BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah animal experimental dengan post test only control

group design yang didahului dengan penelitian pendahuluan. Pada awal penelitian

tikus Wistar dibagi untuk 3 kelompok. Kelompok pertama kontrol diberikan

placebo dan dipapar sinar UV-B (Perlakuan 1). Kelompok kedua tikus Wistar

diberi ekstrak pegagan 50 mg oral dan dipapar sinar UV-B (Perlakuan 2).

Sedangkan kelompok ketiga tikus Wistar diberi vitamin C 9 mg oral dan dipapar

sinar UV-B (Perlakuan 3).

Selanjutnya dari ketiga kelompok tersebut dilakukan biopsi pada kulit

punggung tikus Wistar jantan untuk dibuat dalam bentuk blok parafin,

Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah kolagen pada tikus Wistar dengan

pembuatan preparat dan pengecatan dengan reagen Sirius Red dan penilaian

ekspresi MMP-1 dengan pengecatan Immunohistokimia.

58

Lxxx

b. Variabel Tergantung

Variabel tergantung adalah variabel yang merupakan hasil perlakuan

variabel bebas yaitu kolagen dermis dan Matriks Metalloproteinase-1.

c. Variabel Kendali

Variabel kendali adalah variabel yang dapat dikendalikan antara lain jenis

tikus, umur, sehat, jenis kelamin yang sama, berat.

4.4.2 Sampel

Kriteria inklusi yang dipergunakan adalah :

1. Tikus Wistar

2. Berat badan 180 - 200 gram

3. Umur 10 – 12 minggu

4. Sehat

5. Jantan

Kriteria eksklusi : tidak mau makan, cacat fisik, hiperaktif.

Kriteria drop Out : apabila tikus Wistar mati pada saat penelitian.

4.4.3 Teknik Pengambilan Sampel

Tikus Wistar diambil dengan cara diacak sederhana dibagi menjadi tiga

kelompok. Kelompok 1 diberi placebo ( aquadest ) dan dipapar sinar UV-B.

Kelompok 2 diberi ekstrak pegagan 50 mg (oral) setiap hari dengan dosis sekali

lxxxiiikandungan vitamin C 9 mg, sehingga dosis yang dipakai adalah 9 mg /200 mg

BB tikus. Tikus secara oral (zoned lambung) .

5. Sinar ultraviolet B adalah jumlah intensitas sinar UV-B yang diberikan berasal

dari mesin sinar UV-B buatan China, tipe KN-4003 B. Alat ini dapat

memancarkan sinar UV-B dengan besar dosis radiasi dapat diukur dengan UV

meter. Paparan sinar UV-B diberikan sebanyak 3 kali seminggu selama 4

minggu dengan dosis total penyinaran sebesar 840 mJ/Cm2

6. Jumlah kolagen adalah presentasi pixel jaringan kolagen yang diamati dan

diukur dengan menggunakan mikroskop Olympus CX-21 yang dihubungkan

dengan alat Optilab untuk mengambil gambar preparat dengan pulasan

warna picro Sirius Red, dibandingkan dengan pixel seluruh jaringan yang

tampak pada foto sediaan histologis dan dinyatakan dalam persen (%).

Penilaian dilakukan pada foto preparat dalam format JPEG yang diambil

dengan kamera LC Evolution dan mikroskop Olympus Bx51 dengan

pembesaran objektif 40 kali, masing-masing preparat difoto sebanyak 3 kali.

7. Ekspresi MMP-1 adalah terlacaknya sel fibroblast berwarna coklat dalam

lapisan dermis yang mengekspresikan MMP-1 yang diperiksa secara

imunohistokimia. Pengukurannya adalah menghitung jumlah sel dengan

mikroskop Olympus Bx51 dan pembesaran objektif 400 kali, yaitu sel

fibroblast yang mengekspresikan MMP-1 dibagi dengan jumlah semua sel

fibroblast dalam tiga lapangan pandang dan dikalikan 100%, hasilnya

dinyatakan dalam satuan persen (%).

Lxxxvy

8. Tikus Wistar Jantan yang digunakan adalah tikus Wistar jantan sehat yang

berumur 10-12 minggu dengan berat 180-200 gram, diberi oral dengan alat
sonde. Dosis kontrol diberikan aquadest sesuai dengan berat badan tikus dan

dipapar sinar UV-B (Perlakuan I), ekstrak pegagan 50 mg oral diberikan sekali

sehari dan dipapar sinar UV-B (Perlakuan II), dan pemberian dosis vitamin C 9

mg oral diberikan sekali sehari lalu dipapar sinar UV-B (Perlakuan III).

9. Kualitas-kuantitas kandang adalah kandang pemeliharaan dengan atap dari

kawat, dilengkapi dengan tempat makanan-minuman dan disediakan satu

kandang untuk tiap kelompok perlakuan yang berbeda tiap tikus, yaitu tiap

kandang berisi 10 tikus. Kualitas - kuantitas makanan berupa konsentrat

makanan ayam 30%, jagung giling 40% dan dedak 30%, sebanyak 12-25 gr/

ekor/ hari, diberikan secara ad libitum. Minuman yang diberikan secara tidak

terbatas (ad libitum). Suhu ruangan dipertahankan 20-25˚C. Kelembaban dan

pertukaran udara yang ekstrim harus dihindari. Aliran udara dalam ruangan

harus lemah dan mantap (ruang berventilasi baik dengan penyinaran

normal).

4.5. Bahan dan Alat Penelitian

4.5.1. Bahan penelitian

1. Ekstrak pegagan

2. Vitamin C

Lxxxvi

3. Lampu broadband Ultraviolet buatan tipe KN-4003 B

4. Pengukur dosis radiasi (Dosimetri)

5. Kit MMP-1, antibodi MMP-1.

4.5.2. Alat penelitian

1. Kandang tikus dengan kelengkapan tempat makanan dan minum

2. Timbangan analitik

3. Papan fiksasi

4. Sendok Sonde (zoned lambung)

5. Sarung tangan

6. Labu erlemeyer

7. Alat cukur
8. Scalpel beserta dengan pisaunya

9. Bahan habis pakai lainnya

10. Kaca obyek dan kaca penutup

11. Pewarnaan Picro Sirius red

12. Mikroskop cahaya

13. Optilab

14. Kamera LC Optilab

15. Alat tulis

16. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)

Lxxxvii

4.6 Prosedur Penelitian

Penelitian dilakukan sebagai berikut :

1. Pada kelompok subjek penelitian yaitu menggunakan tikus Wistar jantan

dilakukan pengambilan sampel yang memenuhi persyaratan inklusi penelitian

secara random sebanyak tiga puluh ekor mencit.

2. Tiga puluh tikus Wistar jantan terlebih dahulu dilakukan adaptasi selama 7

hari.

3. Tiga puluh ekor tikus Wistar jantan yang sudah terbagi menjadi tiga kelompok

perlakuan diaklimatisasi di unit Animasi Laboratorium Farmakologi Universitas

Udayana. Tikus Wistar jantan dikandangkan dan setiap kandang berisi 10

ekor dan diberikan makanan standar setiap hari selama 4 minggu ad libitum.

4. Dilakukan pencukuran pada punggung tikus Wistar (area yang mendapat

penyinaran). Kelompok perlakuan pertama hanya diberikan aquadest 1cc

sebagai kontrol setiap hari selama 1 bulan secara oral (zoned lambung)

paparan sinar UV-B. Kelompok perlakuan kedua diberi ekstrak pegagan secara

oral sekali sehari dosis 50/200 mgBB tikus dan diberi paparan sinar UV-B.

Kelompok perlakuan ketiga diberi vitamin C secara oral sekali sehari dengan

dosis 9/200 mgBB lalu diberi paparan sinar UV-B.

5. Dilakukan penyinaran dengan menggunakan sinar UV-B merek KN-4003,

dengan dosis total penyinaran pada kelompok pertama sampai dengan

kelompok ketiga sebesar 840 mJ/cm2, dengan perincian: 50 mJ/cm2 . pada

lxxxviii

minggu pertama, 70 mJ/cm2 pada minggu ke dua dan 80 mJ/cm2 pada minggu

ke 3 dan ke 4. Penyinaran diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu,

sehingga dosis totalnya mencapai 840 mJ/cm2.

6. Langkah Paparan Sinar UV-B tikus Wistar jantan.

Tabel 4.1

Jadwal dan waktu penyinaran UV-B

Jadwal Penyinaran Dosis sinar UV-B Lama penyinaran

Minggu I

( Senin, Rabu, Jumat )

50 mJ/cm2 50 detik

Minggu II

( Senin, Rabu, Jumat )

70 mJ/cm2 70 detik

Minggu III dan IV

(Senin, Rabu, Jumat )

80 mJ/cm2 80 detik

7. Tikus Wistar jantan dibiarkan terlebih dahulu selama dua puluh empat jam

setelah penyinaran berakhir untuk menyingkirkan pengaruh efek penyinaran

akut (Vayalil dkk., 2004).

8. Untuk mengambil sampel kulit pada mencit dilakukan biopsi. Sebelum

dibiopsi, dilakukan biopsi terlebih dahulu menggunakan xylazine dan

ketamin. Dengan dosis xylazine 4-8 mg/ kgBB IM dan Ketamin 22-44mg/ kgBB

IM (KNEPK, 2011).

9. Pembuatan sediaan histologis dibagi menjadi tiga tahapan yaitu tahap fiksasi,

dehidrasi, clearing dan embeding. Jaringan kulit hasil biopsi kulit mencit

masing-masing dengan diameter 5 mm dan kedalaman sampai sub kutan

lxxxix

menggunakan kamera Optilab Pro ( Miconos, Indonesia ). Hasil

mikrofotografi dianalisis menggunakan perangkat lunak image Raster 2.1 .

Kadar MMP-1 (%) = Fibroblast yang mengekspresikan MMP-1 x 100%

Total fibroblas pada lapang pandang

4.7 Sampel Penelitian

Sampel menggunakan tikus Wistar jantan sehat dengan berat 180-200

gram dan umur tikus Wistar 10 – 12 minggu.

Besar sampel yang digunakan dihitung dengan rumus Federer (2008)

(n-1) x (t-1) ≥ 15

t= jumlah perlakuan / kelompok = 3

Jadi perhitungannya sebagai berikut ( n-1 ) x ( 3-1 ) ≥ 15

(n – 1) x 2 ≥ 15

n ≥ 7,5 + 1

n ≥8,5

Tiap kelompok ditambah 10% sebagai cadangan

Jumlah cadangan tikus Wistar : 10% x 9 = 0,9≈ 1

Populasi yang diambil dalam penelitian ini sejumlah 30 ekor tikus

Wistar secara keseluruhan, yang terbagi menjadi 3 kelompok, kelompok pertama

10 ekor tikus Wistar sebagai kontrol dan dipapar sinar UV-B, kelompok kedua

10 ekor tikus Wistar dengan perlakuan pemberian oral ekstrak pegagan 50 mg

dan dipapar sinar UV-B. Kelompok ketiga 10 ekor tikus Wistar dengan

perlakuan pemberian oral Vitamin C 9 mg.

xciv4.6.1 Tehnik penentuan sampel

Tehnik penentuan sampel dilakukan dengan cara sebagai berikut :

a. Dari populasi dari populasi tikus Wistar diadakan pemilihan sampel berdasarkan

kriteria inklusi.

b. Dari jumlah sampel yang telah memenuhi syarat diambil secara acak (random)

untuk mendapatkan jumlah sampel

Dari sampel yang telah dipilih kemudian dibagi menjadi 3 kelompok secara

random yaitu Kelompok Perlakuan I, Kelompok Perlakuan II, dan Kelompok

Perlakuan III dibagi menjadi 3 kelompok. Perlakuan I kontrol/ plasebo diberikan

aquadest secara oral dengan dosis 1 cc sekali sehari dan dipapar sinar UV-B

(Perlakuan 1). Kelompok perlakuan kedua tikus Wistar diberi ekstrak pegagan

secara oral dengan dosis 50/200 mgBB tikus sekali sehari dan dipapar sinar UV-B
(Perlakuan 2). Sedangkan kelompok ketiga tikus Wistar diberi secara oral

vitamin C dengan dosis 9/200 mgBB dan dipapar sinar UV-B (Perlakuan 3).

xcv