RESUME II

REPLIKASI DNA & REPLIKASI DNA PADA PLASMID BAKTERI (Rolling

Cirrcle Replication)

Dosen Pengampu :Ummi Nur Afinni Dwi.J, M.Pd

Tugas ini Disusun untuk Mengikuti Perkuliahan Genetika

Kelompok 7 :

Sri Yanti Tarihoran (0310192055)

Salwa Sabila (0310192054)

Tadris Biologi II

Semester V

PROGRAM STUDI TADRIS BIOLOGI

FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUMATERA UTARA

MEDAN

2021
I.Replikasi DNA

Replikasi DNA merupakan bagian penggandaan rantai ganda DNA.

Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota sambung-
menyambung melaksanakan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya
replikasi DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S siklus sel, sebelum mitosis
atau meiosis I. Penggandaan tersebut menggunakan enzim DNA polimerase
yang menolong pembentukan ikatan selang nukleotida-nukleotida penyusun
polimer DNA. Bagian replikasi DNA dapat pula diterapkan in vitro dalam
bagian yang dikata reaksi berantai polimerase (PCR).

Replikasi DNA kromosom prokariota, khususnya bakteri, sangat

berkaitan dengan siklus pertumbuhannya. Daerah ori pada E. coli, misalnya,
berisi empat buah tempat pengikatan protein inisiator DnaA, yang masing-
masing panjangnya 9 pb. Sintesis protein DnaA ini sejalan dengan laju
pertumbuhan bakteri sehingga inisiasi replikasi juga sejalan dengan laju
pertumbuhan bakteri. Pada laju pertumbuhan sel yang sangat tinggi; DNA
kromosom prokariota dapat mengalami reinisiasi replikasi pada dua ori yang
baru terbentuk sebelum putaran replikasi yang pertama berakhir. Akibatnya,
sel-sel hasil pembelahan akan menerima kromosom yang sebagian telah
bereplikasi.

Protein DnaA membentuk struktur kompleks yang terdiri atas 30

hingga 40 buah molekul, yang masing-masing akan terikat pada molekul
ATP. Daerah ori akan mengelilingi kompleks DnaA-ATP tersebut. Proses ini
memerlukan kondisi superkoiling negatif DNA (pilinan kedua untai DNA
berbalik arah sehingga terbuka). Superkoiling negatif akan menyebabkan
pembukaan tiga sekuens repetitif sepanjang 13 pb yang kaya dengan AT
sehingga memungkinkan terjadinya pengikatan protein DnaB, yang
merupakan enzim helikase, yaitu enzim yang akan menggunakan energi ATP
hasil hidrolisis untuk bergerak di sepanjang kedua untai DNA dan
memisahkannya.

Untai DNA tunggal hasil pemisahan oleh helikase selanjutnya

diselubungi oleh protein pengikat untai tunggal atau single-stranded binding
protein (Ssb) untuk melindungi DNA untai tunggal dari kerusakan fisik dan
mencegah renaturasi. Enzim DNA primase kemudian akan menempel pada
DNA dan menyintesis RNA primer yang pendek untuk memulai atau
menginisiasi sintesis pada untai pengarah. Agar replikasi dapat terus berjalan
menjauhi ori, diperlukan enzim helikase selain DnaB. Hal ini karena
pembukaan heliks akan diikuti oleh pembentukan putaran baru berupa
superkoiling positif. Superkoiling negatif yang terjadi secara alami ternyata
tidak cukup untuk mengimbanginya sehingga diperlukan enzim lain, yaitu
topoisomerase tipe II yang disebut dengan DNA girase. Enzim DNA girase ini
merupakan target serangan antibiotik sehingga pemberian antibiotik dapat
mencegah berlanjutnya replikasi DNA bakteri.

Seperti telah dijelaskan di atas, replikasi DNA terjadi baik pada untai
pengarah maupun pada untai tertinggal. Pada untai tertinggal suatu kompleks
yang disebut primosom akan menyintesis sejumlah RNA primer dengan
interval 1.000 hingga 2.000 basa. Primosom terdiri atas helikase DnaB dan
DNA primase.

Primer baik pada untai pengarah maupun pada untai tertinggal akan
mengalami elongasi dengan bantuan holoenzim DNA polimerase III.
Kompleks multisubunit ini merupakan dimer, separuh akan bekerja pada untai
pengarah dan separuh lainnya bekerja pada untai tertinggal. Dengan demikian,
sintesis pada kedua untai akan berjalan dengan kecepatan yang sama.

Masing-masing bagian dimer pada kedua untai tersebut terdiri atas

subunit a, yang mempunyai fungsi polimerase sesungguhnya, dan subunit e,
yang mempunyai fungsi penyuntingan berupa eksonuklease 3’– 5’. Selain itu,
terdapat subunit b yang menempelkan polimerase pada DNA.

Begitu primer pada untai tertinggal dielongasi oleh DNA polimerase

III, mereka akan segera dibuang dan celah yang ditimbulkan oleh hilangnya
primer tersebut diisi oleh DNA polimerase I, yang mempunyai aktivitas
polimerase 5’ – 3’, eksonuklease 5’ – 3’, dan eksonuklease penyuntingan 3’ –
5’. Eksonuklease 5’ - 3’ membuang primer, sedangkan polimerase akan
mengisi celah yang ditimbulkan. Akhirnya, fragmen-fragmen Okazaki akan
dipersatukan oleh enzim DNA ligase.[11] Secara in vivo, dimer holoenzim
DNA polimerase III dan primosom diyakini membentuk kompleks berukuran
besar yang disebut dengan replisom. Dengan adanya replisom sintesis DNA
akan berlangsung dengan kecepatan 900 pb tiap detik.
 Kedua garpu replikasi akan bertemu kira-kira pada posisi 180 °C dari
ori. Di sekitar daerah ini terdapat sejumlah terminator yang akan
menghentikan gerakan garpu replikasi. Terminator tersebut antara lain berupa
produk gen tus, suatu inhibitor bagi helikase DnaB. Ketika replikasi selesai,
kedua lingkaran hasil replikasi masih menyatu. Pemisahan dilakukan oleh
enzim topoisomerase IV. Masing-masing lingkaran hasil replikasi kemudian
disegregasikan ke dalam kedua sel hasil pembelahan.

Beberapa DNA helikase dan Ssb yang disebut dengan protein replikasi
A atau replication protein A (RP-A) diperlukan untuk memisahkan kedua
untai DNA. Selanjutnya, tiga DNA polimerase yang berbeda terlibat dalam
elongasi. Untai pengarah dan masing-masing fragmen untai tertinggal
diinisiasi oleh RNA primer dengan bantuan aktivitas primase yang merupakan
bagian integral enzim DNA polimerase a. Enzim ini akan meneruskan
elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan oleh DNA polimerase d
pada untai pengarah dan DNA polimerase e pada untai tertinggal. Baik DNA
polimerase d maupun e mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA
polimerase d untuk menyintesis DNA yang panjang disebabkan oleh adanya
antigen perbanyakan nuklear sel atau proliferating cell nuclear antigen
(PCNA), yang fungsinya setara dengan subunit b holoenzim DNA polimerase
III pada E. coli. Selain terjadi penggandaan DNA, kandungan histon di dalam
sel juga mengalami penggandaan selama fases.

Mesin replikasi yang terdiri atas semua enzim dan DNA yang
berkaitan dengan garpu replikasi akan diimobilisasi di dalam matriks nuklear.
Mesin-mesin tersebut dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop dengan
melabeli DNA yang sedang bereplikasi. Pelabelan dilakukan menggunakan
analog timidin, yaitu bromodeoksiuridin (BUdR), dan visualisasi DNA yang
dilabeli tersebut dilakukan dengan imunofloresensi menggunakan antibodi
yang mengenali BUdR.
II.Replikasi DNA Pada Plasmid Bakteri

Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal, yaitu Pada dasarnya sel

mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang dijumpai di
nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang terdapat dalam sel di luar
nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya
disebut DNA ekstrakromosomal. yang dapat bereplikasi secara autonom dan
bisa ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari
satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid
tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel
tersebut.Umumnya, plasmid menyandi gen-gen yang diperlukan agar dapat
bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan
kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang

Plasmid adalah DNA berserat ganda yang berbentuk lingkaran dan mempunyai
kemampuan untuk bereplikasi sendiri tanpa tergantung dari replikasi kromosom.
Gen yang dibawa oleh plasmid tidak mutlak diperlukan bagi kelangsungan hidup
bakteri, sehingga biasanya bakteri dapat hidup tanpa plasmid. Plasmid merupakan
molekul DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi (memperbanyak diri)
secara mandiri dan ditemukan dalam sel prokariot dan eukariot. Secara alami
plasmid terdapat pada bakteri dan beberapa organisme eukariot seperti
Saccharomyces ceriviseae. Ukuran plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb.
Dalam penelitian rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan
molekuler untuk memasukkan gen dari luar ke dalam sel inang (Palomares et al.
2004; Yadav et al. 2011). Plasmid mempunyai 3 komponen penting yaitu: 1)
Origin of replication (ORI), sehingga plasmid dapat bereplikasi secara mandiri, 2)
mempunyai daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang
biasa disebut multiple cloning site (MCS), 3) membawa penanda seleksi
(biasanya resistensi terhadap antibiotika) untuk membedakan antara sel inang
yang mengandung plasmid atau tidak.

Klasifikasi plasmid berdasarkan karakteristik gen yang dikodenya. Terdapat 5

jenis plasmid, yaitu: 1) plasmid fertilitas atau F, membawa gen tra sehingga
plasmid dapat berpindah secara konyugasi, contoh plasmid F pada E. coli, 2)
plasmid resisten atau R, membawa gen resistensi terhadap antibiotika, contoh:
resistensi terhadap kloramfenikol, ampisilin, dan zeocin, 3) Plasmid Col
mempunyai gen pengkode protein kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri
lain, contoh ColE1 pada E. coli, 4) plasmid degradatif memungkinkan sel inang
memetabolisme senyawa yang tidak umum (toluene dan asam salisilat), contoh:
Tol pada Pseudomonas putida, 5) plasmid virulensi, memungkinkan sel inang
dapat menginfeksi organisme lain. Contoh plasmid Ti pada Agrobacterium
tumefaciens sehingga dapat menginfeksi tanaman dikotiledon. Plasmid pICZ A
merupakan salah satu jenis plasmid resisten yang mempunyai gen pengkode
resisten terhadap zeocin.

Plasmid yang pertama kali dikonstruksi adalah plasmid pBR322 (pada tahun
1974) dan merupakan salah satu plasmid yang pertama kali digunakan dalam
rekayasa genetika. Sistem penamaan plasmid menggunakan huruf dan angka.
Sebagai contoh pBR322, p berarti pasmid, BR merupakan nama orang yang
pertama kali mengkonstruksi plasmid (Bolivar dan

Rodriquez), dan 322 merupakan nomor identitas spesifik dari plasmid. Pada
penelitian ini digunakan plasmid pICZ A sebagai model untuk optimasi isolasi
plasmid dengan metode lisis alkali. Plasmid pICZ A berukuran 3329 bp
mempunyai pUC sebagai ORI yang berasal dari Escherichia coli (E. coli)
sehingga dapat bereplikasi di sel E. coli, mempunyai daerah MCS dengan 10 situs
enzim restriksi, dan membawa penanda seleksi resitensi terhadap antibiotika
zeocin (gen Sh ble). Perbedaan antara plasmid pICZ A, pICZ B, dan pICZ C
adalah pada salah satu dari 10 situs enzim restriksi, untuk pICZ A terdapat Apa I,
pICZ B Xba I, sedangkan pICZ C Snab I. Kelebihan plasmid pICZ A selain dapat
bereplikasi dalam E. coli juga dapat terintegrasi ke dalam genom Pichia pastoris.

Sejak ditemukan plasmid, telah banyak metode dikembangkan untuk mengisolasi

plasmid. Metode isolasi plasmid yang tepat sangat penting untuk mendapatkan
plasmid dengan konsentrasi dan kemurnian yang tinggi. Keberhasilan Polymerase
Chain Reaction (PCR), penentuan urutan DNA (sequencing), dan kloning gen
sangat ditentukan oleh konsentrasi dan kemurnian plasmid. Beberapa metode
isolasi plasmid antara lain: lisis alkali, lisis dengan pemanasan, menggunakan
bahan kimia sesium klorida, metode dengan menggunakan microwave dan
metode kromatograpi. Metode isolasi plasmid yang biasa dipakai adalah lisis
alkali dan lisis dengan pemanasan;

Kelemahan metode lisis dengan pemanasan adalah beberapa E. coli seperti

HB101t Plasmid pICZ A (Easyselect Pichia Expression Kit 2015) selnya tidak
dapat dilisis dengan pemanasan. Metode lain untuk isolasi plasmid dengan
menggunakan sesium klorida, yang sangat mahal, korosif, toksik, dan
memerlukan waktu yang sangat lama, sehingga metode ini jarang digunakan
Banyak kit untuk isolasi plasmid beredar di pasaran. Kit ini menggunakan kolom
kromatografi sekali pakai untuk mengabsorpsi plasmid. Matriks yang digunakan
beragam, antara lain gelas, resin anion (dietilaminoetil, dietil-2-hidroksipropil-
aminoetil). Isolasi plasmid menggunakan kit relatif lebih mudah tetapi mahal jika
dilakukan secara rutin

Dari metode-metode isolasi di atas, metode lisis alkali merupakan metode isolasi
plasmid yang banyak digunakan karena simpel, relatif murah, dan
reprodusibilitas. Biasanya plasmid diisolasi dari hasil kultivasi E. coli dalam
media LB cair yang mengandung antibiotika tetapi E. coli dalam LB padat dapat
juga digunakan untuk isolasi plasmid. Penggunaan E. coli dalam LB padat lebih
 menghemat waktu karena tidak memerlukan tahap sentrifugasi untuk
mendapatkan sel E. coli dari media cair

III.PERTANYAAN & JAWABAN

1) Resistensi terhadap antibiotik begitu mencemaskan, hingga banyak disebut

sebagai "akhir dari pengobatan modern." BBC Future berbincang dengan para
ahli tentang bagaimana kita dapat menghindari dampak terburuk dari antibiotik
yang menjadi tantangan besar di masa kini itu. Bagaimana resistensi antibiotik
dapat terjadi?

Jawaban : Sebuah kombinasi dari peresepan obat yang berlebihan dan sebuah budaya
ketergantungan terhadap antibiotik telah membuat kita menjadi seperti saat ini.
Bakteri dapat menjadi resisten terhadap anibiotik dikarenakan bakteri tersebut
memiliki gen-gen pengkode enzim yang secara spesifik menghancurkan beberapa
antibiotik tertentu. Pada bakteri E.Coli, gen-gen ini dibawa oleh plasmid R. Apabila
antibiotik yang seharusnya dapat membunuh bakteri diberikan dengan tidak benar
atau tidak sesuai aturan, maka bakteri dapat bermutasi menjadi tidak sensitif terhadap
antibiotik tertentu dan tidak mati. Mutasi tersebut dapat terjadi pada gen yang
membawa sifat resisten di dalam plasmid. Kebanyakan dari plasmid R merupakan
plasmid konjugatif sehingga dapat berpindah dari sel bakteri satu ke sel bakteri
lainnya sehingga bisa jadi bakteri E-Coli yang awalnya tidak memiliki plasmid R
tidak resisten melakukan konjugasi dengan bakteri patogen lainnya yang memiliki
plasmid R yang resisten terhadap antibiotik tertentu, sehingga plasmid R tersebut di
transfer ke sel bakteri E-Coli dan akibatnya bakteri E-Coli tersebut menjadi resisten
terhadap antibiotik.

2) Replikasi DNA bersifat semi-koservatif, artinya satu molekul DNA untai

ganda bereplikasi untuk menghasilkan dua molekul DNA baru yang identik.
Masing-masing molekul DNA baru itu terdiri dari satu rantai DNA lama dan
satu rantai DNA baru. Pada replikasi DNA, mula-mula kedua untai DNA
 terpisah, kemudian masing-masing untai berfungsi sebagai templat untuk
sintesis untai DNA yang baru, sehingga proses replikasi menghasilkan dua
molekul DNA baru, masing-masing memiliki satu rantai lama dan satu rantai
baru. Jelaskan mengapa hal tersebut dapat terjadi ?

Jawaban : Di dalam rantai DNA, titik awal dimulainya replikasi DNA disebut sebagai
ori (‘origin of replication”). Pada bakteri Escherichia coli, replikasi dimulai dari
oriC, suatu urutan DNA spesifik yang terikat pada membran sel bakteri. Replikasi
DNA berlangsung ke dua arah. Helikase merupakan enzim yang memisahkan kedua
untai DNA pada proses replikasi DNA in vitro. Dalam molekul DNA rantai
panjang, replikasi terjadi pada potongan-potongan rantai pendek dan kedua rantai
DNA induk

terpisah hanya pada titik awal replikasi membentuk molekul seperti huruf Y yang
biasa disebut ’fork’ replikasi.

Rantai DNA baru tumbuh dalam arah 5’→3’ dengan penambahan molekul
deoksiribonukleotida pada gugus 3’-OH. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim DNA
polimerase. Karena kedua rantai DNA adalah antiparalel, rantai yang berperan
sebagai templat dibaca dari ujung 3’ kearah 5’. Jika sintesis selalu berlangsung
dengan arah

5’→3’ bagaimana kedua rantai bisa disintesis secara serentak? Jika kedua rantai
disintesis secara kontinu selama fork replikasi bergerak, salah satu rantai akan
mengalami sintesis dengan arah 3’→5’. Masalah ini dijelaskan oleh Reiji Okazaki
pada tahun 1960. Okazaki menemukan bahwa satu rantai DNA baru disintesis dalam
bentuk potongan-potongan pendek yang disebut ”fragmen Okazaki”. Jadi satu rantai
DNA baru disintesis secara kontinu, dan rantai lain secara diskontinu. Rantai yang
disintesis secara kontinu atau ’leading strand’ adalah rantai yang sintesis
5’→3’nya berlangsung dengan arah yang sama dengan pergerakan fork replikasi,
sedang rantai diskontinu atau
’lagging strand’ adalah rantai yang sintesis 5’→3’-nya berlangsung berlawanan
dengan arah pergerakan fork replikasi (Gambar 4.3). Panjang fragmen Okazaki
berkisar antara ratusan sampai ribuan nukleotida, tergantung pada tipe sel. Fragmen
Okazaki kemudian disambungkan oleh enzim DNA ligase.

IV.DAFTAR RUJUKAN

Dr. Elya Nusantari.2015. GENETIKA Belajar Genetika dengan Mudah &

Komprehensif (Dilengkapi Data Hasil Riset tentang Kesulitan Memahami Konsep
Genetika dan Riset dalam Pembelajaran Genetika).Yogyakarta : DEEPUBLISH

(Inggris)Geoffrey M. Cooper (2000). "The Cell - A Molecular Approach". Boston

University (ed. 2) (Sunderland (MA): Sinauer Associates). hlm. Heredity, Genes, and
DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses 2010-08-13.

(Inggris)Geoffrey M. Cooper (2000). "The Cell - A Molecular Approach". Boston

University (ed. 2) (Sunderland (MA): Sinauer Associates). hlm. Figure 3.8.
Semiconservative replication of DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses 2010-08-13.

(Inggris) Geoffrey M. Cooper (2000). The Cell - A Molecular Approach. Boston

University (edisi ke-2). Sunderland (MA): Sinauer Associates. hlm. Heredity, Genes,
and DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses tanggal 2010-08-13.

(Inggris) Geoffrey M. Cooper (2000). The Cell - A Molecular Approach. Boston

University (edisi ke-2). Sunderland (MA): Sinauer Associates. hlm. Figure 3.8.
Semiconservative replication of DNA. ISBN 0-87893-106-6. Diakses tanggal 2010-
08-13. "Polymerase Chain Reaction (PCR)". www.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses tanggal
2020-11-30.

http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2009/06/diktat_biotekmol.pdf