Vet Res Commun (2010) 34:381–386

DOI 10.1007/s11259-010-9356-7

KOMUNIKASI SINGKAT

Mycobiota dan Ochratoxin A dalam pakan tikus

laboratorium: studi pendahuluan

Inês Almeida & H. Marina Martins & Marta F. Marques &

Salomé Magalhães & Fernando Bernardo

Diterima: 23 Maret 2010 / Diterbitkan online: 27 April 2010

# Springer Science+Business Media BV 2010

Abstrak Terjadinya jamur penghasil mikotoksin dalam pakan ternak merupakan

bahaya bagi hewan. Ketika zat yang tidak diinginkan ini mencemari pakan ternak
laboratorium, sampaikan masalah tambahan pada tingkat kepercayaan pengujian
hewan percobaan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi
kontaminasi jamur dan untuk menentukan kejadian alami Ochratoxin A (OTA)
pada 31 sampel. OTA adalah mikotoksin yang diproduksi oleh jamur dari dua
genera: Penicillium dan Aspergillus. OTA telah terbukti menjadi nefrotoksik,
hepatotoksik, teratogenik dan imunotoksik untuk sejumlah spesies hewan dan
menyebabkan tumor ginjal dan hati pada tikus dan tikus. Dalam studi pendahuluan
ini, jumlah cetakan pakan berkisar antara 3 hingga 4,2 log10 cfu/g (unit pembentuk
koloni per gram). Ketika spesies ini hadir, ada risiko kontaminasi yang signifikan
dengan mikotoksin yang mengakibatkan penyakit akut yang disebut
mikotoksikosis dan kondisi kronis, yang sering dikenal sebagai situasi yang
melibatkan mikotoksin. Genus yang paling sering diisolasi adalah Cladosporium
sp. (84%), diikuti oleh Aspergillus niger dan Penicillium (81%) dan Mucor sp.
(77%). Semua sampel pakan tikus diperiksa OTA, menggunakan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). Batas deteksi adalah 2,0 g OTA
kg-1 dan semua sampel dinyatakan negatif untuk mikotoksin ini. Penelitian
mikotoksikologi ini membuktikan pentingnya penggunaan pakan hewan percobaan
bebas kontaminan untuk mencegah gangguan pada kesehatan hewan percobaan
dan menekankan perlunya kontrol sistematis pakan sebagai masalah utama
dalam percobaan hewan.

. A. . .
Kata kunci Mycobiota Ochratoxin Mikotoksin pakan tikus HPLC

I. Almeida
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Lusófona de Humanidades e
Tecnologia, Campo Grande 376, 1749-024 Lisboa, Portugal

HM Martins (*) : MF Marques: S. Magalhães

INRB, IP, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Serviço de Micologia, Estrada de
Benfica 701, 1549-011 Lisboa, Portugal
e-mail: marina.martins@lniv.min-agricultura.pt

F. Bernardo
CIISA- Faculdade de Medicina Veterinária, Pólo Universitário da Ajuda, Rua Professor Cid
dos Santos, 1300-147 Lisboa, Portugal
e-mail: fbernardo@dgv.min-agricultura.pt
382 Vet Res Commun (2010) 34:381–386Pendahuluan

Eksperimen umum, hewan seperti tikus, tikus dan marmot sangat penting untuk
pengujian in vivo. Standarisasi, kondisi fisik, kesehatan dan kesejahteraan
hewan-hewan ini sangat penting untuk keakuratan hasil yang diperoleh dengan
hewan-hewan ini (Krogh 1987). Pengaruh latar belakang makanan mempengaruhi
kinerja, metabolisme, dan perilaku hewan yang digunakan untuk pengujian
eksperimental. Mikotoksin mencakup berbagai keluarga yang bervariasi secara
struktural dari metabolit yang dielaborasi secara alami, banyak di antaranya telah
terlibat dalam wabah penyakit pada manusia dan hewan (Gentles et al. 1999).
Menurut Roige et al. (2009) Deteksi jamur tidak selalu memerlukan keberadaan
mikotoksin, karena produksi mikotoksin tergantung pada berbagai faktor seperti
keberadaan jamur toksigenik, komposisi kimia substrat, kadar air, kelembaban
relatif, suhu dan waktu pertumbuhan jamur. . Namun, tingkat insiden yang tinggi
dari kontaminasi mikotoksin pada biji sereal dan pakan ternak telah dilaporkan di
seluruh dunia (Keller et al. 2007). Efek negatif mikotoksin pada pertumbuhan dan
kesehatan ternak menjadikannya masalah utama bagi banyak sistem produksi.
Ochratoxin A (OTA) adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang
dari genera Aspergillus dan Penicillium genera (Petzinger dan Ziegler 2000;
Vettorazzi et al. 2009). Ciri-ciri yang mengkhawatirkan dari mikotoksin jenis ini
adalah keberadaannya dalam makanan dan pakan yang menimbulkan tingkat
kerusakan pada kesehatan dan produktivitas manusia dan hewan (Krogh 1987).
Ini adalah kontaminan alami jagung, kacang tanah, biji-bijian penyimpanan, biji
kapas, dan vegetasi yang membusuk. Itu juga telah terdeteksi dalam sereal jamur
seperti gandum, rye, barley, oat, dan telah diekstraksi dari kacang tanah, biji kopi,
roti, tepung, beras, kacang polong dan kacang-kacangan (Manderville dan
Pfohl-Leszkowicz 2008). Variabilitas dalam produksi OTA, dikombinasikan dengan
ukuran partikel besar dari beberapa pakan yang terkontaminasi, memperumit
strategi pengambilan sampel untuk mendeteksi OTA (Campbell et al. 2003; Costa
et al. 2009)
OTA memiliki efek akumulatif pada jaringan hewan; konsentrasi tertinggi
ditemukan di ginjal, hati dan otot rangka (Krogh 1987). Ketika tertelan sebagai
kontaminan makanan, OTA sangat persisten dalam organisme manusia, dengan
waktu paruh darah 35 hari. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa OTA
mungkin terlibat dalam Nefopati Endemik Balkan dan telah dikaitkan dengan
peningkatan insiden tumor saluran kemih pada manusia (Vettorazzi et al. 2009).
OTA diklasifikasikan sebagai kemungkinan karsinogen pada manusia dan hewan
(kelompok 2B). Seringkali tidak jelas sejauh mana penelitian pada hewan dapat
diterapkan pada toksisitas pada manusia. Interpretasi studi epidemiologi seringkali
sulit karena faktor lain yang tidak dapat dikendalikan, termasuk kemunculan
bersama dengan mikotoksin lain yang mungkin memiliki efek sinergis (Henry et al.
1999; Martins et al. 2008). OTA seperti yang dilaporkan bersifat nefrotoksik,
imunosupresif, karsinogenik dan teratogenik dalam penelitian pada hewan, karena
eliminasi yang lambat dan tingkat biotransformasi yang sangat rendah, yang
mengarah ke tingkat darah dan jaringan yang tinggi dari toksin ini (Mally et al.
2007; Zepnik et al. 2003).
Studi menggunakan hewan laboratorium (tikus) saat menjadi bagian dari salah
satu arah penelitian nasional saat ini, juga memiliki prioritas internasional, dengan
kontribusinya untuk pemahaman yang lebih baik tentang beberapa mekanisme
dasar kehidupan pada tingkat molekuler dan karakterisasi proses biologis tertentu
yang muncul. pada mikotoksikosis (Badea et al. 2009).

Bahan dan metode

Prosedur pengambilan sampel

Tiga puluh satu sampel pelet (1 kg) pakan tikus laboratorium, ditandai di Portugal,
dikarakterisasi secara mikologi. Semua sampel ditempatkan secara aseptik dalam
kantong steril dan
Vet Res Commun (2010) 34:381-386 383

diangkut ke laboratorium dan disimpan pada suhu kamar dan diuji dalam waktu 24
jam setelah pengambilan sampel (2002/26/EC).
Bahan-bahan yang dideklarasikan dari pakan tikus pelet adalah: gandum
(50,0%), kedelai (13,8%), barley (13,0%), jagung (MGO—organisme yang
dimodifikasi secara genetik), biji bunga matahari dan lemak; komposisi gizi adalah:
protein total (15,4%), selulosa (4,1%), cinder (5,9%) dan aditif: vitamin: A, D3, E
(alfa tokoferol), tembaga dan tembaga sulfat.
Sepuluh gram masing-masing sampel dihomogenkan selama 3 menit dalam 90
ml air triptone (101 suspensi) (Oxoid, kode CM 87, Basingstoke, Inggris) dalam
Colworth 400 Stomacher (Seward Medical, London, UK). Pengenceran sepuluh
kali lipat disiapkan sampai10-6.

Jumlah koloni jamur dan identifikasi pada genus kapang

Dari setiap pengenceran, 1 ml ditebarkan ke dalam empat cawan (0,25 ml per

cawan) Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) (ref: BD-Difco
258710) (0,25 ml per cawan). Pelat diinkubasi pada suhu 25 ° C, dalam posisi
tegak selama 5 hari. Setiap koloni kapang yang diisolasi diamati secara
mikroskopis untuk karakter morfologi dan diidentifikasi sampai tingkat genus
(Raper dan Fennell 1965; Domsch et al. 1980; Samson dan Pitt 1989).

Deteksi dan kuantifikasi OTA menggunakan HPLC

Penentuan OTA dilakukan menurut metode yang dijelaskan oleh Stroka et al.
(Stroka dan Anklam 1999). Ekstraksi dilakukan dari 25 g sampel dengan
asetonitril. Ekstrak dibersihkan menggunakan kolom imunoafinitas (Ochratest,
Vicam) dan dielusi dengan metanol; air: asam asetat dan dipisahkan dengan
HPLC fase terbalik dan diukur dengan deteksi fluoresensi dengan LiChrospher
100 RP-18 (kolom 5 m 25× 4,6 mm id), EcoPack (Merck, Portugal). Panjang
gelombang eksitasi dan emisi masing-masing adalah 360 nm dan 420 nm.
Penelitian pemulihan dilakukan dengan menggunakan tingkat spiking 2 × 10-3,4.0
× 10-3 dan 1,0 × 10-2 mg kg-1.Batas deteksi metode ini adalah 2,0 g kg-1.
Bahan Kimia

Semua reagen dan pelarut dengan kemurnian tingkat analitik disediakan oleh

VWR (Jerman). Solusi

standar Standar OTA diperoleh dari Sigma (Ref.O-1877).

Hasil dan diskusi

Semua sampel mengungkapkan kontaminasi dengan jamur berserabut. Genus

yang paling sering diisolasi adalah Cladosporium sp. (84%), diikuti oleh
Aspergillus niger dan Penicillium (81%) dan Mucor sp. (77%) (Tabel 1).
Ragi juga hadir di semua sampel positif. Tingkat kontaminasi berkisar antara 3
sampai 4,2 log10 cfu/g. (Tabel 1).
384 Vet Res Commun (2010) 34:

381-386)%

4
t

7
s

(a)
 e
l

T)
0

0
(n

o
1
itu
g
n
o
im
l
a
g
(n t

o
o n
l
o
itu
c n
n
ig u
i

Ff
m o

a y
t
c
n
n
o
e
c
u
ig
q
n

e
u
f r

F=
fo
º n
y
1
e
c
3 lp
n

1
 1
d
%4
s a 8(

e lC
62

s
)
u
Y.
v %4
1.
p 7
s ( 3
0
lf 5.
1
y 32 0
a.
9.

m sebuah 1

o
r
lli
c e

e 3.
g )
1
di
5.
s %1
2
8( 7.
u
3
P. 5
ll
i 6.
p 2
0
s g

e
i
p
di
7.
s s
1

b 5.
A
0
* 8.
A. 32
2
p
+
s
7.
N
s 2. 2

u )
3

p
%5 e

o 6(
g
z 02 0
a
ih 1
r 5.
0 4.
) e
3
R.
v
%(
p 1
A
s 4. 5.
6(
1
0
a 0
91 2

h ) dS
1.
P.
%2
5 7. 4
p
( 1
7.
s
3
61
3.
m
0

u ) 1.

ir 2

a le
%
s v
2
e
u
4 4. l
( 1
1. le
6. h v
2
31 0
F. e
g
l
p iH
4.
s
w
2
r )
o
o 3.
% 1 L
c
8
u e
5.
5
5. lp
( 0 2
m

81 a
M. s

p
) 0.
e
s 1
6.
%7 v
1
7 itu
m
( 3. adalah
0 o
u

il 4 p
li 5.
2
c 2 fo
i
r
0.
n 1. e
1
2
e
b

) m
5.
P. 0 u
%1 8.
p 8( n
1
s
5
*
2
m 0 :
1
u d
6.
ir 5.
2 n
o 0
e
p
g
s
4. e
)
o
2
0 L
m

Vet Res Commun (2010) 34:381–386 385

Tabel 2 Hasil eksperimen untuk sp iking tingkat, pemulihan dan batas deteksi (DL) metode
diterapkan tingkat spiking (mg kg-1)batas Recovery (%) Detection (ug kg-1)

2,0 × 10-3 108,4

4.0 × 10-3 94,9 2,0 1,0 × 102 84.5

Target utama dari penelitian ini adalah untuk menentukan OTA A dalam pakan
yang digunakan untuk mencit laboratorium. Tingkat lonjakan, pemulihan dan batas
deteksi mikotoksin target ditunjukkan pada Tabel 2. Hasilnya menunjukkan bahwa
pemulihan OTA berada dalam batas yang dapat diterima (70 hingga 110%).
Penelitian tentang kejadian alami OTA (HPLC) mengungkapkan bahwa 31 sampel
yang diuji negatif (Tabel 3).

Kesimpulan Pakan

hewan yang digunakan dalam penelitian laboratorium harus memberikan nutrisi

yang andal dan tepat. Studi nutrisi pada hewan laboratorium telah lama
menunjukkan bahwa berbagai komponen makanan secara substansial dapat
mempengaruhi metabolisme mereka. Untuk membantu dalam kontrol
eksperimental, produsen pakan harus memastikan bahwa semua batch pakan
harus disetujui untuk profil nutrisi. Oleh karena itu, pentingnya penentuan
mikobiota harus ditekankan, karena studi ini dapat memberikan informasi tentang
mikotoksin mana yang berpotensi ada dalam sampel. Rata-rata asupan OTA
harian diperkirakan 0,7-4,6 ng/kg berat badan, berdasarkan diet khas Eropa dan
tingkat khas OTA dalam berbagai makanan dan pakan, dengan lebih dari
setengah OTA berasal dari sereal (Bayman dan Baker 2006).
Evaluasi OTA dibenarkan untuk memperluas tujuan tindakan pengendalian.
Pemantauan mikotoksin dianggap sebagai prasyarat menurut (576/2006/EC).
Dengan cara ini naskah ini akan berkontribusi untuk menekankan perlunya kontrol
stok pakan yang tepat.
Dalam penelitian ini, meskipun mikotoksin belum terdeteksi, pembusukan jamur
harus dipertimbangkan sebagai penyebab utama perhatian ketika pakan
digunakan untuk hewan percobaan, mengingat mikroorganisme ini dapat
menghabiskan nutrisi pakan ketika mereka berkembang dalam bahan ini.
Hilangnya beberapa nutrisi mikro atau esensial dapat bertindak sebagai faktor
yang dapat mengganggu hasil percobaan yang diperoleh dengan hewan
percobaan. Kontrol mikotoksin pakan untuk hewan percobaan adalah alat penting
untuk memastikan ketepatan uji in vivo.

Tabel 3 Frekuensi OTA dalam pakan tikus

Matriks Sampel positif OTA/n* % Sampel negatif** OTA/n* % Pakan 0/31 0 31/31 100 Legenda: *

n- total sampel; ** Sampel negatif- batas deteksi 2 g kg1

386 Vet Res Commun (2010) 34:381–386Referensi

Badea, M.; Taus, N.; Potrovita, M. dan Moarcas, M., 2009, Studi Toksikologi mikotoksin
Menggunakan metode enzimatik dan histokimia, Pencemaran Tanah Air Udara: Fokus,
9:261-269.
Bayman, P dan Baker, JL, 2006, Ochratoxins: Sebuah prespektif global, Mycophatology,
162.215-223. Campbell, BC, Molyneux, RJ dan Schatzki, TF, 2003, Penelitian terkini tentang
pengurangan kontaminasi aflatoksin sebelum dan sesudah panen dari AS: kacang pohon.,
J.Toxicol Toxin Rev, 22, 225-266.
Costa, JM, Almeida, I., Martins, HM, Magalhães, S., Guerra, M. dan Bernardo, F., 2009, Controlo
de ocratoksina A em alimentos komposos para monogástricos, Buku lanjutan 9º Encontro
Química dos Alimentos, Angra do Heroísmo Açores Portugal, 149.
Arahan 2002/26/EC Parlemen Eropa dan Dewan 13 Maret 2001, Menetapkan metode
pengambilan sampel dan metode analisis untuk kontrol resmi kadar okratoksin A dalam
bahan makanan, Resmi Jurnal Komunitas Eropa, hal 75/43.
Arahan 2006/576/EC Parlemen Eropa dan Dewan 13 Maret 2006, Kehadiran deoxynivalenol,
zearalenone, ochratoxin A, T-2 dan HT-2 dan fumonisin dalam produk yang ditujukan untuk
makanan hewan, Jurnal Resmi Komunitas Eropa , hal 229/9.
Domsch, KH, Gams W. dan Anderson TH, 1980 Ringkasan Jamur Tanah.. Academic Press, New
York. Hal-1156
Gentles, A., Smith, E. E,; Kubena, LF, Duffus, E., Johnson, P., Thompson, J., Harvey, RB &
Edrington, TS, 1999, Evaluasi toksikologi asam siklopiazonat dan okratoksin a pada ayam
pedaging. Ilmu Unggas, 78 (10), 1380–1384.
Henry, S:H:, Bosh, FX, Troxell, TC dan Bolger, PM, 1999 Mengurangi kanker hati-kontrol global
aflatoksin. Sains, 286, 2453–2454.
Keller KM, Queiroz BD, Keller LAM, Ribeiro JMM, Cavaglieri LR, González Pereyra ML, Dalcero
AM dan Rosa CAR, 2007, “Mycobiota and Toxicity of Equine Feeds”, Komunikasi Penelitian
Veteriner, 31:1037–1045.
Krogh, P. Ochratoxins dalam makanan. Krogh, P.ed.; Pers Akademik: London, 1987; hal 1–96.
Mally, A, Hard, GC dan Dekant, W., 2007, Ochratoxin A sebagai faktor etiologi potensial dalam
nefropati endemik: Pelajaran dari studi toksisitas pada tikus. Makanan Chem Toxicol, 45,
2254-2260. Manderville, RA dan Pfohl-Leszkowicz, A., 2008, Bioaktivasi dan adduksi DNA
sebagai alasan untuk karsinogenesis okratoksin A, World Mycotoxins Journal, 1(3):357–367.
Martins HM, Almeida I., Marque M. dan Bernardo F., 2008, Interaksi Strain Liar Aspergilla dengan
Aspergillus parasiticus ATCC15517 pada Produksi Aflatoksin. Int. J. Mol. Sci., 9, 394–400.
Petzinger, E. dan Ziegler, K., 2000, Ochratoxin A dari perspektif toksikologi. Jurnal Farmakologi
dan Terapi Hewan, 23 (2), 91-98.
Pemerkosa KB, dan Fennell DI, 1965, Genus Aspergillus. Williams dan Wilkens (Eds). Baltimore.,
hal-704. Roige MB, Aranguren SM, Riccio MB, Pereyra S., Soraci AL dan Tapia MO 2009,
“Mycobiota and mycotoxins in fermented feed, wheat grain and corn grain in Southeastern
Buenos Aires Province, Argentina”, Rev IberoamMicol.26(4): 233–237.
Samson RA dan Pitt JI, 1989 : Sistematika Penicillium dan Aspergillus—Dulu, Sekarang dan
Masa Depan 3-71. Dalam Konsep Modern dalam Klasifikasi Penicillium dan Aspergillus Ed.
oleh Robert A. Samson dan John I. Pitt. Pers Pleno New York. Diterbitkan bekerja sama
dengan Divisi Urusan Ilmiah NATO.
Stroka, J. dan Anklam, E., 1999 Validasi metode analisis untuk menentukan kandungan
aflatoksin, okratoksin dan patulin dalam bahan makanan asal nabati EUR 18640 EN European
Commission, p 136. Vettorazzi, A., Gonzalez-Penas, E. , Troconiz, IF, Arbilaga, L., Corcuera, LA,
Gil, AG & de Cerain, AL, 2009, Profil kinetik yang berbeda dari ochratoxin A pada tikus jantan
dewasa. Makanan Chem Toxicol, 47 (8),1921-7.
Zepnik, H, Volkel, W. dan Dekant, W., 2003, Toxicokinetics dari mikotoksin ochratoxin A pada
tikus F344 setelah pemberian oral. Toxicol.dan menerapkan Phermacol., 192:36–44.