Derivatisasi / penambahan kromofor pada asam traneksamat dan

penentuannya dengan HPLC dalam formulasi sediaan farmasi.

University of Bahrain
M. Ashfaq, A. Aslam, G. Mustafa, M. Denmark, M. Faizan Nazar, M.
Nadeem Asghar
Departemen Kimia, HH Kampus, Universitas Gujarat, 50700 Gujrat, Pakistan b
Departemen Kimia, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam, Forman Christian
College (A Chartered University),
Ferozepur Road, 54600 Lahore, Pakistan

KATA KUNCI
Abstrak keberlangsungan biaya yang hemat dan dijalankan secara isokratik
menggunakan kolom C-18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) berdasarkan HPLC telah
digunakan untuk memisahkan dan memperkirakan obat, asam tranexamat
dalam formulasi sediaan farmasi. Asam traneksamat tidak mengandung p-
elektron untuk bertindak sebagai fluofor atau kromofor maka derivatisasi
pra-kolom dilakukan dengan menambah benzena sulfonil klorida dalam
media berair pada suhu kamar. Obat diderivatisasi kemudian diukur
menggunakan kolom C-18 dengan perbandingan pelarut asetonitril dan 0,1
M amonium Acetate (pH 5.0) 25:75 (v / v) dan digunakan sebagai fase gerak.
Laju aliran fase gerak adalah 1 mL / menit dan deteksi dilakukan pada
panjang gelombang 232 nm menggunakan detektor UV. Waktu retensi asam
traneksamat adalah 4.42min. Metode ini dihitung persamaan regresi linear
pada rentang konsentrasi 1- 100 lg / mL dengan korelasi sebesar 0,9994.
Batas deteksi dan batas kuantisasi masing-masing 0,3 dan 1 lg / mL. Deviasi
standar relative dan range recovery untuk asam traneksamat didapatkan
hasil 0,11-2,47% dan 97,60-103,25% .Metode ini sangat sensitif dan mungkin
memiliki potensi untuk digunakan sebagai deteksi asam traneksamat dalam
formulasi obat.

1. Pendahuluan
Asam traneksamat (Gbr. 1) memiliki nama kimia trans-4- (aminomethyl) asam
siklohexana adalah sintetis amino, mirip dengan lisin, biasa digunakan untuk
menyembuhkan perdarahan abnormal dalam berbagai penyakit (Boylan et al.,
1996; Nilsson, 1980). Obat ini hidrofilik dan memiliki khasiat sebagai
antifibrinolytic serta obat hemostatik (Furtmuller et al., 2002)
Asam traneksamat melakukan aktivitas antifibrolistik- sebagai blok kompetitif
situs-situs dari protein plasmin, plasminogen, plasminogen activator yang
mengikat lisin sehingga interaksi lisin dengan fibrin dicegah. sehingga
plasminogen tidak dapat dikonversi menjadi plasmin dan dengan cara ini
aktivitas proteolitik dicegah.
Asam traneksamat tidak memiliki p-elektron sehingga tidak dapat
bertindak sebagai fluorophore atau kromofor dan karenanya tidak dapat
diukur melalui spektroskopi UV. Oleh karena itu penting untuk derivatisasi
senyawa ini sehingga dapat mengukur aktif derivative UV melalui HPLC-UV.
Banyak makalah yang menjelaskan derivatisasi obat ini dengan berbagai
reagen diikuti dengan pengukuran HPLC mereka. Beberapa metode yang
digunakan yaitu ninhidrin metanol (Natesan et al., 2011), phenylisothiocynate
(Hadad et al., 2007), 2-hidroksida naphthaldehyde dalam etanol-air
(Khuhawar dan Rind, 2001) dan natrium picrylsulfonate (Nojiri et al., 1995)
diikuti oleh penentuan mereka melalui HPLC-UV. Selain ini, metode LC-
fluoresensi memanfaatkan naftalena-2,3-dicarboxaldehyde ditambah sianida
(Huertas-Perez et al., 2007), phthalaldehyde o- (Elworthy et al., 1985), metode
elektrokimia (Shih et al., 2008), metode LC-MS (Chang et al., 2004) dan UPLC-
MS / MS (Abou-Diwan et al., 2011) juga terbukti untuk penentuan asam
traneksamat. Sebuah metode RP-HPLC untuk penentuan asam traneksamat
bersama dengan zat terkait dan metode GC juga sudah di lakukan. Semua
metode tersebut menggunakan prosedur yang kompleks untuk derivatisasi
dan kuantifikasi nya. Dalam metode kami hanya menggunakan metode yang
sederhana, benzena sulfonil klorida digunakan sebagai reagen derivatisasi
dan reaksi berlangsung pada aquadest pada pH dasar. Produk diderivatisasi
kemudian diukur menggunakan HPLC deteksi UV dengan total waktu analisa
kurang dari lima menit. Metode yang dikembangkan dapat digunakan untuk
asam traneksamat dan sejenis nya dalam formulasi farmasi.
2. Eksperimental
2.1. Bahan kimia dan reagen
Asam traneksamat murni yang diklaim mempunyai kemurnian 99,65%
didapat dari dari Munawwar Pharma (Lahore, Pakistan). Asetonitril dengan
standar HPLC grade, sedangkan bahan kimia lain denfan standar reagen
analitis yang dibeli dari MS Pedagang (Agen dari Fluka di Pakistan).
Sepanjang analisis, air suling ganda digunakan. Untuk tahap filtrasi mobile,
0.45 lm filter nilon yang digunakan (Millipore, USA).
2.2. Peralatan dan kondisi kromatografi
HPLC Shimadzu LC-20A (Kyoto, Jepang), dilengkapi dengan detektor UV-
Visible dan auto sampler. Jumlah sampel yang diinjeksikan sebanyak 20
mikroliter tiap percobaan. Kondisi kromatografi yang dioptimalkan digunakan
kolom C18 (250 × 4,6 mm, 5 mikroliter) dan digunakan fase gerak campuran
asetonitril dan 0,1 M amonium asetat (pH 5.0) dengan rasio (25:75, v / v).
Disetting flow rate fase gerak dengan 1,0 mL / menit dan temperature pada
suhu ruang (25 ± 2 ° C).
2.3. Derivatisasi asam traneksamat
Asam traneksamat sebanyak 2 g dilarutkan dengan 15-20 mL air suling dalam
bekker gelas. Larutan natrium karbonat (2-3%) diteteskan sampai semua
asam traneksamat dapat larut dan pH mencapai antara 8 dan 9. pH larutan ini
dipertahankan antara 8Dan 9. Equimolar benzena sulfonil klorida (1,904 mL)
ditambahkan ke dalam larutan kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik
pada temperature tertentu. PH campuran dijaga 8-9 dengan menambahkan
beberapa tetes Na2CO3, setiap kali pH diturunkan. Pengadukan dilanjutkan
sampai reaksi selesai. Pada pH tahap ini larutan akan berhenti menurunkan
pH dan akan tetap konstan. Setelah itu,ditambahkan 2-3 M HCl setetes demi
setetes ke dalam larutan sampai terbentuknya endapan putih. Endapan
terbentuk disaring, dicuci dengan aquadest kemudian dikeringkan. Produk ini
selanjutnya digunakan untuk membuat larutan standar.
2.4. Persiapan stock dan larutan standar
Larutan stok asam traneksamat (1000 lg / mL) disiapkan dengan melarutkan
produk yang setara asam traneksamat 100 mg dalam fase gerak 100 mL. Dari
larutan stok ini, beberapa larutan standar dari berbagai konsentrasi disiapkan
dengan cara membuat pengenceran.
2.5. Persiapan larutan sampel
Dua puluh tablet ditimbang dan digerus halus dengan mortar dan stamfer.
Kemudian ditimbang seksama 200mg asam traneksamat dicampur dengan
0,19 mL benzena sulfonil klorida dalam 10-15 mL aquadest kemudian
dilanjutkan seperti yang dijelaskan dalam prosedur derivatisasi. Seluruh
produk yang diperoleh dilarutkan dalam fase gerak dan kemudian diencerkan
untuk mendapatkan konsentrasi setara dengan 10 lg / mL.

2.6. Linearitas
Untuk menguji linearitas, lima larutan 100, 50, 10, 5 dan 1 lg / mL dalam
kisaran 1-100 lg / mL disiapkan dan kemudian dianalisis. Setiap konsentrasi
disuntikkan tiga kali dan luas puncak dicatat.
2.7. Akurasi
Teknik untuk mencari keakuratan data adalah "Teknik standar adisi ''.
Disiapkan tiga larutan dengan konsentrasi yang berbeda 10, 25 dan 50
mikrogram / mL dimasukin dalam labu takar 25mL diadkan dengan air
sampai tanda. Hasilnya dibandingkan dengan yang diperoleh dengan larutan
standar awal yang sudah disiapkan.
2.8. Presisi
Hal ini dinyatakan dalam hal standar deviasi relatif. Ketepatan dilakukan
dengan menggunakan 3 konsentrasi yang berbeda dari larutan. Setiap
konsentrasi disuntikkan pada kolom, pada selang waktu satu jam, dalam
rentang tiga jam dalam sehari.antar-hari presisi diakses dengan
menyuntikkan tiga konsentrasi berbeda--beda dari larutan berturut-turut
selama tiga hari.
2.9. Selektivitas
Untuk melanjutkan selektivitas, campuran sintetis asam traneksamat dengan
pati, laktosa, magnesium stearat dan mikro selulosa kristal yang umumnya
digunakan sebagai eksipien disiapkan. Campuran sintetis ini kemudian
dilanjutkan seperti yang dijelaskan dalam persiapan sampel dan kemudian
dianalisis dengan metode yang diusulkan untuk memeriksa setiap jenis
gangguan yang mungkin disebabkan oleh kontaminan.

3. Hasil dan diskusi

3.1. Derivatisasi dari asam traneksamat
Derivatisasi sebenarnya dianggap sebagai proses dapat menyebabkan
perubahan kimia dalam analit, yang akan dianalisis dengan metode analisis
tertentu (HPLC dalam kasus ini). Perubahan kimia ini memberikan
karakteristik dan sifat sesuai dengan analit. Dalam penelitian ini, derivatisasi
dari asam traneksamat dilakukan untuk memberikan karakteristik sehingga
memungkinkan untuk dianalisis melalui detektor UV.
Absorbansi produk diderivatisasi diperiksa dengan spektrofotometer
setelah dilarutkan dalam etanol. Absorbansi maksimum adalah 232 nm yang
digunakan dalam sistem HPLC. Didapatkan diagram skematik dari reaksi
diberikan dalam Skema 1.
3.2. Metode pengembangan dan optimasi
Dalam karya ini tujuannya adalah untuk mengembangkan metode HPLC yang
sensitif, sederhana, akurat dan isokratik sehingga asam traneksamat dapat di
analisa. pada awalnya dipakai fase mobile yang berbeda untuk mendapatkan
kemungkinan pemisahan terbaik pada asam traneksamat. Fase gerak yang
mengandung 0,1 M ammonium asetat dan asetonitril memiliki rasio 75:25 (v /
v) dan kolom C-18 sebagai fase diam terbukti paling cocok untuk tujuan
pemisahan dengan laju alir 1mL / menit. Dengan menerapkan kondisi
kromatografi ini, peak dari asam traneksamat tercapai dengan waktu retensi
4,42 ± 0,02 menit. Sebuah kromatogram asam traneksamat ditunjukkan pada
Gambar. 2.
Pengembangan metode dengan menggunakan fase gerak kurang polar
asetonitril 50% akan tetapi tidak ada puncak muncul. Kemudian polaritas fase
mobile ditingkatkan dengan menggunakan 0,1 M amonium asetat (pH 5.0).
Pemilihan 0,1 M buffer asetat didasarkan pada hasil kami sebelumnya di
mana banyak dari senyawa kami terelusi dengan baik (Ashfaq et al, 2007,
2008;.. Khan et al, 2010a, b). Suatu komposisi dari fase gerak terus-menerus
berubah bertujuan untuk mendapatkan pemisahan yang terbaik. Peningkatan
asetonitril dalam elusi asam traneksamat menunjukan puncak yang
mengekor. Amonium asetat (pH 5.0) dan asetonitril pada perbandingan 75:25
(v / v) memberikan peak yang ramping serta pemisahan yang baik.
komposisi ini dianggap komposisil terbaik dari fase gerak dan selanjutnya
digunakan dalam semua percobaan.
3.3. Validasi metode
Metode kromatografi, yang telah dikembangkan untuk menentukan asam
traneksamat, divalidasi dengan menggunakan pedoman dari ICH (ICH, 1996).
Berbagai parameter dari pedoman ICH yang terlibat dalam studi ini meliputi
presisi, akurasi, linearitas, batas kuantisasi / deteksi, selektivitas dan
ketahanan.
Untuk menunjukkan linearitas, lima larutan dalam kisaran konsentrasi 1-
100 mg / mL, 100, 50 , 10, 5 dan 1 mg / mL disiapkan dan kemudian
dianalisis. Linearitas yang sangat baik terlihat selama rentang konsentrasi
yang digunakan untuk asam traneksamat. Kurva kalibrasi digambar dengan
mengambil konsentrasi yang berbeda pada sumbu x dan daerah rata-rata
mereka pada y-axis. Persamaan regresi linier untuk asam traneksamat adalah
Y = 17583x + 138159 dengan nilai koefisien determinasi sebagai R2 = 0,9994.
Hal ini menunjukkan bahwa hubungan linier yang baik antara konsentrasi
obat dan daerah puncak mereka.
Untuk semua prosedur analisis, batas deteksi disesuaikan menjadi titik di
mana analisis kami layak dan hanya yang sesuai. Pendekatan statistik dapat
digunakan untuk menemukan titik yang khusus ini. Sementara nilai LOQ atau
batas kuantifikasi dianggap sebagai konsentrasi. Hasil ini juga dapat dicari
dengan menggunakan pendekatan statistik. Dari semua larutan standar yang
tersedia dengan konsentrasi yang berbeda dari asam traneksamat kuantifikasi
(LOQ) dan batas deteksi (LOD) ditemukan setelah evaluasi sinyal untuk rasio
kebisingan masing-masing adalah 10: 1 dan 3: 1 . Untuk asam traneksamat,
nilai LOQ adalah 1 mg / mL dan nilai LOD adalah 0,3 mg / mL.
Studi tentang akurasi metode yang disarankan yaitu dengan membuat tiga
larutan konsentrasi yang berbeda (10, 25 dan 50 ug / mL) menggunakan
teknik standar adisi. Larutan dianalisis dengan menggunakan metode yang
dijelaskan. Percobaan pemulihan digunakan untuk perhitungan dari
persentase nilai RSD. Hasil standar deviasi dan pemulihan untuk asam
traneksamat terdapat pada Tabel 1.

Gambar 2 kromatogram Perwakilan dari asam traneksamat setelah

derivatisasi. Kondisi kromatografi: fase gerak amonium asetat pH buffer 5.0
dan asetonitril 75:25 v / v, kolom C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 mm), panjang
gelombang 232 nm, laju alir 1 mL / menitpemulihan.
Ketiga larutan dengan kosentrasi berbeda yang digunakan untuk percobaan
metode akurasi juga digunakan pada percobaan presisi (intrerday dan
intraday). Metode presisi yang dimaksudkan dalam hal persentase RSD
dengan menganalisis ketiga larutan tersebut. Untuk intra-hari presisi, semua
tiga konsentrasi disuntikkan dalam kolom, pada selang satu jam, tiga kali
sehari. Antar-hari presisi selesai dengan menyuntikkan konsentrasi asam
traneksamat berturut-turut selama tiga hari. Hasil dari kedua intra dan inter-
hari presisi diberikan dalam Tabel 2.
Untuk melaksanakan ketahanan, merencanakan sebelumnya perubahan
kecil yang dilakukan dalam kondisi eksperimental dan kemudian respon
terhadap mereka berubah parameter diukur. Hasil diberikan dalam Tabel 3,
yang mencerminkan variasi kecil dalam parameter grafis chromatograph
terhadap perubahan kromatografi kecil.
Untuk menentukan selektivitas, campuran sintetis asam traneksamat
dengan eksipien nya dalam formulasi tablet seperti pati, laktosa, magnesium
stearat dan mikro selulosa kristal disiapkan. Campuran sintetis ini kemudian
diperiksa seperti yang dijelaskan dalam persiapan sampel dan kemudian
dianalisis dengan metode yang ditentukan untuk memeriksa setiap jenis
interferensi yang mungkin disebabkan oleh partikel-partikel asing. Hasil
pengujian disajikan dalam Tabel 4, tidak menunjukkan gangguan yang
disebabkan oleh partikel-partikel asing.
Metode ini digunakan untuk penentuan asam traneksamat dalam formulasi
farmasi dan hasilnya diberikan dalam Tabel 5, yang menunjukkan pemulihan
yang sangat baik.
4. Kesimpulan
Dalam studi ekonomi tertentu, sederhana, akurat, peka, metode selektif dan
tepat dikembangkan dengan menggunakan HPLC untuk menentukan asam
traneksamat. Obat ini tidak mempunyai gugus kromofor itulah sebabnya
perlu diderivatisasi sehingga dapat dideteksi oleh detektor UV HPLC. Metode
ini juga divalidasi sesuai dengan pedoman yang diberikan oleh ICH. Validasi
metode selesai dengan menguji presisi, linearitas, akurasi, nilai-nilai LOD dan
LOQ. Dibandingkan dengan metode lain, metode HPLC ini cukup layak serta
hemat biaya untuk mendeteksi asam tranexamat. Metode ini sangat cocok
dan tepat menyebabkan puncak obat muncul dalam waktu kurang dari lima
menit dan waktu berjalan singkat. Metode yang digunakan juga cukup
mampu untuk penentuan rutin obat. Metode ini juga linear, tepat dan
memberikan akurasi yang baik sebagai data dan Perhitungan yang dari hasil
percobaan yang berbeda menunjukkan. Hasil akurasi dan presisi percobaan
menyimpulkan bahwa metode ini berguna untuk evaluasi pengendalian
kualitas asam traneksamat. Dari nilai-nilai yang diperoleh percobaan, terbukti
bahwa metode HPLC mampu dan sesuai untuk penentuan asam traneksamat.