 2pesan
gen pada fragmen DNA tunggal, kami menggunakan prosedur yang
sama untuk memperkuat dan mengurutkan klon genom dengan 2 pesan
gen dalam pengulangan tandem (nomor aksesi GenBank AF038556). Kami
tidak menemukan rekombinan dalam 52 klon yang sepenuhnya diurutkan
yang dihasilkan selama 6 reaksi PCR.
RFLP dan analisis Southern blot. Produk PCR yang diperkuat
seperti di atas dipisahkan pada gel agarosa, dipotong, dimurnikan
dengan menggunakan kit ekstraksi gel Qiaquick (Qiagen), dicerna
dengan enzim restriksi yang ditunjukkan, dianalisis pada gel
agarosa 1% dalam 1 buffer EDTA Tris-borat, dan divisualisasikan
dengan menggunakan pewarnaan hijau SYBR (Molecular Probe).
Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Studi awal menunjukkan bahwa pola RFLP stabil selama reaksi PCR
berulang dan tidak tergantung pada konsentrasi DNA. DNA yang
menempel pada membran Nytran (Schleicher&Schuell) diperiksa
dengan oligonukleotida berlabel dengan menggunakan
DIGOligonucleotide Tailing Kit (Roche) atau probe DNA berlabel DIG
(PCR DIG Probe Synthesis Kit; Roche); Analisis blot selatan dilakukan
seperti yang dijelaskan di tempat lain [24]. Sebelum rehibridisasi,
blot dilucuti pada suhu 37°C dalam buffer yang mengandung NaOH
dengan konsentrasi 0,2 mol/L dan SDS 0,1%.
Analisis statistik. pesan urutan disejajarkan oleh Clustal W
(Megalignmodule of Lasergene; DNASTAR), dengan penalti celah 15
dan penalti panjang celah 6,66 [25]. Pohon-pohon tetangga yang
ditebangi celahpesan urutan dibangun oleh PAUP* (versi 4.0;
Sinauer Associates), dengan outgroup menjadi P.carinii pesan
urutan dari tikus. Nilai bootstrap dihitung berdasarkan 1000
ulangan resampling. Perbedaan berpasangan rata-rata antara
kelompok dihitung, dan tes struktur populasi dilakukan pada
urutan gap-stripped, dengan metode Hudson [lihat 24] (untuk versi
online dari analisis ini, lihat http://wwwabi.snv.jussieu.fr/ achaz/
hudsontest.html). Berdasarkan permutasi, tes ini memberikan
probabilitas bahwa 2 kelompok yang ditentukan sebelumnya
memiliki lebih banyak kesamaan di dalam daripada di antara
kelompok. Homogenitas didefinisikan sebagai ketiadaan struktur.
Analisis simplot dan bootscanning dari penyelarasan dilakukan
untuk mengidentifikasi daerah di mana rekombinasi terjadi. SimPlot
membandingkan kesamaan antara jendela pendek (200-nt) dari
urutan individu dan jendela yang sesuai untuk seluruh pelengkap
urutan dalam penyelarasan. Tingkat keterkaitan dihitung saat
jendela dipindahkan dalam langkah-langkah (200 nt) melintasi
keselarasan. Perubahan kemiripan yang ditandai menunjukkan
adanya rekombinasi [26]. Bootscanning menganalisis hubungan
filogenetik
Gambar tersebut tersedia secara keseluruhan
dalam edisi online Jurnal Penyakit Menular.
Gambar 1. Diagram skema dari Pesan Pneumocystis pada manusia, tikus,
dan mencit, menunjukkan nama, posisi, dan orientasi oligonukleotida yang
digunakan dalam penelitian ini.

Gambar 2. Struktur populasi Pneumocystis jirovecii pesan urutan hadir
dalam satu host yang terinfeksi. Urutan disejajarkan, dan pohon filogenetik
yang bergabung dengan tetangga dibangun seperti yang dijelaskan di bagian
Bahan dan Metode, dengan MSG100 (nomor akses GenBank D31909) (kotak
hitam), sebuah pesan urutan dari tikus Pneumocystis, digunakan untuk
membasmi pohon. Analisis bootstrap mengidentifikasi 2 cabang besar dan
berbeda (kelompok A dan B), yang masing-masing terdiri dari beberapa
kelompok kecil dari urutan yang berbeda; tanda bintang (*) menunjukkan
bahwa nilai bootstrap adalah 99%.
dari sekuens dan menghitung nilai bootstrap dari sekuens yang
mengelompok secara filogenetik dalam jendela geser (200 nt), dalam
kaitannya dengan set referensi sekuens parental potensial [27]. Nilai
bootstrap diplot sebagai fungsi dari posisi jendela di sepanjang urutan.
Perubahan tajam dalam nilai bootstrap menunjukkan
dukungan kuat untuk rekombinasi.
HASIL
Analisis dari pesan gen dalam satu isolat. Untuk memeriksa
hubungan antara pesan gen dari Pneumocystis pada manusia, kami
mengurutkan 24 unik pesan-varian gen dalam sampel dari pasien yang
terinfeksi Pneumocystis mengisolasi (sebagaimana ditentukan
berdasarkan pengetikan menggunakan ITS1 serta pengulangan tandem
di UCS [28, 29]). Meminimalkan artefak yang dihasilkan dari rekombinasi
antarapesan gen selama PCR, kami menggunakan pengenceran
terbatas diikuti oleh PCR. pesan gen diatur dalam pengulangan tandem
pada kromosom individu, yang mengharuskan kami untuk mensubklon
produk PCR sebelum pengurutan; ini berpotensi menimbulkan mutasi
titik pada frekuensi 1/1000 bp (sebagaimana ditentukan berdasarkan
studi menggunakan plasmid yang mengandungpesan). Efek dari mutasi
tersebut diminimalkan dengan menggunakan konsensus se-
urutan dari klon yang 99% identik, serta dengan menggunakan
sekuensing tambahan, yang menggunakan DNA genom dan primer
spesifik untuk individupesan gen. Semua klon berisi kerangka baca
terbuka lengkap untuk Msg. Semua urutan telah disimpan di
GenBank (nomor aksesEF371022–26, EF371028–33, EF371035–
36, EF371038, EF371040–42, EF371045, EF371050–53, dan
EF371055–56).
Analisis filogenetik mengungkapkan bahwa pesan urutan dipisahkan
menjadi subkelompok (gambar 2). Nilai bootstrap yang kuat mendukung
struktur pohon yang terdiri dari 2 cabang utama, diberi nama “A” dan
“B”, yang masing-masing berisi 11 dan 13 urutan. Analisis rinci daripesan
heterogenitas urutan mengungkapkan keragaman nukleotida
substansial; 1981 dari 3445 situs dalampesan adalah polimorfik. Rata-
rata keseluruhan perbedaan berpasangan antarapesan
Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
urutan adalah 0,252. Barisan di grup A memiliki keragaman yang jauh
lebih rendah daripada barisan di grup B (perbedaan berpasangan rata-
rata, masing-masing 0,200 dan 0,295;P . 0001). Rata-rata
perbedaan berpasangan antara kelompok adalah 0,364, menunjukkan
bahwa perbedaan antara 2 kelompok lebih besar daripada dalam kedua
kelompok individu.
Untuk menyelidiki apakah pemisahan kelompok A dan B
signifikan secara statistik, kami menggunakan adaptasi
struktur populasi Hudson [30, 31]. Analisis nonparametrik ini
menghasilkan ukuran kuantitatif dari probabilitas homogenitas
(tidak adanya struktur)—yaitu, kemungkinan bahwa 2 set
urutan diturunkan dari satu populasi. Menurut analisis ini,
probabilitas bahwa 2 himpunan barisan ini tidak menunjukkan
struktur apapun (yaitu, homogen) adalah 109. Struktur ini hadir
hanya ketika urutan dikelompokkan menurut cabang
filogenetik A dan B; analisis kelompok yang diperoleh dengan
penugasan acak murni daripesan urutan mengungkapkan tidak
ada bukti struktur. Data ini menunjukkan bahwa kelompok A
dan B yang diidentifikasi dengan analisis filogenetik diatur
sebagai 2 subpopulasi terpisah.
Analisis untuk rekombinasi pesan gen. Karena pesan
gen adalah keluarga gen yang terkait tetapi unik, kami melakukan untuk
memeriksa apakah rekombinasi berperan dalam menghasilkan pesan
perbedaan. Kami awalnya melakukan analisis filogenetik terpisah
dengan masing-masing dari 3 fragmen gap-strippedpesan urutan:
posisi nukleotida 1–932, 933–1862, dan 1863–2813. Ini
pesan fragmen juga dipisahkan menjadi 2 kelompok yang berbeda
(gambar 3, yang hanya tersedia dalam versi elektronik) Jurnal).
Beberapa, tetapi tidak semua, asosiasi cabang dengan dukungan
bootstrap 100% dalam analisis urutan panjang penuh dipertahankan
dalam analisis fragmen yang lebih kecil; namun, beberapa cabang
disortir kembali, dengan dukungan bootstrap 100%, dalam analisis gen,
dibandingkan dengan asosiasi mereka dalam gen.
Gambar tersebut tersedia secara keseluruhan
dalam edisi online Jurnal Penyakit Menular.
Gambar 3. Bukti rekombinasi dalam struktur populasi
Pneumocystis jirovecii pesan urutan.
pesan Repertoar dalam P. jirovecii ● JID 2008:198 (1 September) ● 743
 Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Gambar 4. Analisis penyisipan dan/atau penghapusan (indels), mengungkapkan bukti rekombinasi. Urutan disusun menurut analisis filogenetik yang ditunjukkan
pada Gambar 2, dengan kelompok A dan B kode warna seperti pada Gambar 2 dan dengan nilai bootstrap untuk cabang ditunjukkan (kiri). Urutan di wilayah
posisi nukleotida 1340 dan 2920, yang memiliki indel yang jelas (kemas), menunjukkan pemisahan yang kuat tetapi tidak eksklusif berdasarkan kelompok.
Penyisipan pada posisi nukleotida 1340 di grup A tidak ada di 12 dari 13 urutan grup B, tetapi penyisipan 3-nt yang sama ada di 1 urutan grup B (Cl-9). Pemisahan
indel serupa pada posisi nukleotida 2910 dan 2926 mengungkapkan bukti kuat rekombinasi antara kelompok A dan B.

analisis luas (misalnya, lihat urutan Cl-1, Cl-7, Cl-14, dan Cl-25).
Pergantian cabang yang, sebagai fungsi dari posisi nukleotida, memiliki
dukungan bootstrap yang kuat, sangat menyarankan adanya
rekombinasi. (Kami menggunakan istilah "rekombinasi" untuk merujuk
pada pertukaran genetik timbal balik dan non-timbal balik, meskipun
yang terakhir ini dengan tepat disebut "konversi").
Karena pesan keberpihakan mengungkapkan banyak penyisipan
dan/atau penghapusan (indel), kami melakukan analisis spesifik
indel. Analisis ini menunjukkan bahwa sejumlahpesan indels
memisahkan terutama menurut pengelompokan tofilogenetik.
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4, penyisipan 3 nt setelah posisi
nukleotida 1339 ditemukan hampir secara eksklusif dalam urutan di
cabang utama A dari pohon filogenetik, tetapi juga ditemukan di 1
dari urutan grup B. Demikian pula, penghapusan 6 nt secara
seragam hadir setelah posisi nukleotida 2908 di grup A dan di 3 dari
13 urutan di grup B; dan penyisipan 3 nt setelah posisi nukleotida
2925 hadir secara seragam di grup B dan ada dalam 1 urutan di
grup A. Penemuan indel yang hadir secara seragam di 1 cabang
dan muncul di cabang lain sangat mendukung adanya rekombinasi
antara inipesan gen.
Untuk menyelidiki lebih lanjut kejadian rekombinasi potensial,
kami menggunakan 2 pendekatan sliding-window: (1) SimPlot,
untuk mengukur kesamaan spesifik wilayah, dan (2) bootscanning,
untuk menghitung nilai bootstrap untuk pohon filogenetik. Analisis
SimPlot mengidentifikasi perbedaan dalam kesamaan urutan,
dengan pemisahan urutan setelah 1000-1200 nt, yang sesuai persis
ke cabang A dan B dalam analisis filogenetik (gambar 5SEBUAH);
peristiwa rekombinasi dapat menjelaskan perbedaan yang tajam ini. Analisis
bootscanning struktur pohon digunakan untuk mengidentifikasi potensi
daerah potensial rekombinasi lebih tepatnya. Pohon filogenetik
yang dibangun dengan menggunakan jendela geser (200 nt)
sekuens dari kandidat rekombinan dan sekuens induk potensial
dibandingkan dengan analisis bootstrap; peralihan dukungan
bootstrap dari satu urutan parental ke yang lain konsisten dengan
rekombinasi. Kami menganalisis set urutan yang memiliki
dukungan bootstrap yang kuat secara penuh–pesan analisis urutan
tetapi itu beralih dukungan dalam analisis urutan parsial. Dalam
analisis bootscanning (gambar 5B) Cl-14 dan Cl-21 dan Cl-14 dan
Cl-25, bukti jelas dari 2 peristiwa rekombinasi terdeteksi (pada
posisi nukleotida 700 dan 1520). Perbandingan bootscanning
lengkap mengidentifikasi banyak area tambahan di mana peralihan
(mungkin sekunder untuk rekombinasi) terjadi, di dalam dan di
antara grup A dan B (data tidak ditampilkan).
Analisis dari pesan-variasi gen dalam berbagai Pneumocystis
terisolasi. Mengingat bukti untuk rekombinasi antara yang
berbeda pesan gen, kami menentukan apakah pesan repertoar
(50-100 pesan gen per genom) identik dalam P. jirovecii diisolasi
dari pasien yang berbeda. Primer berdasarkan wilayah yang sangat
terkonservasi (dikenalpesan varian) di awal wilayah pengkodean
dan hilir kodon stop (gambar 1, yang hanya tersedia dalam versi
elektronik dari Jurnal) digunakan untuk memperkuat keseluruhan
pesan repertoar semua genom individu dari isolat. Produk PCR
yang dihasilkan sebesar 3,3 kb menjadi sasaran analisis RFLP. jika
pesan repertoar sangat lestari, maka pola RFLP antara isolat yang
berbeda harus sangat mirip atau identik. Di antara 6 isolat dari 6
pasien, pola RFLP sangat berbeda ketika produk PCR dicerna
denganMboSAYA, hindIII, atau Drasaya (gambar 6SEBUAH). noda
selatan

744 ● JID 2008:198 (1 September) ● Kutty dkk.

 Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Gambar 5. SEBUAH, Analisis sederhana dari pesan urutan. Urutan menjadi sasaran analisis Simplot membandingkan semua lainnyapesan urutan ke
urutan Cl-5 dari grup A. Setiap baris mewakili satu klon. Semua urutan grup A (garis biru) relatif dekat dengan Cl-5 (kemiripan dengan skor Cl-5, 70%
-100%), sedangkan urutan grup B (garis oranye) menyimpang tajam antara posisi nukleotida 1200 dan 2300 (mirip dengan skor Cl-5, 60%),
menunjukkan rekombinasi di lokasi divergensi. Kesamaan skor dari urutan grup B meningkat menjelang akhirpesan
urutan, menyarankan acara rekombinasi tambahan. B, Deteksi bootscanning dari bukti rekombinasi yang sering. pesan sekuens menjadi sasaran analisis
bootscanning menggunakan Cl-14 sebagai sekuens kueri dan Cl-7, Cl-21, dan Cl-25 sebagai sekuens pembanding. Untuk penyederhanaan, hanya perbandingan
antara Cl-14 dan Cl-21 (hitam) dan antara Cl-14 dan Cl-25 (merah) ditampilkan. Itux-sumbu menggambarkan posisi nukleotida dalam pesan urutan; ituy-sumbu
menggambarkan persentase pengelompokan pohon dengan urutan kueri. Jumlah pohon permutasi yang mengelompokkan Cl-21 dengan Cl-14 ketika jendela
geser 200 nt digunakan menunjukkan perubahan frekuensi yang tajam, dengan demarkasi menyarankan 2 peristiwa rekombinasi, pada posisi nukleotida 700 dan
1520; sebaliknya, jumlah pohon permutasi Cl-14 yang dikelompokkan dengan Cl-25 menunjukkan saklar timbal balik dalam homologi pada posisi yang kira-kira
sama. Sakelar potensial tambahan dalam homologi hadir di kedua perbandingan, menunjukkan beberapa peristiwa rekombinasi.

analisis menggunakan oligonukleotida yang dirancang berdasarkan
area yang dilestarikan di dekat ujung 3'pesan, yang dipilih berdasarkan
keselarasan yang diketahui P. jirovecii pesan urutan, ditunjukkan pada
Gambar 6B Keenam isolat tersebut menunjukkan pola yang berbeda,
terutama ketika dicerna dengan hindIII atau DraI. Untuk memeriksa
lebih lanjut perbedaan pola ini, noda itu diulang dengan oligonukleotida
khusus untuk pesan32, yang sebelumnya dicirikan pesan varian
[22]; hibridisasi yang kuat terlihat hanya untuk isolat 1 (gambar 6C),
yang menunjukkan bahwa varian khusus ini tidak ada sama sekali P.jirovecii,
tidak memasukkan artefak ke dalam analisis RFLP, pencernaan
restriksi menggunakan DNA genom dari 4 sampel dilakukan,
diikuti dengan hibridisasi. Sekali lagi variasi pola di antara isolat
tinggi (Gambar 6D). Pengamatan ini menunjukkan bahwa
pesan repertoar dari P. jirovecii sangat bervariasi.
Diketahui (1) bahwa Pneumocystis spesies yang menginfeksi
manusia berbeda dengan yang menginfeksi tikus dan (2) bahwa ini
Pneumocystis spesies juga memiliki multicopy yang serupa pesan-keluarga
gen dan sistem untuk mengekspresikan pesan, kami melakukan analisis RFLP

sebuah temuan yang sekali lagi menguatkan keragaman repertoar yang untuk memeriksa keragaman pesan repertoar dalam Pneumocystis pada tikus

tinggi dalam spesies ini. Untuk memverifikasi bahwa amplifikasi PCR adalah dan mencit [6, 10]. Ketika kami menggunakan sampel DNA dari

pesan Repertoar dalam P. jirovecii ● JID 2008:198 (1 September) ● 745

 Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Gambar 6. SEBUAH, Analisis polimorfisme panjang fragmen pembatasan (RFLP) dari pesan dari Pneumocystis jirovecii. pesandiamplifikasi dari DNA yang dibuat
dari sampel paru, dikumpulkan antara 1985 dan 1999, dari P. jirovecii- pasien terinfeksi (jalur 1–6); ITS1 dan tipe upstream-conserved-sequence menunjukkan
bahwa 6 isolat masing-masing adalah E dan 3 ulangan; E dan G dan 3, 4, dan 6 berulang; E dan 6 pengulangan; E dan 4 pengulangan; E dan 3 dan 4 berulang; dan
E dan 3 pengulangan. Produk reaksi berantai polimerase dicerna dengan enzim restriksiMboSAYA, hindIII, atau DraI, dianalisis dengan menggunakan gel agarosa
1% dalam 1 buffer EDTA Tris-borat, dan kemudian diwarnai dengan SYBR green. B dan C, Analisis blot selatan dari P. jirovecii pesan. Fragmen DNA dari gel
(analisis RFLP; lihat panel SEBUAH) dihapus ke membran dan hibridisasi berturut-turut dengan oligonukleotida GK195 (B) dan GK576 (C); noda itu dilucuti antara
hibridisasi. GK195 berasal dari wilayah yang sangat terkonservasi di dekat ujung 3'pesan, dan GK576 khusus untuk single pesan kloning (pesan 32). D, Analisis
blot selatan DNA genom dari sampel paru dari P. jirovecii- pasien terinfeksi (jalur 1-4), dicerna dengan MboSAYA, hindIII, atau DraI. Blot dihibridisasi dengan
probe yang mencakup posisi nukleotida 1576-2974 dari HuMSG14.

paru-paru 6 P. murina-terjangkit scidtikus yang ditempatkan dalam satu
kandang, kami mengamati pola RFLP yang identik ketika produk PCR dicerna
dengan hindIII atau DraI (data tidak ditampilkan). Ketika kami menggunakan
sampel paru-paru yang dikumpulkan di fasilitas kami selama 1999-2004
(gambar 7).SEBUAH), kami menemukan bahwa pola RFLP kembali identik di
semua 6 tikus. Analisis blot selatan menggunakan oligonukleotida yang
dirancang berdasarkan wilayah yang dilestarikanP.murina msg menunjukkan
pola hibridisasi yang identik untuk semua isolat di setiap penelitian (hasil tidak
2 fasilitas berbeda selama beberapa tahun. Ketika produk PCR dicerna
denganhindIII atauDraI, pola RFLP sangat mirip pada semua tikus
(Gambar 7).B). Analisis blot selatan menggunakan oligonukleotida dari
wilayah konservasi P.carinii pesan menunjukkan pola hibridisasi yang
hampir identik di semua 7 tikus (hasil tidak ditampilkan). Analisis blot
selatan genomicDNA lebih lanjut menegaskan bahwa pola RFLP sangat
dilestarikan di antara isolat (gambar 7C).
Jadi, Pneumocystis pada tikus dan tikus yang dibesarkan di penangkaran tidak

ditampilkan). Karena semua tikus berasal dari satu koloni, kami melakukan menunjukkan tingkat variabilitas yang sama dalampesan repertoar seperti yang

analisis serupa terhadapP. carinii pada tikus yang diperoleh dari dilakukan P.jirovecii.

746 ● JID 2008:198 (1 September) ● Kutty dkk.

 Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Gambar 7. SEBUAH, Analisis polimorfisme panjang fragmen pembatasan (RFLP) dari pesan dari Pneumocystis murina. pesandiamplifikasi dari DNA dari sampel
paru-paru yang dikumpulkan dari scid tikus selama periode 5 tahun (jalur 1–6, yang menggambarkan hasil sampel paru-paru yang dikumpulkan dari 1999 hingga
2004, masing-masing). Produk reaksi berantai polimerase (PCR) dicerna dengan enzim restriksihindIII atau DraI, dianalisis dengan menggunakan gel agarosa 1%
dalam 1 buffer EDTA Tris-borat, dan diwarnai dengan SYBR green. B, Analisis RFLP dari P.carinii pesan diamplifikasi dari preparat DNA dari sampel paru-paru dari
P. carinii-tikus yang terinfeksi Jalur 1-4, Hasil sampel paru-paru yang dikumpulkan antara tahun 1998 dan 2001, dari tikus di satu fasilitas;jalur 5–7,
sampel paru-paru yang dikumpulkan antara 1993 dan 1995, dari tikus di fasilitas kedua. Produk PCR dicerna dengan baikhindIII atau DraI, dianalisis pada gel
agarosa 1% dalam 1 buffer EDTA Tris-borat, dan diwarnai dengan SYBR green. C, Analisis blot selatan DNA dari P. carinii-sampel paru yang terinfeksi DNA
genomik dicerna dengan baikhindIII atau DraI. Blot dihibridisasi dengan probe yang dihasilkan oleh amplifikasi, dengan menggunakan primer
GK524 dan GK526, DNA genomik dari P.carini.

DISKUSI aliran cluster atau di dalam pesan gen dapat lebih meningkat pesan

Kami telah menunjukkan dengan analisis RFLP bahwa, di antara isolat

keragaman [17]. Di tempat lain, rekombinasi telah dihipotesiskan

yang berbeda, ada keragaman substansial pesan gen dalam P.jirovecii: memainkan peran penting dalam menghasilkan keragaman

tidak ada 2 isolat yang memiliki repertoar 50-100 gen yang sama. haplotipe tersebut [3, 16,17].

Analisis urutan 24 unikpesan gen dari isolat tunggal menunjukkan Identifikasi 2 cabang berbeda dari pesan gen dalam P.
bahwa rekombinasi antara pesan varian memainkan peran utama dalam jirovecii diperoleh dari satu pasien yang terinfeksi mengejutkan. Ada
menghasilkan pesan perbedaan. Karena semuapesan gen tampaknya kemungkinan bahwa pasien ini terinfeksi dengan 2 strain unik dari
terletak di kelompok dekat telomer [3, 15, 32], rekombinasi baik Pneumocystis, meskipun ITS1 serta pengetikan UCS disarankan

pesan Repertoar dalam P. jirovecii ● JID 2008:198 (1 September) ● 747

infeksi dengan strain tunggal. Atau, 2 cabang dapat mewakilipesan
gen dalam satu isolat yang diwarisi dari 2 galur tetua melalui
reproduksi seksual dan yang belum memiliki kesempatan untuk
berbaur secara genetik secara ekstensif. Hipotesis ini konsisten
dengan identifikasi, dalam reaksi PCR individu, daripesan gen dari
kedua cabang, sebuah temuan yang menunjukkan bahwa mereka
berada di 1 fragmen DNA. Mungkin juga, karena alasan biologis
atau lainnya, 2 set gen terbatas pada rekombinasi terutama di
dalam cabang daripada melintasi cabang. Kami tidak percaya
bahwa 2 cabang mewakili keluarga unik gen yang serupa dengan
yang kami dan orang lain telah identifikasi sebelumnya.P.carini (
misalnya, pesan dan nyonya) [17, 33], karena wilayah primer hulu
untuk amplifikasi P. jirovecii pesan
gen termasuk urutan yang sangat terkonservasi yang homolog dengan
elemen persimpangan rekombinasi yang dilestarikan di P.carinii;
di P.carini, karakteristik utama yang membedakan antara
pesan gen dan varian adalah keberadaan elemen persimpangan
rekombinasi yang dilestarikan ini di yang pertama tetapi tidak yang
terakhir.
Rekombinasi antara organisme yang berbeda secara genetik, antara organisme
yang identik secara genetik, atau antara organisme yang berbeda pesan
gen dalam organisme individu dapat meningkatkan
keragaman pesan repertoar. Konservasi pola RFLP di
Pneumocystis pada tikus dan tikus, dibandingkan dengan pola beragam
yang terlihat pada Pneumocystis pada manusia mencolok tetapi
mungkin hanya karena pemeriksaan populasi penangkaran versus
populasi keturunan; sebagai alternatif, ada kemungkinan bahwaP.
jirovecii telah mengembangkan mekanisme untuk meningkatkan pesan
keragaman, mekanisme yang tidak ada di yang lain Pneumocystis jenis.
Analisis RFLP dariPneumocystis diperoleh dari hewan liar daripada dari
hewan berkoloni pasti akan mengatasi masalah ini.
Meskipun fungsi Msg mungkin untuk memfasilitasi perlekatan pada sel
atau protein inang [34, 35], variasi antigenik Msg kemungkinan memberikan
keuntungan imunologis bagi organisme dalam interaksinya dengan inang.
Variabilitas antigenik serupa pada spesies lain, seperti trypanosomes Afrika
danBorrelia spesies, dikaitkan dengan penghindaran respon imun inang,
terutama antibodi; variasi repertoar dalam organisme ini telah
didokumentasikan dan kemungkinan berkontribusi pada penghindaran
kekebalan yang berhasil [18-20]. Mengingat (1) bahwa respons imun yang
diperantarai sel — terutama respons limfosit T CD4 — tampaknya paling
penting untuk mengendalikanPneumocystis infeksi [36-38] dan (2) bahwa
respons antibodi terhadap Msg mudah dideteksi pada manusia [39, 40],
fungsi utama keragaman Msg mungkin untuk menghindari respons yang
diperantarai sel. Konsisten dengan hipotesis ini adalah ketidakmampuan kami
untuk mendeteksi respons proliferasi in vitro terhadap isoform Msg
rekombinan ketika kami telah menggunakan sel mononuklear darah perifer
manusia, terlepas dari fakta bahwa antibodi terhadap antigen yang sama
mudah dideteksi (JAK, pengamatan tidak dipublikasikan); hasil ini mungkin
mencerminkan kemungkinan rendah bahwa individu telah terinfeksiP. jirovecii
mengekspresikan kloningpesan isoform. MeskipunPneumocystis infeksi pada
pejamu yang sehat tidak menunjukkan
748 ● JID 2008:198 (1 September) ● Kutty dkk.
buah pir untuk menghasilkan waxing kronis dan memudarnya infeksi
[41] yang terlihat pada infeksi oleh spesies lain dengan variasi antigenik
(misalnya, spesies trypanosome [42, 43]), pesan keragaman dapat
memfasilitasi reinfeksi dari host yang sehat dengan menunda
pengembangan respon imun seluler yang efektif.
Variabilitas substansial yang telah ditunjukkan oleh analisis
RFLP dalam pesan repertoar berpotensi menyediakan metode
yang kuat untuk mengetik P.jirovecii. Metode pengetikan saat
ini terutama bergantung pada pemeriksaan variasi dalam satu
atau lebih polimorfisme nukleotida tunggal dalam satu lokus
atau sejumlah lokus [44], sedangkan analisis RFLP pesan
gen berpotensi memungkinkan interogasi 50-100 gen. Analisis tersebut
dapat membantu kita untuk menentukan hubungan antara isolat dari
wabah didugaPneumocystis radang paru-paru [45].
Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Rene Costello dan HowardMostowski atas bantuan mereka dalam
penelitian hewan.
Referensi
1. Stringer JR, Keely SP. Genetika ekspresi antigen permukaan dalamPneumocystis
carinii. menginfeksi kekebalan 2001; 69:627–39.
2. Wada M, Sunkin SM, Stringer JR, Nakamura Y. Variasi antigenik dengan
kontrol posisi ekspresi gen glikoprotein permukaan utama dalam
Pneumocystis carinii. J Menginfeksi Dis 1995; 171:1563–8.
3. Wada M, Nakamura Y. Situs ekspresi telomerik yang unik dari gen
glikoprotein permukaan utama dari Pneumocystis carinii. Res DNA 1996;
3: 55–64.
4. Edman JC, Hatton TW, Nam M, dkk. Situs ekspresi tunggal dengan urutan
pemimpin yang dilestarikan mengatur variasi ekspresiPneumocystis
carinii keluarga gen glikoprotein permukaan utama. Biola Sel DNA1996;
15:989–99.
5. Sunkin SM, Stringer JR. Tempat tinggal di situs ekspresi diperlukan
dan cukup untuk transkripsi gen antigen permukaanPneumocystis
carinii. Mol Mikrobiol 1997; 25:147–60.
6. Haidaris CG, Medzihradsky OF, Gigliotti F, Simpson-Haidaris PJ.
Karakterisasi molekuler tikusPneumocystis carinii glikoprotein
permukaan A. DNA Res 1998; 5:77–85.
7. Kutty G, Ma L, Kovacs JA. Karakterisasi situs ekspresi glikoprotein
permukaan utama turunan manusiaPneumocystis carinii. Mol
Mikrobiol 2001; 42:183–93.
8. Radding JA, Armstrong MY, Ullu E, Richards FF. Identifikasi dan isolasi
glikoprotein permukaan sel utama dariPneumocystis carinii.
menginfeksi kekebalan 1989; 57:2149–57.
9. Haidaris PJ, Wright TW, Gigliotti F, Haidaris CG. Ekspresi dan karakterisasi
klon cDNA yang mengkode glikoprotein permukaan imunodominan dari
Pneumocystis carinii. J Menginfeksi Dis 1992; 166:1113–23.
10. Kovacs JA, Powell F, Edman JC, dkk. Beberapa gen mengkode glikoprotein
permukaan utama dariPneumocystis carinii. J Biol Chem 1993; 268: 6034–
40.
11. Garbe TR, Stringer JR. Karakterisasi molekuler varian berkerumun dari gen yang
mengkode antigen permukaan utama manusiaPneumocystis carinii.
menginfeksi kekebalan 1994; 62:3092–101.
12. Wright TW, Bissoondial TY, Haidaris CG, Gigliotti F, Haidaris PJ.
Keragaman isoform dan duplikasi tandem gen glikoprotein A pada
musangPneumocystis carinii. Res DNA 1995; 2:77–88.
13. Wyder MA, Rasch EM, Kaneshiro ES. Kuantitas mutlakPneumocystis carinii
Kandungan DNA nuklir: bentuk trofik dan kistik yang diisolasi dari paru-
paru tikus yang terinfeksi adalah organisme haploid. J Eukariota Mikrobiol
1998; 45:233–9.
14. Angus CW, Tu A, Vogel P, Qin M, Kovacs JA. Ekspresi varian glikoprotein
permukaan utama dariPneumocystis carinii. J Exp Med 1996;
183:1229–34.
15. Sunkin SM, Stringer JR. Translokasi gen antigen permukaan ke situs
ekspresi telomerik yang unik diPneumocystis carinii. Mol Mikrobiol
1996; 19:283–95.
16. Stringer JR. Variasi antigenik pada pneumocystis. J Eukariota Mikrobiol
2007; 54:8–13.
17. Keely SP, Renauld H, Wakefield AE, dkk. Array gen diPneumocystis
carinii telomer. Genetika2005; 170:1589–600.
18. Barbour AG, Restrepo BI. Variasi antigenik pada patogen tular vektor.
Emerg Infect Dis2000; 6:449–57.
19. Borst P. Genetika molekuler variasi antigenik. Imunol Hari Ini
1991; 12:A29–33.
20. Rudenko G. Telomer polimorfik dari trypanosome Afrika
Trypanosoma brucei. Biochem Soc Trans 2000; 28:536–40.
21. Kovacs JA, Halpern JL, Swan JC, Moss J, Parrillo JE, Masur H.
Identifikasi antigen dan antibodi spesifik untuk Pneumocystis carinii.
J kekebalan 1988; 140:2023–31.
22. Mei Q, Turner RE, Sorial V, KlivingtonD, Angus CW, Kovacs JA. Karakterisasi
gen glikoprotein permukaan utama manusiaPneumocystis carinii dan
ekspresi tingkat tinggi dari kawasan konservasi. menginfeksi kekebalan
1998; 66:4268–73.
23. Palmer S, Kearney M, Maldarelli F, dkk. Mutasi resistensi obat tipe 1 human
immunodeficiency virus multipel yang terkait pada pasien yang berpengalaman
dengan pengobatan terlewatkan oleh analisis genotipe standar. J Clin Mikrobiol
2005; 43:406–13.
24. Ma L, Kutty G, Jia Q, Kovacs JA. Karakterisasi varian gen yang
mengkode antigen p55 diPneumocystis dari tikus dan tikus.
Mikrobiol J Med2003; 52:955–60.
25. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTA W: meningkatkan
sensitivitas penyelarasan sekuens berganda progresif melalui
pembobotan sekuens, penalti celah khusus posisi dan pilihan
matriks bobot. Asam Nukleat Res1994; 22:4673–80.
26. Lole KS, Bollinger RC, Paranjape RS, dkk. Genom human immunodeficiency
virus tipe 1 full-length dari serokonverter yang terinfeksi subtipe C di
India, dengan bukti rekombinasi intersubtipe. J Virol1999; 73: 152–60.
27. Salminen MO, Carr JK, Burke DS, McCutchan FE. Identifikasi
breakpoints dalam rekombinan intergenotip HIV tipe 1 dengan
bootscanning. AIDS Res Hum Retrovirus1995; 11:1423–5.
28. Ma L, Kutty G, Jia Q, dkk. Analisis variasi pengulangan tandem di
intron situs ekspresi glikoprotein permukaan utama bentuk manusia
Pneumocystis carinii. J Menginfeksi Dis 2002; 186:1647–54.
29. Lu JJ, Bartlett MS, Shaw MM, dkk. Jenis strain Pneumocystis carinii
yang menginfeksi manusia berdasarkan variasi urutan nukleotida
dari spacer transkripsi internal gen rRNA. J Clin Mikrobiol1994; 32:
2904–12.
30. Hudson RR, Kaplan NL. Sifat statistik jumlah peristiwa
rekombinasi dalam sejarah sampel sekuens DNA. Genetika
1985; 111:147–64.
31. Achaz G, Palmer S, Kearney M, dkk. Ukuran yang kuat dari pergantian
populasi HIV-1 dalam individu yang terinfeksi secara kronis. Mol Biol Evol
2004; 21:1902–12.
32. Stringer JR, Bantal MT. genom dariPneumocystis carinii. FEMS
Immunol Med Microbiol 1998; 22:15–26.
33. Huang SN, Angus CW, Turner RE, Sorial V, Kovacs JA. Identifikasi dan
karakterisasi varian baru keluarga gen glikoprotein permukaan utama
pada tikusPneumocystis carinii. J Menginfeksi Dis 1999; 179: 192–200.
34. Wisniowski P, Pasula R, Martin WJ II. Isolasi dariPneumocystis carinii
gp120 oleh afinitas fibronektin: bukti ketergantungan formangan. AmJ
Respir Sel Mol Biol1994; 11:262–9.
35. Pottratz ST, Paulsrud J, Smith JS, Martin WJ II. Pneumocystis carinii
perlekatan ke sel paru yang dikultur oleh pneumocystis gp 120, protein
pengikat fibronektin. J Clin Invest1991; 88:403–7.
Diunduh dari http://jid.oxfordjournals.org/ di University of Memphis - Perpustakaan pada 22 Maret 2015
36. Phair J, Munoz A, Detels R, Kaslow R, Rinaldo C, Saah A. Risiko
Pneumocystis carinii pneumonia di antara pria yang terinfeksi human
immunodeficiency virus tipe 1: Kelompok Studi Multicenter AIDS Cohort.
N Engl J Med1990; 322:161–5.
37. Shellito J, Suzara VV, BlumenfeldW, Beck JM, Steger HJ, Ermak TH. Sebuah
model baru dariPneumocystis carinii Infeksi mencit secara selektif
kehabisan limfosit T penolong. J Clin Invest1990; 85:1686–93.
38. McFadden DC, Powles MA, Smith JG, Sanjungan AM, Bartizal K, Schmatz DM.
Penggunaan sel hibridoma anti-CD4 untuk menginduksiPneumocystis carinii
pada tikus. menginfeksi kekebalan1994; 62:4887–92.
39. Uskup LR, Kovacs JA. Kuantitas anti-Pneumocystis jiroveci antibodi
pada orang sehat dan pasien immunocompromised. J Menginfeksi
Dis2003; 187:1844–8.
40. Daly KR, Koch J, Levin L, Walzer PD. Uji imunosorben terkait-enzim dan
respons serologis terhadapPneumocystis jiroveci. Emerg Infect Dis
2004; 10:848–54.
41. Vestereng VH, Uskup LR, Hernandez B, Kutty G, Larsen HH, Kovacs JA. Uji
reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif memungkinkan
karakterisasiPneumocystis infeksi pada tikus imunokompeten. J
Menginfeksi Dis2004; 189:1540–4.
42. Donelson JE. Variasi antigenik dan genom trypanosome Afrika. Akta
Trop2003; 85:391–404.
43. Tanduk D. Kontrol molekuler variasi antigenik dalam Trypanosoma
brucei. Curr Mol Med 2004; 4:563–76.
44. Jenggot CB, Roux P, Nevez G, dkk. Metode pengetikan regangan dan
epidemiologi molekulerPneumocystis radang paru-paru. Emerg Infect Dis2004;
10: 1729–35.
45. Manoloff ES, Francioli P, Taffe P, VanMelle G, Bille J, Hauser PM. Risiko
untukPneumocystis carinii penularan di antara pasien dengan
pneumonia: studi epidemiologi molekuler. Emerg Infect Dis2003; 9:132–4.
pesan Repertoar dalam P. jirovecii ● JID 2008:198 (1 September) ● 749