Laporan Mikrobiologi Pewarnaan http://itatrie.blogspot.

com/2012/10/laporan-mikrobiologi-
pewarnaan.html

BAB I
PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi
dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya
muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
 Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang
khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
            Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat
pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme
disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan
gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan
bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam
(Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri
bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat
warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk
sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat
reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat
diketahui (Hadiutomo. 1990).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri
gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak
bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
(Waluyo, 2004).
 Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang
digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka
zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).

            Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan
positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan
positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
            Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun
biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang
bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur
sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif,
perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah
bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan
positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan
positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar
belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan
mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan
melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga
dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari
 bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat
dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
Fiksasi digunakan untuk :
1.      Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2.      Melekatkan bakteri pada glass objek
3.      Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan
zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau
malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri
dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat
juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8
(saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan
tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark
yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak
sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif
dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan
gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap
penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994)

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur
24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi
dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)

Ciri-ciri gram negative:

        Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
        Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam laktat.
        Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
        Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:

        Struktur dindingnya tebal

        Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
        Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
        Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
        Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
        Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Banyak senyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan
gram untuk :

        Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

        Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
        Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1. Tabel hasil pengamatan pewarnaan
No Teknik Pewarnaan Pengamatan
.
1. Pewarnaan Sederhana Keterangan :
         Perbesaran 400
         Berwarna Ungu
         Berbentuk basil
2. Pewarnaan Negatif Keterangan :
         Perbesaran 400
         Berwarna Kuning
         Berbentuk coccus
3. Pewarnaan Gram Keterangan :
         Perbesaran 400
         Berwarna Merah
         Berbentuk basil
         Gram negatif
4. Pewarnaan Spora Keterangan :
         Perbesaran 400
         Berwarna Merah
         Berbentuk coccus

4.2 Pembahasan
               Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan
susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain
kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin(lay ,1994).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai,
dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif
merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak
meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar  belakangi sehingga kelihatan atau nampak
sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994).
            Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal
violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif
akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini
disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan
dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).
            Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan
safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna
merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis (Lay.1994).
            Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri
dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk
melihat morfologi bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar
belakangnya (Lay.1994)
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ;
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite
green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan
warna merah pada sel vegetatifnya (Lay.1994)
Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam
prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria
karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol
fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan
sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat
anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal
(Sutedjo,1991).
Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan
campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna
untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan
negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap
latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa
seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau
alkohol             tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif
dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai
dengan  metode biasa.
Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk
desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium,
pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel
darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk
deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada
juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan
biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan
safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan
sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk
mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya
(Lay,1994).
 Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan
bentuk basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak
ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan
negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada
pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk
basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora yang
menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil
pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk
coccus pada perbesaran 400 di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang
berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi
sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian
terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut
terbawa air
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :
        Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
        Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif
berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi
pada dinding selnya
        Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan
differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
        Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol
fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.
5.2 Saran
            Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti pewarnaan kapsul, basil
tahan asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam metode
pewarnaan lebih banyak mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press