LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ISOLASI DNA & ELEKTROFORESIS DNA”

Disusun oleh :

Nama : Rezalia Asia Putri

NIM : 182210101058

SHIFT/KEL : C1-3

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
1. TUJUAN PRAKTIKUM
1.1 Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri
Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri

1.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan Pet ads dari
bakteri Escherichia coli

1.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

a) Mahasiswa mampu menganalisis DNA Plasmid menggunakan elektroforesis
agarose.
b) Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi.

2. TEORI UMUM
2.1. Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri
Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA (asam
deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA
kromosomal dan ekstra kromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas, dan plasmid.
DNA kromosomal pada organisme eukariotik terdapat pada inti sel, sedangkan DNA
kromosomal pada prokariot terletak pada sitoplasma. DNA (asam deoksiribonukleat)
termasuk salah satu biomolekular asam nukleat selain RNA yang penting dalam
makhluk hidup khususnya berkaitan dengan fungsi yang dapat dibawanya dalam
mengendalikan karakter makhluk hidup. Karena pentingnya peran DNA didalam
sebuah sel yaitu sebagau materi genetika, maka isolasi DNA merupakan teknik dasar
yang harus dimiliki untuk mempelajari bioteknologi molecular. DNA kromosom
memiliki ukuran yang besar ( > 0,5 Mb) dibandingkan dengan DNA plasmid (±2𝐾𝑏)
Untuk mengisolasi DNA kromosom bekteri perlu dilakukan beberapa langkah,
yaitu menumbuhkan bakteri dan pemanenan bakteri untuk mendapatkan sel yang
cukup, pemecahan dinding sel bakteri yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA
kromosom dari komponen sel lainnya. Pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan
du acara, yaitu secara fisika da kimia. Sel dapat dipecah menggunakan kekuatan
mekanik seperti freeze thaw, bead mill homogenization, atau resonansi misalnya
metode sonikasi. Sedangkan secara kimia sel dapat dirusak dengan buffer lisis berisi
 senyawa kimia (lisosim, EDTA, Tris, HCl, atau detergen sodium dodecyl sulfat (SDS))
yang dapat merusak integritas barrier dinding sel. Selanjutnya, pemisahan DNA dapat
dilakukan dengan sentrifugasi.
Pada praktikum kali ini, isolasi DNA genom dilakukan dengan menggunakan
metode cair (solution based method). Secara umum tahapan isolasi DNA meliputi:
1. Pemecahan dinding sel
2. Ekstraksi DNA
3. Presipitasi dan purifikasi asam nukleat.

Pemecahan sel secara fisik dilakukan dengan kekuatan mekanik atau resonansi,
sedangkan pemecahan secara kimia dapat dilakukan dengan menggunakan lisozim, Tris
CL, EDTA, dan detergen seperti SDS.

Pada tahap ekstraksi, DNA dipisahkan dari pengotornya menggunakan

campuran fenol : kloroform : isolamil alcohol (25:24:1). DNA yang diperoleh setelah
dikeringkan dilarutkan kedalam buffer TE dan disimpan -20˚C.

2.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Plasmid merupakan materi genetic ekstra kromosom yang memiliki kemampuan

untuk melakukan replikasi secara otonom. Ukuran plasmid sangat bervariasi (1Kb –
200 Kb). Berbeda dengan DNA genom, DNA plasmid biasanya berbentuk sirkuler dan
terdapat bebas didalam sitoplasma bakteri. Pada satu sel bakteri dapat ditemukan lebih
dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi. Pada teknologi DNA
rekombinan, plasmid digunakan sebagai vector untuk menyisipkan DNA yang diklon,
sehingga perlu diperoleh plasmid yang tidak terkontaminasi dengan kromosom agar
diperoleh produk yang diinginkan.
Prinsip isolasi plasmid dari kromosom dan berbagai komponen sel lainnya
didasarkan pada ukuran dan sifat konformasi yang dimiliki. Plasmid memiliki ukuran
yang jauh lebih kecil dibandingkan kromosom (8% dari DNA kromosom) dan
kenyataan bahwa kromosom di sel terikat dengan membrane sel sehingga dengan
melisiskan sel dan sentrifugasi maka plasmid dapat dipisahkan dari DNA kromosom.
Selain itu plasmid dalam sel memiliki konformasi yang berbeda dengan kromosom
yaitu sirkular, covalently closed circular (ccc) dan linier dimana pada kondisi basa (pH
12 – 12,5), kromosom akan terfragmentasi dan terdenaturasi, sedangkan plasmid
terdenaturasi dan tidak terfragmentasi. Dengan penambahan kalium asetat dan asam
 asetat sampai netral, DNA kromosom akan membentuk agregat, berupa gumpalan kusut
bersama protein dan RNA. Sedangkan DNA plasmid kembali renaturasi menjadi untai
ganda yang terlarut. Dengan proses sentrifugasi, agregat dan partikel yang tidak larut
lainnya (protein dan RNA) akan mengendap membentuk pellet, sedangkan DNA
plasmid terlarut.
Secara umum isolasi plasmid dari bakteri dapat dibagi dalam 3 tahap yaitu :
1) Pembiakan bakteri
2) Pemanenan dan lisis sel bakteri
3) Pemurnian plasmid DNA.

Pembiakan bakteri dilakukan dengan mengambil 1 koloni bakteri dan ditanam

pada media padat selama 18 jam kemudian dilakukan subkultur kedalam media cair
hingga diperoleh bakteri yang cukup banyak untuk dipanen. Proses lisis dapat
dilakukan secara fisik, sel dipecah dengan kekuatan mekanik atau dengab metode
kimia, sel diperlakukan dengan penambahan senyawa kimia. Dengan metode kimia sel
bakteri dipecah pada suasana basa (pH 12 – 12,5) untuk mendapatkan plasmid yang
tidak terfragmentasi dan dapat larut kembali dengan penambahan asam (kalium asetat).
Pemurnian DNA dapat dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organic (campuran
fenol : kloroform dan isoamil alcohol) atau dengan metode kolom.

2.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

Keberadaan DNA plasmid hasil isolasi dapat dianalisis menggunakan

elektroforesis, sedangkan kadar DNA plasmid dengan menggunakan spektrofotometri.
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu zat berdasarkan
migrasinya di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi partikel bermuatan tersebut dapat
terjadi karena perbedaan ukuran, muatan, atau sifat kimia molekul. Penggunaan arus
listrik pada elektroforesis mengakibatkan terjadinya panas yang selanjutnya dapat
menyebabkan terjadinya difusi molekul yang akan dipisahkan. Difusi molekul yang
akan dipisahkan dapat dicegah dengan menggunakan matriks penyangga. Ada dua
macam matriks penyangga yang umum digunakan dalam elektroforsis yaitu pati
(agarose) dan poliakrilamid.

Agarosa merupakan polimer D galaktosa dan 2,4 anhidro L galaktosa yang

diisolasi dari ganggang laut. Gek agarose untuk elektroforesis dibuat dengan
melelehkan agarose konsentrasi tertentu dalam buffer dan didinginkan. Banyaknya
 agarose yang digunakan berbanding terbalik dengan ukuran DNA atau bentuk struktur
DNA (linier, sirkuler). Semakin pendek ukuran DNA nya maka konsentrasi gel
semakin tinggi. Struktur DNA sirkular lebih ringan disbanding DNA linier. Molekul
DNA (bermuatan negative) akan bergerak ke arah anoda saat diberi medan magnet pada
kedua ujung gel. Ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarose, dan besarnya
tegangan yang digunakan sangat menentukan kecepatan migrasi molekul DNA. DNA
dengan ukuran yang besar akan berjalan lebih lambat di dalam pori-pori gel agarose.

Keberadaan DNA dalam gel agarose dapat dideteksi menggunakan senyawa

berfluorosensi, misalnya etidium bromide, akridin oranye, propidium iodide, SYBR
Safe. Senyawa etidium bromide, akridin oranye, propidium iodide merupakan
karsinogen yang perlu penanganan hati – hati. Senyawa – senyawa tersebut mampu
berinterkalasi diantara untai DNA, saat diberi sinar UV 254 nm, DNA akan
mengabsorbsi sinar dan ditransmisikan pada senyawa pewarna DNA. Sedangkan
radiasi pada 302 dan 366 nm akan diserap oleh senyawa pewarna DNA. Pada kedua
keadaan ini, energy dipancarkan pada 590 nm pada daerah jingga merah.

3 ALAT DAN BAHAN

3.1 Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri
• Alat : sentrifuge, vortex, shaker, pemanas air, freezer, tabung reaksi, lampu
Bunsen, mikropipet, tip, tabung mikrosentrifus 1,5 ml, cawan petri,
Sengkelit, dan Erlenmeyer.
• Bahan : Bakteri E-Coli, media LB cair, buffer STE (10 mM Tris Cl Ph 8, 1 mM
EDTA, 100 mM NaCl), buffer lizosim (50 mM Tris HCl Ph 8, 10 mM
EDTA, 5mg/ml lizosim), Buffer lisis (SDS 2% 200 mM EDTA (dibuat
Baru)), PCl (fenol: kloroform : isoamilalkohol (25:24:1, etanol dingin,
Buffer TE, air suling steril.
3.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri
• Alat : Shacker incubator 37˚C, UV transilluminator, mikropipet, ose bulat,
Sentrifus, tabung mikrosentrifus 1,5ml, tip biru (1ml), tip kuning
(100µL), tip putih (10 µL)
• Bahan : Bakteri E-Coli PET 32b, Medium Luria Bertani, ampisillin, solution I
( 150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8), solution
II ( 0,2 N NaOH, 1% SDS (dibuat baru)), PCl (phenol/chlorophorm/
 Isoamilalkohol), buffer TE, Etanol p.a, Na Asetat.
3.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid
• Alat : neraca analitik, Erlenmeyer, microwave, mikropipet dan mikrotip,
tabung mikrosentrifus, cetakan gel, mesin elektroforesis, UV
transilluminator.
• Bahan : loading dye, ekstrak DNA, DNA ladder 1 Kb sebagai marker, agarose,
TBE 1x (tris boric EDTA), SYBR Safe.

1. PROSEDUR KERJA
1.1 Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri

Koloni bakteri E-Coli diambil dari media LB padat dibiarkan dalam 5 ml media LB cair
dan inkubasi selama 18 jam suhu 37˚C dalam incubator dengan kecepatan 150 rpm

Sebanyak 1 ml biakan bakteri dimasukkan dalam tabung mikrosentrifus 1,5ml dan

disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatant dibuang
dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 3 ml biakan bakteri yang disentrifugasi untuk
mendapatkan pellet sel bakteri.

Pelet sel yang diperoleh di suspense dengan 1 ml larutan STE dengan cara vortex.
Campuran di sentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm selama 5 menit

Supernatant dibuang dan pellet ditambah dengan 200 uL larutan lisozim dengan vortex
dan diinkubasi suhu 37˚C selama 1 jam
Campuran ditambahkan dengan 200 uL buffer lisis dan diresuspensi dengan di bolak -
balik

Campuran ditambah dengan PCl, diresuspensi dengan di bolak – balik (4-6 kali) dan
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

Fase air (bagian atas) diambil dengan pipet yang ujungnya lebar dan dimasukkan
kedalam tabung mikrosentrifus. Perkirakan vol fase airnya

Fase air kemudian ditambah dengan Cl (24:1) sama banyak dengan volume fase air.
Campuran diresuspensi dengan dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm
suhu 4˚C selama 10 menit

Fase air diambil dan ditambah dengan Na Asetat 0,1 volume air dan etanol absolut 2x
volum fase air.

Campuran di resuspensi dan diinkubasi suhu -20˚C selama 2 jam

Setelah inkubasi 2 jam, campuran di sentrifugasi kecepatan 10.000 rpm 4 C selama 10

menit.

Supernatant yang dihasilkan dibuang, dan ditambah kedalam tabung 500 uL etanol
70%, diresuspensi perlahan dan disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm, 4˚C
selama 10 menit

Supernatan dibuang, etanol dihilangkan dengan dikeringkan. DNA yang diperoleh di

larutkan kedalam 50 uL buffer TE
1.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri
a) Pembiakan dan pemanenan bakteri

Koloni E-Coli pET 30b diambil dari media LB Padat dibiakkan dalam 5ml, media LB cair
yang telah diberi kanamisin (konsentrasi akhir 25µg/ml) dan inkubasi selama 18 jam
suhu 37˚C dalam incubator goyang dengan kecepatan 150 rpm

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5ml dan
di sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatant dibuang
dengan membalikkan tabung dan diletakkan di atas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pellet sel bakteri

b) Isolasi plasmid

Pelet sel diresuspensi dengan 100 µl solution I dengan cara memipet naik turun
beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi (jika perlu dengan vorteks)

Solution II (fress solution/rp) ditambahkan sebanyak 200 µl, dihomogenkann dengan

cara membolak-balikkan tube secara perlahan selama 6-8 kali, kemudian didiamkan
selama 5 menit hingga lisat jernih JANGAN DI VORTEX

Solution II sebanyak 150 µl, dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tube

secara perlahan (6-8 kali). JANGAN DIVORTEX, simpan dalam es selama 5 menit

Campuran di sentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 4˚C. ulangi sentrifugasi jika
supernatant tidak jernih

Supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifus baru (hati-hati jangan sampai ada

endapan yang terikut)
 Tambahkan PCl sama banyak dengan volume supernatan, kemudian di vortex selama 3
menit dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit

Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan ditambahkan
etanol p.a dan 3M Na Asetat dengan perbandingan (2,5:0,1) dari volum supernatant.
Diamkan pada freezer (-20˚C) selama 1 jam untuk mempresipitasi plasmid

Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosentrifus disentrifugasi 12.000 rpm, 1 menit

suhu 4˚C

Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian disentrifus
kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4˚C

Pelet dikeringkan dan di resuspensi dalam 20 µl buffer TE dan disimpan pada suhu 4˚C
untuk anlisis selanjutnya

1.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

a) Elektroforesis agarosa

Agarose ditimbang 0,4 g dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan cara
pemanasan sampai semua agarose larut sehingga diperoleh gel agarose 1% kemudian
tambahkan 1 µl SYBR Safe. Larutan didiamkan hingga suhu ±60°𝐶

Cetakan/tray agarose disiapkan dengan menutup sisi berlubang cetakan dengan

selotip dan menempatkan sisir elektroforesis untuk membentuk sumur

Larutan agarose dituang kedalam cetakan dan dibiarkan hingga memadat

Setelah gel memadat, penutup cetakan dan sisir dilepaskan, kemudian cetakan
ditempatkan dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TBE 1x
 Sampel 5 µl hasil isolasi (DNA genom/DNA plasmid) yang telah tercampur dengan 2µl
loading buffer (6x) dimasukkan kedalam salah satu sumur dan 6 µl marka DNA 1 Kb ke
dalam sumur lainnya

Elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA selama 60 menit

Gel hasil elektroforesis diamati dibawah sinar UV

b) Penentuan Ukuran DNA

Dibuat garis regresi antara log BM DNA (x) dengan jarak migrasi (y)

Jarak migrasi DNA yang akan ditentukan diukur dan di interpolasikan kedalam garis
regresi yang telah dibuat sehingga dapat diketahui nilai log BM dari DNA tersebut

2. SOAL LATIHAN
2.1 Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri
1. Sebutkan metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA kromosom?
Jawab:
Pada praktikum kali ini, isolasi DNA kromosom dilakukan dengan menggunakan
metode cair (solution based method). Secara umum tahapan isolasi DNA meliputi :
a. pemecahan dinding sel
b. ekstraksi DNA
c. presipitasi dan purifikasi asam nukleat.

2. Apakah perbedaan DNA Kromosom dengan DNA plasmid?

Jawab :
• DNA kromosom, yaitu DNA yang terletak pada inti sel (eukariot) dan
sitoplasma (prokariot). Ukuran DNA kromosom lebih besar
• DNA plasmid, yaitu DNA yang terletak diluar kromosom atau disebut
ekstrakromosomal yang memiliki kemampuan replikasi secara otonom.
Ukuran DNA plasmid lebih kecil dari DNA kromosom.
 3. Bagaimana cara mengetahui keberhasilan isolasi DNA Kromosom?
Jawab:
• Keberhasilan isolasi dalam penelitian juga dapat dibuktikan dengan
pengujian secara kualitatif. Uji kualitatif dilakukan dengan melihat
keberadaan pita DNA pada gel agarose yang diwarnai terlebih dahulu dalam
rendaman EtBr.
• Dikatakan berhasil apabila bahan yang dipakai untuk isolasi DNA sudah
tepat dan sesuai dengan target DNA yang diinginkan.

2.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

1. Bagaimana cara mengisolasi DNA plasmid?
Jawab:
Secara umum, isolasi plasmid dari bakteri terdapat 3 tahap yaitu:
a) Pembiakan bakteri
Dilakukan dengan mengambil 1 koloni bakteri dan ditanam pada media padat
selama 18 jam kemudian dilakukan subkultur kedalam media cair hingga
diperoleh bakteri yang cukup banyak.
b) Pemanenan dan lisis sel bakteri
Proses lisis dapat dilakukan secara fisik, sel dipecah dengan kekuatan mekanik
atau dengan metode kimia, sel diperlakukan dengan penambahan senyawa
kimia. Dengan metode kimia sel bakteri dipecah pada suasana basa ( pH 12 –
12,5 ) untuk mendapatkan plasmid yang tidak terfragmentasi dan dapat larut
kembali dengan penambahan asam (kalium asetat).
c) Pemurnian DNA plasmid
Dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organic (campuran fenol :
kloroform dan isoamil alcohol) atau dengan metode kolom
2. Bagaimana cara memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom?
Jawab:
Dapat dilakukan dengan cara melisiskan sel dan sentrifugasi. Lisis sel bisa
dilakukan dengan cara mekanik yaitu dengan teknik sonikasi. Atau dengan cara
kimiawi yaitu denga senyawa kimia. Bisa juga dilakukan teknik sentrifugasi untuk
memisahkan DNA plasmid dari kromosom, yaitu dengan prinsip memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul.
 3. Sebutkan fungsi PCl?
Jawab:
a) Untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan
b) Berfungsi sebagai pemurnian DNA
c) Berfungsi sebagai pelarut organic
4. Sebutkan fungsi solution I,II, dan III
Jawab:
a) Solution I ( 150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)
Fungsi masing – masing bahan :
- Glukosa : sebagai penjaga tekanan osmotic hingga sel menghasilkan
DNA genom yang tidak diinginkan.
- Tris-Cl : menjaga agar pH larutan tetap 8,0
- EDTA : merupakan agen pengkhelat yang dapat mengikat ion Mg2+
dan Ca2+. Kedua ion tersebut dibutuhkan untuk menjaga rigi
ditas dinding sel dan kinerja dari DNAse yang merusak hasil
isolasi DNA plasmid
b) Solution II ( 0,2 N NaOH, 1% SDS (dibuat baru)
Fungsi masing-masing bahan :
- NaOH : merusak ikatan hydrogen dsDNA hingga molekul untai ganda
menjadi dua utas ssDNA
- SDS : melarutkan membrane sel bakteri hingga sel perlahan lisis dan.
SDS juga berfungsi untuk merusak protein dari penotor lain.
c) Solution III ( 60 ml 5M potassium asetat, 11,5 ml asam asetat glasial, 28,5 ml
akuades)
Fungsi masing – masing bahan :
- Potassium asetat : berfungsi sebagai penurun pH hingga ssDNA dapat
Kembali menjadi dsDNA.

2.3 Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

1. Apakah yang dimaksud dengan elektroforesis?
Jawab:
Elektroforesis adalah suatu cara untuk untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu zat
berdasarkan migrasinya dibawah pengaruh medan listrik.
2. Sebutkan matriks untuk pemisahan DNA menggunakan elektroforesis
Jawab :
Ada dua matriks penyangga yang digunakan dalam elektroforesis:
a) Pati (agarose)
b) Poliakrilamid
3. Bagaimana cara mengamati DNA plasmid menggunakan elektroforesis agarose?
Jawab:
Keberadaan DNA dalam gel agarose dapat dideteksi menggunakan senyawa
berfluorosensi, misalnya etidium bromide, akridin oranye, propidium iodide, dan
SYBR Safe.
3. HASIL PENGAMATAN

DATA HASIL ELEKTROFORESIS

1. Berikut hasil Elektroforesis Agarosa dari DNA plasmid yang diisolasi dari 4 koloni transforman
bakteri yang berbeda dan DNA Genom/kromosom yang diisolasi dari bakteri X. Berdasarkan
gambar tersebut apa yang bisa kalian simpulkan?

1. Plsmid dari transforman 1

2. Plasmid dar transforman 2
3. DNA Kromosom
4. Plasmid dari transforman 3
M : Marka DNA 1 Kb

Jawab:

Transforman 1 sampai 4 merupakan hasil isolasi DNA plasmid dari bakteri. Hasil
transforman yang diperoleh berbeda- beda. Pada transforman 1 sampai 4 menunjukkan
adanya DNA pada sampel karena transforman berfluorosensi. Pada data yang diperoleh
dari transforman memiliki pita ganda atau lebih dari satu. Hal ini menunjukkan
perpotongan oleh enzim restriksi lebih dari 1 macam transforman, sehingga dihasilkan
pita yang lebih dari satu.

Hasil elektroforesis didapatkan pita-pita DNA yang terpisah. Terpisahnya pita-pita

tersebut didasarkan oleh berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk
menunjukkan kandungan atau banyaknya DNA yang mempunyai berat molekul yang
sama pada pita yang sama. Berdasarkan data yang diperoleh, disimpulkan bahwa
 transforman no 3 memiliki pita yang berkumpul (tidak menyebar) sehingga memiliki
konsentrasi paling tinggi dan ekstraksi DNA total yang dilakukan dalam kondisi utuh.
Urutan transforman dari yang paling baik berdasarkan tebal pita adalah 3>1>4>2.
Ikatan antar molekul yang terputus dapat disebabkan oleh adanya gerakan. Hal ini
sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat
bergerak bebas dibawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran
yang sama akan terakumulasi pada pita yang berdekatan.

2. Berikut Elektroforegram plasmid yang direstriksi dengan enzim restriksi tertentu.

Tentukan ukuran dari pita a, b dan c dalam pb (pasangan basa)

M Marka DNA 1 Kb

1. Plasmid utuh
2. Plasmid diporong dengan enzim
restriksi MluI
3. Plasmid dipotong dg enzim retriksi
NdeI dan XhoI
4. Plasmid dipotong dengan enzim
XhoI

Jawab:

Jarak Migrasi
Ukuran Marka Protein Marka Jarak Migrasi
Sampel
(y)

Dalton Log Bp (x)

Pita 1 : 10000 bp 4 1,5 cm Pita A : 2,2 cm

Pita 2 : 8000 bp 3,9 1,65 cm Pita B : 3,45 cm

Pita 3 : 6000 bp 3,778 1,9 cm Pita C : 1,7 cm

 Pita 4 : 5000 bp 3,699 2 cm

Pita 5 : 4000 bp 3,602 2,2 cm

Pita 6 : 3000 bp 3,477 2,45 cm

Pita 7 : 2600 bp 3,415 2,65 cm

Pita 8 : 2000 bp 3,301 3 cm

Pita 9 : 1600 bp 3,204 3,45 cm

Pita 10 : 1000 bp 3 4,1 cm

Pita 11 : 750 bp 2,875 4,6 cm

Persamaan Regresi Y = bx + a

a = 12,2389 ; b= -2,7482 ; r = - 0,9845

y= -2,7482 + 12,2389

A = 2,2 cm y = -2,7482 + 12,2389

2,2 = -2,7482 + 12,2389

X = 3,6529

Jadi ukuran pita a = antilog x = 4496,76 bp

B = 3,45 cm y =-2,7482 + 12,2389

3,45 = -2,7482 + 12,2389

X = 3,1980

Jadi, ukuran pita b = antilog x = 1577,61 bp

C = 1,7 cm y = -2,7482 + 12,2389

1,7 = -2,7482 + 12,2389

X = 3,8348

Jadi ukuran pita C , antilog x = 6835,97 bp

4. PEMBAHASAN
4.1 Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri
Tujuan dari praktikum kali ini adalah dapat memahami dan mampu
melakukanisolasi DNA bakteri. DNA bakteri yang diisolasi adalah DNA dari bakteri
Escherichia coli. Escherichia – coli adalah bakteri yang mempunyai bentuk seperti basil
(batang) pendek, koloninya tersusun seperti rantai memanjang dan latarnya berwarna
agak kebiruan akibat pengaruh dari zat warna biru metilen. Escherichia- coli mampu
memberikan reaksi pada zat warna biru metilen, karena Escherichia- coli bersifat asam
sedangkan metilen blue merupakan zat warna basa. E.coli merupakan bakteri gram
negatif. Bakteri gram negatif digunakan karena struktur dinding sel bakteri gram negatif
lebih tipis dibandingkan bakteri gram positif sehingga akan lebih mudah dipecahkan.
DNA kromosom yang diisolasi adalah DNA kromosom dari bakteri Eschericia coli.
Kromosom E-coli merupakan 1 untai ganda sirkular dengan ukuransekitar 4.600kb.

DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis serta
membawa informasi genetic dari sel makhluk hidup dari satu generasi ke generasi
berikutnya. Genom adalah satu set kromosom lengkap yang diwariskan sebagai
satukesatuan dari suatu tetua. Genom merupakan komplemen lengkap gen-gen suatu
organisme atau materi genetic suatu organisme dan terorganisir menjadi kromosom
(Chambel,2002). Genom meliputi bagian-bagian fungsional dan non fungsional
dalamsel organisme. Kromosom merupakan bagian dari sel dimana mempunyai
struktur berupa deret panjang molekul yang terdiri dari satu molekul DNA dan berbagai
protein terkait yang merupakan informasi genetic suatu organisme.

DNA pada sel prokariot maupun eukariot dapat diperoleh dengan cara
mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Isolasi DNA adalah memisahkan DNA
dari kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Fungsi dari isolasi
DNA adalah untuk mendapatkan DNA murni dari sel yang akan digunakan untuk
penganalisisan genotip suatu organisme. Sel prokariot memiliki bahan genetic
tambahan yang disebut DNA plasmid. Pada umumnya plasmid tidak diperlukan oleh
sel. Bentuk DNA dari sel prokariot berbentuk sirkuler serta tidak berasosiasi kuat
dengan protein histon. Sel eukariot mempunyai DNA yang dapat ditemukan dalam
kromosom, yaitu di inti sel, mitokondria serta kloroplas.
 Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding
dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5) Presipitasi.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.
Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

Pada praktikum kali ini, dibuat biakan bakteri terlebih dahulu 1 hari sebelum
praktikum, dikarenakan bakteri harus di inkubasi dalam incubator untuk mengetahui
adanya koloni bakteri. Setelah bakteri dibiakkan dalam incubator suhu 37˚C selama 18
jam, diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifus 1,5ml.
kemudian di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Diperoleh
supernatant atau larutan bening dibuang dengan cara membalikkan tabung dan
diletakkan di atas kertas tisu dengan posisi terbalik. Lagkah – langkah tersebut diulangi
2 kali hingga 3 ml untuk mendapatkan pelet sel bakteri.

Setelah pelet bakteri diperoleh, diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan

cara di vortex. Selanjutnya campuran di sentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm
selama 5 menit. Supernatant yang dihasilkan dibuang dan pelet sel ditambah dengan
200 uL larutan lizosim dengan vortex dan diinkubasi suhu 37˚C selama 1 jam. Lisozim
ditambahkan guna untuk perusakan atau pembuangan dinding sel yang telah dilisiskan
oleh larutan. Kemudian campuran ditambahkan dengan buffer lisis dan diresuspensi
dengan dibolak-balik (4-6 kali). Buffer lisis digunakan bertujuan untuk mencuci DNA
dari debris sel dan menstabilkan pH sehingga struktur DNA terjaga. Campuran di
ekstraksi dengan cara ditambahkan PCl, dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000
rpm.

Fase air diambil dengan menggunakan pipet yang ujungnya lebar dan
dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga, kemudian ditambah dengan Cl dengan
perbandingan (24:1) sama banyak dengan volume fase air. Diresuspensi kembali dan
di sentrifugasi. Fase air ditambahkan dengan Na Asetat 0,1 volume fase air.
Diresuspensi kembali dan diinkubasi dengan suhu rendah -20˚C selama 2 jam. Hal ini
bertujuan untuk menghindari kerusakan DNA, karena DNA yang disimpan dalam
 waktu yang cukup lama dapat menyebabkan kerusakan DNA. Setelah diinkubasi,
campuran disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm selama 4 menit. Supernatan yang
dihasilkan ditambah dengan 500 uL etanol 70% dan di sentrifugasi kembali. Langkah
terahir adalah supernatant dibuang, etanol dihilangkan dengan cara dikeringkan. DNA
yang diperoleh dilarutkan kedalam 50 uL buffer TE.

Aplikasi dari isolasi DNA adalah untuk identifikasi forensik, beberapa gen
tertentu dapat diproduksi secara massal untuk mengobati penyakit tertentu, dan
teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk rekayasa genetika. Isolasi DNA
juga berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat mengetahui kelainan genetik
yang diderita.

4.2 Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Teknik untuk isolasi DNA plasmid dari bakteri umumnya hampir sama seperti isolasi
DNA kromosom. Menggunakan teknik sentrifugasi dan presipitasi. Contoh dari teknik
sentrifugasi pada praktikum kali ini adalah sebanyak 1,5 ml biakan bakteri disentrifugasi
selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Setelah disentrifuge didapatkan pelet (hasil dari
pemisahan berat molekul oleh gaya sentrifugal) disuspensikan kembali dan timbahkan EDTA
yang berfungsi sebagai pengkelat dalam menjaga stabilitas membran plasma serta menghambat
DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Penambahan glukosa 150 mM juga
diperlukan untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses
pelisisan (Suharsono,2006).
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom.
Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan
prosedur isolasi DNA kromosom. Setelah proses kultur bakteri di sentrifuge 14000-16000 rpm
yang kemudian dibuang supernatannya.
• Kondisi analisis pada percobaan kali ini adalah sebagai berikut :
- Analit : DNA plasmid dari bakteri E-Coli PET 32b
- Kons. Analit : 25 µg/mL.
- Suhu inkubasi : 37˚C
- Kec. Sentrifugasi : 12.000 rpm
- Suhu sentrifugasi : 4˚C
- Pelarut : Etanol 70%
• Fungsi penambahan setiap bahan terhadap DNA adalah sebagai berikut :
a) Solution I ( 150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)
- Glukosa
Sebagai penjaga tekanan osmotic hingga sel menghasilkan DNA genom
yang tidak diinginkan.
- Tris-Cl
Menjaga agar pH larutan tetap 8,0
- EDTA
Merupakan agen pengkhelat yang dapat mengikat ion Mg2 dan Ca2+. Kedua
ion tersebut dibutuhkan untuk menjaga rigiditas dinding sel dan kinerja dari
DNAse yang merusak hasil isolasi DNA plasmid.

b) Solution II ( 0,2 N NaOH, 1% SDS (dibuat baru)

Fungsi masing-masing bahan :
- NaOH
Merusak ikatan hydrogen dsDNA hingga molekul untai ganda menjadi dua
utas ssDNA
- SDS
Melarutkan membrane sel bakteri hingga sel perlahan lisis dan. SDS juga
berfungsi untuk merusak protein dari penotor lain.
c) Solution III ( 60 ml 5M potassium asetat, 11,5 ml asam asetat glasial, 28,5 ml
akuades)
Fungsi masing – masing bahan :
- Potassium asetat
Berfungsi sebagai penurun pH hingga ssDNA dapat kembali menjadi
dsDNA.
d) PCl berfungsi sebagai :
- Untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan
- Berfungsi sebagai pemurnian DNA
e) Etanol p.a
Berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang
ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang
mengendap.
 f) Na Asetat
Berfungsi membuat konsentrasi garam tinggi dan single strans RNA tidak bisa
larut dalam keadaan tersebut.

Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-
benang halus yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan
DNA yang berbentuk kromatin. Presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta
campurannya dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Hasil yang diperoleh
adalah pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatan yang mengandung larutan
Na asetat dan ethanol absolut. Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah
bagian pelet dan yang dibuang adalah bagian supernatan. Hasil yang diperoleh
disimpan untuk analisis selanjutnya.

4.3 Analisis DNA kromosom dan Plasmid

4.3.1 Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja
dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif
(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),
sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju
kutub negatif (anode) (Gaffar, 2007).
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan
fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah
pasangan basanya. Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat
dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh
faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas
muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut,
maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel
mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel
tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut. Perangkat elektroforesis yang
digunakan dalam elektroforesis meliputi sumber arus listrik searah (DC), ruang
untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan
 buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel
(Suhartono, 1999).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan
bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis
juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi
masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika,
kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam
bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang
dikandung suatu sekuen DNA tertentu. Perangkat elektroforesis yang
digunakan dalam elektroforesis meliputi sumber arus listrik searah (DC), ruang
untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan
buffer, matriks elektroforesis, marker dan gel (Suhartono, 1999).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.
Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat
medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan
atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan
kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak
melalui matriks tersebut (Muladno, 2010).
4.3.2 Gel Yang Digunakan
Gel yang biasa digunakan adalah agarosa. Gel agarosa adalah suatu
polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang merah, atau
poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran
yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan
ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Agarosa merupakan
polimer D galaktosa dan 2,4 anhidro L galaktosa yang diisolasi dari ganggang
laut. Gel agarose untuk elektroforesis dibuat dengan melelehkan agarose
konsentrasi tertentu dalam buffer dan didinginkan.
4.3.3 Faktor – Factor Yang Mempengaruhi Migrasi Sampel
Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya
(Muladno, 2010):
1) Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi
molekul berukuran kecil.
 2) Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat
daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi
tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat
gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis.
3) Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan
bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.
4) Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang
digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan, mobilitas
molekul DNA meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan
molekul DNA di dalam gel menurun dengan meningkatnya voltase yang
digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi
molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt
per cm.
5) Keberadaan etidium bromida di dalam gel mengakibatkan pengurangan
tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15%.
6) Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan
sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat.
4.3.4 Interpretasi Hasil Praktikum
o Hasil elektroforesis menunjukkan adanya garis pita yang panjang dan garis
pita yang pendek. Semakin panjang jarak garis pita yang terbentuk pada gel
agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom tersebut semakin
pendek. Sedangkan, semakin pendek jarak garis pita yang terbentuk pada
gel agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom semakin
panjang.
o Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan
semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa
pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks
tersebut.
o Dari hasil percobaan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi sampel
maka pita yang terbentuk akan semakin tebal. RF yang didapatkan
merupakan retention factor, yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti
pemisahan protein pada gel. Prinsipnya yaitu penghambatan terhadap laju
migrasi dari protein‐protein tersebut sehingga pemisahan karena perbedaan
berat molekul mengakibatkan terbentuknya pita‐pita pada jarak migrasi
 yang berbeda satu sama lain dan jarak tersebut dikonversi menjadi nilai RF.
Dari marker I-Vmenunjukkan bahwa semakin besar nilai RF maka akan
berbanding terbalik dengan berat molekul yang semakin kecil.
4.3.5 Kondisi BM Yang Diperoleh
Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker
pada gel akan terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker.
Hal ini menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama.
Molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama
sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006). Pita-pita bisa terbentuk atau
nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut
pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang
bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan
terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan
panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004).

4.3.6 Titik Kritis

Hal – hal yang harus diperhatikan pada praktikum kali ini adalah :
1. Praktikkan harus lebih berhati-hati dalam melakukan isolasi DNA dan
mempersiapkan sampel agar hasil yang didapat baik.
2. Pada saat melakukan elektroforesis, diperlukan ketepatan pengukuran dan
ketelitian praktikkan, serta waktu yang dipakai dalam menjalankan
elektroforesis harus ±4 𝑗𝑎𝑚 agar marker dan sampel yang dihasilkan baik.
5. KESIMPULAN & SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
isolasiDNA bakteri Escherichia coli memiliki prinsip utama yaitu sentrifugasi dan
presipitasi. Isolasi DNA memiliki 3 tahap yaitu pengahancuran atau lisis sel, tahap
ekstraksi dan tahap pencucian. Hasil yang diperoleh berupa larutan bening. DNA pada
bakteri Escherichia coli berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi kuat dengan protein
histon. Isolasi DNA bertujuan untuk mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang
dapat digunakan unutk penganalisisan genotif suatu organisme.

Berdasarkan data yang diperoleh urutan transforman dari yang paling baik
berdasarkan tebal pita adalah 3>1>4>2. Ikatan antar molekul yang terputus dapat
disebabkan oleh adanya gerakan. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul
bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas dibawah pengaruh medan
listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada pita yang
berdekatan.

5.2 Saran
Adapun saran yang dapat diberikan berdasarkan praktikum yang telah dilakukan
yaitu sebaiknya untuk isolasi DNA plasmid dan kromoson selanjutnya dapat dilakukan
dengan perlakuan waktu inkubasi selama 48 jam untuk mendapatkan hasil yang
optimal.
 DAFTAR PUSTAKA

• Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga. Jakarta

• Jusuf. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi gen. Sagung Seto. Jakarta
• Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kasinius. Yogyakarta.
• Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. IPB.
• Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta
• Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta
• Wolfe, S. L. 1993. Molecular and cellular biology. Wodsworth Publishing Company.
Belmont