A.

Tujuan
1. Untuk mengetahui Nano kuantitas pada DNA
2. Untuk mengetahui Elfo kualitas pada DNA
B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana Nano kuantitas pada DNA
2. Bagaimana Elfo kualitas pada DNA
C. Dasar Teori
a. Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-
molekul lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis
yaitu visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan
pustaka genomik, rekayasa gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga
tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi DNA ini,
yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran
sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap
protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse).  Dewasa ini telah
banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan
ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu genetika (Cheng dan Zhang,
2008).Dalam praktikum kali ini, dilakukan isolasi DNA pada sampel darah
pada otot ikan
Isolasi atau ekstraksi DNA merupakan proses pemindahan DNA
dari sel atau virus. Isolasi DNA merupakan langkah awal dalam
melakukan analisa DNA menggunakan metode elektroforesis atau PCR,
dapat pula dijadikan langkah awal untuk dapat mendiagnosa penyakit
apapun, termasuk bawaan genetik, sejak dini. Isolasi DNA banyak
metodenya sesuai dengan sampel apa yang akan kita isolasi. untuk isolasi
sel hewan tidak perlu menggunakan nitrogen cair,karena tidak mempunyai
dinding sel yang keras sel hewan cukup memakai buffer lisis,untuk
melisiskan selnya (Davis et al, 1994).

b. Prinsip Kerja Isolasi DNA

 Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang
penting dalam tubuh makhluk hidup yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler. Dalam suatu sel keseluruhan DNA akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun
non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen
danintergen (Suryo, 2004). DNA terdapat dibeberapa tempat diantaranya
terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA disetiap tempat
memiliki ciri khas yang berbeda DNA nucleus nucleus berasosiasi erat
dengan protein histon dan berbentuk linier sedangkan DNA pada
mitokondri dan kloroplas tidak berasosiasi dengan protein histon dan
berbentuk sirkular. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot
tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Pramono. 2001).
Isolasi DNA merupakan proses pengeluaran DNA dari tempatnya
berada dengan cara ekstraksi atau lisis keduanya dapat dilakukan dengan
homogenisasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah rusaknya DNA (Yuwono, 2008). Menurut Elrod (2007)
pemisahan DNA dari materi seluler lainya merupakan hal yang signifikasi
dan mengharuskan penyalinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA
menjadi protein berlangsung dalam kompartemen (ruang) yang berbeda
yaitu secara berurutan dalam nucleus dan sitoplasma.
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam
melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk
mengendapkan suatu komponen dari campuran (Faatih, 2009).
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2)
Lisis dinding dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi;
dan (5) Presipitasi. Isolasi sel merupakan tahap pertama yang dilakukan
yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan. Yang kedua adalah pelisisan
dinding dan membran sel yaitu proses melisiskan dinding dan membran
sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan
lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau
buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang
diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan
untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang
mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari
komponenkomponen sel lainnya yang tidak berfungsi. Selanjutnya adalah
Pengekstraksian dalam larutan. Supernatan yang terbentuk dibuang dan
kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar
didapatkan ekstrak.
Tahap selanjutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk
membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut
kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu
65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang
sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk
menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara
utuh. Tahap terakhir adalah Presipitasi. Tahap ini bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan
cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang
bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein
terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein
mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah,
sehingga menyebabkan protein mengendap (Faatih, 2009).
D. Alat dan Bahan
Alat :
1. Sentrifuge
2. Vortex
3. Freezer
4. Waterbath
5. Mikropipet
6. Mikro pestel
7. Cetakan gel
8. Alat pencetak sumur
9. Nanodrop
10. Tabung ependorf
11. Tray elektroforesis

Bahan :
1. Sampel darah otot pada ikan
2.
NTES Lysis Buffer
Formula Final 200 mL 50 mL 10 mL 5 mL
Conc.
5 M NaCl 100 mM 4 mL 1 mL 0.2 mL 0.1 mL
1 M Tris 50 mM 10 mL 2.5 mL 0.5 mL 0.25 mL
(pH8.0)
0.5 M 50 mM 20 mL 5 mL 1 mL 0.5 mL
EDTA (pH
8.0)
10% SDS 1% 20 mL 5 mL 1 mL 0.5 mL
ddH2O - 146 mL 36.5 mL 7.3 mL 3.65 mL
20 mg/mL 0.2 mg/mL 2 mL 0.5 mL 100 uL 50 uL
Protein
Kinase K
3. 500 uL larutan Phenol/Chloroform/Isoamyl alkohol = (25:24:1)
4. Alcohol 70%
5. Alcohol absolut
E. Prosedur Kerja

Menambahkan 500 uL NTES lysis buffer pada sampel dan sebaiknya diinkubasi
pada 50-55 0 C semalam.

Menambahkan 500 uL larutan Phenol/Chloroform/Isoamyl alkohol = (25:24:1),

menghomogenisasinya dengan pipetting dilanjutkan sentrifugasi 13,000 rpm selama
10 menit pada suhu ruang.

Memindahkan aqueous phase pada tabung Eppendorf baru (maksimal sekitar 300-
400 uL).

Menambahkan 500 uL 100% alkohol dan membolak-balikkan tabung Eppendorf

secara perlahan (5-10 kali).

Melakukan sentrifugasi 13,000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang, kemudian
membuang supernatant.

Mencuci DNA pellet dengan 500 uL 70% alkohol dan disentrifugasi pada 13,000
rpm selama 10 menit pada suhu ruang (maximal 2x pencucian).

Mengeringkan angin tabung Eppendorf setelah membuang sisa alkohol 70% dalam
tabung selama 20-30 menit.

Melarutkan DNA hasil isolasi dengan 10-20 uL ddH20 atau TE buffer dilanjutkan
dengan kuantifikasi konsentrasi DNA pada nanodrop.

F. Hasil Pengamatan

Hasil kuantifikasi konsentrasi DNA pada nanodrop.

G. Analisis Data
Berdasarkan dari hasil kuantifikasi konsentrasi DNA pada nanodrop
keempat sampel darah memiliki hasil yang berbeda-beda yaitu 1,65, 1,72, 1,88,
dan 1,59. Hanya satu sampel yang merupakan DNA murni yaitu 1,88.
H. Pembahasan
Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang penting
dalam tubuh makhluk hidup yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
Dalam suatu sel keseluruhan DNA akan membentuk genom. Genom meliputi
bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA
genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004). DNA terdapat dibeberapa tempat
diantaranya terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA disetiap
tempat memiliki ciri khas yang berbeda DNA nucleus nucleus berasosiasi erat
dengan protein histon dan berbentuk linier sedangkan DNA pada mitokondri dan
kloroplas tidak berasosiasi dengan protein histon dan berbentuk sirkular. Dilihat
dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon (Pramono. 2001).
Isolasi DNA merupakan proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada
dengan cara ekstraksi atau lisis keduanya dapat dilakukan dengan homogenisasi
dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah rusaknya DNA
(Yuwono, 2008). Menurut Elrod (2007) pemisahan DNA dari materi seluler
lainya merupakan hal yang signifikasi dan mengharuskan penyalinan DNA
menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam
kompartemen (ruang) yang berbeda yaitu secara berurutan dalam nucleus dan
sitoplasma.
Proses pengambilan DNA dari organisme yang akan diuji dapat melalui
berbagai macam cara, mengambil sampel darah atau langsung mencampurkannya
dengan larutan SDS. Perlunya dilakukan dengan mencampurkan dengan SDS
terlebih dahulu, untuk melisiskan sel, dan mengeluarkan DNA yang terdapat di
dalamnya, serta menjaga DNA untuk tetap utuh, walau sel telah lisis. Untuk
memisahkan DNA dengan organel-organel lain di dalam sel, campuran
disentrifugasi. Sentrifuga memiliki prinsip perbedaan berat jenis saat dilakukan
pemutaran dengan kecepatan tertentu, sehingga akan diperoleh hasil dengan
larutan yang memiliki berat jenis yang lebih ringan akan berada paling atas
(biasanya akan terbentuk 2-3 fasa) (Lee & Bahaman, 2010).
Setelah sel lisis dan dipisahkan, DNA harus segera dijaga keadaan
fisiologisnya dalam lingkungan yang memungkinkan, yaitu dengan
mencampurkannya dengan sejenis buffer yang mengandung fenol dan kloroform.
Sehingga DNA dalam keadaan utuh dan terjaga fisiologisnya. Kemudian larutan
dihomogenisasi atau di vortex, setelah itu larutan kembali disentrifuga, yang
nantinya akan diperoleh DNA berada di atas dan fasa organik dengan fenol dan
kloroform berada di bawah. DNA yang telah dipisahkan setelah disentrifugasi
diendapkan menggunakan etanol atau isopropanol, karena DNA tidak dapat larut
dalam etanol maupun isopropanol, sehingga DNA akan mengendap. Kemudian
setelah dilakukan pemurnian DNA, DNA dikeringkan, lalu dilarutkan dalam TE
untuk presipitasi agar dapat disimpan untuk analisis DNA selanjutnya. Secara
keseluruhan, tahapan isolasi DNA adalah pemecahan sel, pemisahan protein,
pengendapan DNA, dan pemurnian DNA (Lee, 2010).
Pada percobaan digunakan berbagai macam larutan dan reagen. Larutan-
larutan dan reagen tersebut memiliki fungsi tersendiri. Buffer ekstraksi
mengandung Tris-HCl-SDS yang masing-masing bahan tersebut memiliki fungsi
masing masing. Tris-HCl berperan penting dalam kestabilan pH. Kestabilan pH
menjadi hal yang krusial karena pH yang pas akan membuat DNA tidak ikut
terdenaturasi. Menurut Boffey (1994), SDS merupakan deterjen yang memiliki
fungsi membuang lipid dan protein pada proses purifikasi DNA. Pada isolasi
DNA juga terdapat penambahan Kloroform Isoamil atau disebut juga dengan CI
yang memiliki fungsi untuk menghilangkan kontaminan protein. Protein yang
telah dipisahkan nantinya akan terendapkan oleh etanol.
Layaknya percobaan-percobaan lain yang membutuhkan beberapa reagen
kimia untuk mendukung dan mempermudah proses percobaan, pada percobaan
kali inipun digunakan beberapa jenis reagen untuk isolasi DNA tanaman bayam,
diantaranya ethanol 75%, buffer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl, EDTA,
NaCl, dan 2-merkaptoetanol (SDS), isopropanol, nitrogen cair, larutan fenol :
kloroform : Isoamil alkohol (25:24:1), potassium asetat, serta sodium asetat.
Masing-masing buffer memiliki fungsinya tersendiri, misalnya saja salah satu
reagen yang penting yakni buffer ekstraksi yang digunakan mengandung Tris
HCl, EDTA, dan SDS. Tris HCl berperan sebagai buffer yang mengatur pH
larutan ekstraksi. Ethylenediamine tetraacetic acid atau EDTA berperan sebagai
chelating agent yang mengikat ion metal dalam larutan ekstraksi (Henry, 2001).
EDTA melemahkan sel dengan mengikat ion bivalen (Mg+2 dan Ca+2) yang
diperlukan untuk kestabilan membran sel. EDTA juga digunakan agar enzim
nuklease yang dapat mendegradasi DNA tidak aktif. Sementara itu SDS (sodium
dodecyl sulfate) merupakan detergen biologis yang menyebabkan membran sel
hancur serta mengemulsikan lipid dan protein sel dengan mengganggu interaksi
polar yang mengikat membran sel (Brooks, 2013).
Selain buffer ekstraksi, digunakan pula larutan fenol:kloroform:isoamil
alcohol (25:24:1) yang berperan sebagai pelarut organik yang dapat melarutkan
protein dan polisakarida, namun tidak dapat melarutkan DNA. Oleh karena itu
pelarut ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNAdari komponen-komponen
organik lainnya (Henry, 2001).
Berdasarkan dari hasil kuantifikasi konsentrasi DNA pada nanodrop keempat
sampel darah memiliki hasil yang berbeda-beda yaitu 1,65, 1,72, 1,88, dan 1,59.
Hanya satu sampel yang merupakan DNA murni yaitu 1,88. Kemungkinan DNA
terkontaminasi protein. Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol sekalipun)
akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi smear karena
kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi DNA. Kontaminan
tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat tidak jelas dan buruk
akibat DNA yang dielektroforesis tidak sepenuhnya DNA murni. (Brooks, 2013).

Rujukan :
Boffey, S.A. 1994. Isolation of high molecular weight DNA in methods in
Molecular Biology, vol 2: Nucleic Acids. Humana, Totowa, NJ.
Brooks, GF., Carroll KC, Butel JS, Morse, and all (2013). Mikrobiologi
Kedokteran
Jawetz, Melnick, & Adelberg. Ed. 25. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran
EGC.
Cheng, Liang and David Y. Zhang. 2008. Molecular Genetic Pathology. New
Jersey : Humana Press
Davis, L., M. Kuvhi, & J. Battey. 1994. Basic methods: molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Henry, Robert J. 2001. Plant Genotyping : The DNA Fingerprinting of Plants.
New York : CABI Publishing.
Lee, S.V & Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA
fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine.
27(2).
351-354.
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.
Pramono, H. 2011. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed,
Purwokerto.
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
Faatih M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi. Surakarta: Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universita s
Muhammadiyah Surakarta.