Introducción: las enzimas so proteínas que tienen como función catalizar todas las

reacciones químicas que ocurren dentro de un organismos vivos, los procesos a evaluar serán la
determinación de concentración de proteínas, Purificación de una enzima, actividad enzimática y
actividad específica, las cuales revelara el funcionamiento y comportamiento frente a factores
externos.

Extracción de α-
Tubo Albumina de bovino agua Reactivo
amilasas: Tras la
Bradford
obtención de semillas de
cebas ya pesadas,
1 0 µL 2000µL (2mL) 500µL
prosigue la
2 50 µL 1950µL 500µL homogeneización del
(1,95mL) tejido con mortero y 1,0
mL de buffer, trasladar a
3 100 µL 1900µL 500µL tubo sppendorf y
(1,9mL) centrifugar por 5 min. El
sobrenadante se
4 150 µL 1850µL 500µL trasvasija a otro tubo de
(1,85mL) la misma naturaleza y se
calienta a 55°C por 5 min.
5 200 µL 1800µL (1,8 500µL , se centrifuga
mL) nuevamente y tras
trasvasijar se deja en
hielo para ser utilizado
mas adelante, obteniendo el almidón.

Determinación de concentración de proteínas.: El método utilizado para determinar

la concentración de proteínas fue el método de Bradford. Para esto es necesario obtener la curva
de calibración midiendo la absorbencia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas
( 0, 2, 4, 6 y 8 µg) de una proteína de albumina de bovino, las cuales se amplificaron por 2,5
para luego determinar la cantidad de rectivo de Bradford y agua como se muestra en la
siguiente tabla:

Tubo µg/mL de albumina de Absorbencia a

bovino 595nm

1 0 0

2 2 0,088
Una vez preparados los tubos,
3 4 0,178 se lee la absorbancia de cada
uno de ellos a la longitud de
4 6 0,278 onda de 595 nm. La
absorbancia obtenida en el
5 8 0,423 tubo blanco debe ser restada
a cada uno de los tubos
restantes, (tubo blanco
absorbancia igual a cero) obteniendo los siguientes valores:
Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que
contienen, es posible realizar una curva de calibración de proteína (gráfico A595 vs µ g/mL).

En este gráfico se aprecia una curva notablemente creciente, lo cual demuestra que a mayor
cantidad de proteína , mayor color desarrollado y por lo tanto mayor absorbancia. Pero
estaproporcionalidad es sólo lineal hasta un cierto límite de concentración

Para La determinación de La concentracion de proteínas de muestras conocidas se utiliza

La siguiente ecuación:

mg proteinaml=AA595nm p× FdXml× 11000 → 0,680,049×10,02×11000 =

0,69 mgmL

La concentración expresada por gramo de peso es:

mg proteinagpf=AA595nm p× FdXml× 11000×volúmen

totalgpf→0,69mgmL×0,490,312≅1,57 mggpf
Medición de La actividad enzimática.

Temperatura B1 B2 M1 M2 Afina
(°C) l
0° 0.62 0.630 1.690 1.691 1.061
8 5

20° 0.61 0.618 1.256 1.466 0,748

7

50° 0.61 0.622 0.899 --------- 0.228

9 5 µg de almidon
70° 0.61 0.619 1.240 1.309 0.655 =minx mL(A620
9 5 nm inicial-PA620
nm final). × 1X
90° 0.61 0.617 1.266 1.322 0.677 min×1X mL.
7
Donde A620 nm
inicial= 1,720-
promedio de blancos. → 1,720 – 0.6206= 1,0994
µg de almidonminx mL µg de almidonminx gpf Por lo tanto µg
de almidon
0° 121,28 190,4096
=minx mL .
20° 1124,48 1765,4336 (1,0994-
0,00125A620
50° 2786,88 4375,4016 nm final).×15
70° 1420,48 2230,1536
min×1 0,05mL

90° 1351,68 2122,1376

µg de almidon
=min×gpf(A620 nm inicial-PA620 nm final). × 1X min×1X mL×volumen
 totalgpf→(A620 nm inicial-PA620 nm final). × 15min×10.05 mL×0,490,312 .

Variación de la actividad enzimática en función de la

temperatura

En este gráfico da a conocer trás los datos entregados em las tablas anteriores, la actividad
enzimática, donde a la temperatura de 50 grados Celsius, la enzima alcanza su máxima
actividad denominada “temperatura optima”.

Actividad especifica

actividad enzimatica a t° optimaconcentración de proteina = 2786,88µg de

almidonminx mL0,69mgmL= 4038,956 µg de almidonminx mg

Discusión : la Cuantificación de proteínas ocupando técnicas espectroscópicas como el método Bradford

son de mucha utilidad tanto para demostraciones teóricas como para comparación con otros estudios o
variaciones de condiciones. Se se demuestra que a mayor proteína mayor absorvancia gracias a gráficos y
cálculos .La actividad enzimática es muy sensible a condiciones experimentales de temperatura.