EFEK TOKSIN BOTULINUM TIPE A DALAM DILUSI YANG BERBEDA

TERHADAP KONTRAKSI FIBROBLAS – STUDI IN VITRO

1. Pendahuluan

Toksin botulinum tipe A telah banyak digunakan untuk mengatasi

berbagai indikasi nonkosmetik, seperti distonia serviks, blefarospasme,

strabismus, hiperhidrosis, dan1 kelainan kelenjar ekrin, seperti

hidrosistoma ekrin multipel,2 fenomena Raynaud,3 dan leiomioma kutan.4

Namun, BoNT‐A dikenal luas oleh masyarakat awam karena efeknya

dalam bidang kedokteran estetika, karena kemampuannya untuk

merelaksasikan otot wajah dan meningkatkan elastisitas, kelenturan, serta

viskoelastisitas kulit, dan untuk mengatur kembali serat kolagen wajah.5

Untuk indikasi pada kulit, BoNT‐A dapat digunakan untuk mengubah

tekstur kulit dan mengatur produksi sebum di tempat injeksi 6,7 untuk

mengatasi akne kistik yang berat,8 dan mengurangi produksi sebum dan

mengecilkan ukuran pori pada pasien dengan kulit berminyak.9

Beberapa penelitian telah menunjukkan efek biologis dari BoNT-A

pada tipe sel nonneuronal10 seperti sel dan jaringan kulit yang

mengekspresikan setidaknya satu protein pengikat BoNT‐A, yaitu protein

vesikuler SV2 atau FGFR3.11 Beberapa sel kulit juga dapat

mengekspresikan BoNT‐A cleavage target, SNAP-25, seperti keratinosit

epidermal dan sel induk mesenkim pada jaringan adiposa subkutan.12

BoNT‐A mengubah jaringan ikat dermal dan efeknya pada kulit terlihat

pada cutaneous flap, yang akan menghasilkan respons biologis yang

spesifik pada fibroblas dermal. Respons ini berupa ekspresi sitokin dan

faktor pertumbuhan seperti vascular endothelial growth factor, platelet

endothelial cell adhesion molecule 1, CD31, CD34, interleukin (IL) -1,

dan tumor necrosis factor-a.13-15 Pada fibroblas dermal, BoNT-A dapat

secara langsung memfasilitasi perbaikan jaringan, penutupan luka, dan

pembentukan jaringan parut. BoNT‐A akan menginduksi hilangnya bentuk

normal dari fibroblas serta retraksi dan penyebaran sitoplasma pada

percobaan dengan fibroblas 3T3 yang dikultur.16 Hal tersebut akan

menyebabkan berkurangnya protein terkait penuaan pada fibroblas kulit

manusia yang terpapar radiasi ultraviolet B dan menginduksi penuaan dini

pada studi antiphotoaging. Fibroblas ini memiliki matriks

metaloproteinase (MMP)‐I dan MMP‐3 yang lebih sedikit tetapi memiliki

lebih banyak kolagen tipe I (Col‐I) dan III (Col-III). 17 Pada percobaan

penyembuhan luka pada fibroblas yang dikultur, BoNT‐A mencegah

ekspresi Col‐I dan Col‐III, tetapi meningkatkan ekspresi MMP-2 dan

MMP-9,18 walaupun observasi ini membutuhkan klarifikasi lebih jauh

karena studi lain telah menunjukkan efek yang berkebalikan, dimana

BoNT‐A meningkatkan ekspresi Col‐I, tetapi menurunkan ekspresi

MMP.19 BoNT tidak, menstimulasi proliferasi fibroblas dermal atau

menyebabkan efek inflamasi.

 BoNT‐A juga menghambat fosforilasi Smad2 saat pembentukan

kapsul pada implan silikon, dan juga menghambat persinyalan TGF-1

untuk menghambat diferensiasi fibroblas menjadi miofibroblas.20 Pada

percobaan dengan tikus yang terluka, pengobatan menggunakan BoNT-A

menunjukkan berkurangnya kontraksi luka dan graft, dan penyembuhan

luka yang lebih baik dan lebih cepat, serta pembentukan jaringan parut

luka bakar yang tidak terlalu parah, dengan regenerasi yang lebih cepat,

peradangan yang lebih sedikit, dan fibroblas yang lebih banyak. 21,22

Penelitian pada hewan menunjukkan berkurangnya ketebalan jaringan

parut hipertropi23 yang disebabkan oleh pertumbuhan dan diferensiasi

fibroblas yang dimodifikasi BoNT-A. Pada fibroblas manusia, BoNT‐A

akan meningkatkan ekspresi Rac1, Cdc42, dan RhoA 24; yang akan

menghambat proliferasi fibroblas dan diferensiasi fibroblast menjadi

miofibroblas25; juga menstimulasi apoptosis, tetapi menurunkan ekspresi

miosin. BoNT-A juga meningkatkan regulasi Col‐I tetapi menurunkan

ekspresi TGF‐b1, VEGF, MMP‐1, dan PDGFA dan gen lainnya yang

terlibat dalam proliferasi invasif fibroblas pada keloid.26-28 Pada tingkat

klinis, sedikit peningkatan prokolagen tipe I diamati setelah penggunaan

abobotulinumtoxin (ABO).29

Pada perawatan kosmetik pada garis wajah hiperfungsional yang

disebabkan oleh hiperaktivitas otot, BoNT-A biasanya diberikan melalui

injeksi intramuskular.30 Namun, laporan mengenai BoNT-A intradermal

yang menginduksi efek pengangkatan kulit, seperti pengangkatan bagian

tengah wajah (midface), telah banyak muncul31 bahkan dengan

penggunaan berbagai bentuk toksin (ABO dan onabotulinumtoksin

(ONA)).32 Suntikan BoNT‐A intradermal untuk peremajaan kulit wajah

dapat memperbaiki tarikan ke bawah pada otot depressor midfasial, 29

platysmal, dan otot orbicularis oculi lateral. Menariknya, intervensi

dengan toksin pada otot platysmal dan otot orbicularis oculi lateral dapat

meningkatkan efek pengangkatan pada otot levator untuk menghasilkan

pengangkatan midface. Kelompok kami sebelumnya juga telah

menunjukkan efek pengangkatan wajah yang signifikan setelah

penggunaan ABO pada percobaan split-face.33 Efek pengangkatan ini tidak

diinduksi secara fisik oleh penusukan jarum34 karena investigasi yang lebih

baru telah menunjukkan perbaikan klinis yang lebih baik dengan

pemberian BoNT-A dibandingkan dengan normal saline dan efek pada

tingkat dermal. Seperti sudah disebutkan sebelumnya, salah satu

mekanisme yang berpotensial untuk menyebabkan pengangkatan ini

adalah stimulasi produksi kolagen.5,7,35 Pengangkatan area frontalis juga

dapat dicapai melalui penyuntikkan ABO ke bantalan rambut daerah kulit

kepala, di daerah frontalis dan di glabella.36

Namun mekanisme yang menjelaskan tentang peranan BoNT-A

intradermal dalam mencapai efek pengangkatan ini, selain kemampuannya

untuk memblok saraf yang menginduksi kontraksi otot, masih belum jelas.

Beberapa peneliti telah mengusulkan beberapa mekanisme, termasuk

kelumpuhan depressor otot, peningkatan sintesis kolagen, dan kontraksi

 fibroblas.2,19 Apakah dan bagaimana suntikan BoNT‐A intradermal dapat

menginduksi kontraksi fibroblas, dan jenis atau pengenceran toksin mana

yang berpotensi mencapai efek ini, masih harus diteliti. Oleh karena itu,

kami akan memeriksa efek BoNT-A terhadap kontraksi fibroblas dermal.

2. Diskusi

Sejauh yang kami ketahui, ini merupakan studi pertama yang

menunjukkan efek berbagai jenis dan pengenceran toksin BoNT-A

terhadap kontraksi fibroblas. Dalam perbandingan ONA dengan ABO

pada studi sebelumnya, perbaikan yang signifikan secara statistik diamati

pada garis dahi, kerutan glabellar, dan crow’s feet dibandingkan dengan

kelompok placebo,38-48 dan perbandingan BoNT-A intradermal dengan

intramuskular baru-baru ini oleh Sapra et al menunjukkan perbaikan

tekstur kulit yang signifikan bersamaan dengan pengangkatan midface

yang ringan. Kami mengusulkan salah satu mekanisme seluler potensial

yang mendasari hal ini adalah kontraksi fibroblas.

Data mengenai pengenceran toksin, belum pernah dibandingkan

dengan cara ini sebelumnya. Pada penelitian ini, kami bereksperimen

menggunakan pengenceran yang biasa kami gunakan dalam praktik klinis

sehari-hari. Contohnya, untuk suntikan intradermal pada pasien, kami

biasanya memberikan ONA dan beberapa merk toksin lainnya, dengan

menggunakan pengenceran 1:4 sampai 1:10 sedangkan ABO diencerkan

dengan perbandingan 1:7.

 Meskipun toksin yang lebih encer menghasilkan kontraksi

fibroblas yang lebih baik dan lebih cepat, kenyataannya, toksin yang lebih

encer akan menyebabkan berkurangnya dosis toksin total, sehingga

menurunkan efektivitas dan umur toksin. Menurut pengamatan kami, pada

rasio pengenceran 1:7, PRABO segera menyebabkan penurunan yang

signifikan terhadap panjang fibroblas; namun, kecepatan ini tidak diamati

pada pengenceran PRABO dengan rasio lainnya. Pada pengenceran 1:7,

ABO juga memicu kontraksi fibroblas yang signifikan, walaupun terjadi

setelah 10-12 jam, sementara tidak ada pengenceran lain yang

menyebabkan tingkat pemendekan sel yang sama. Pemendekan ini tidak

terlihat dengan pengenceran ABO lainnya. Sebaliknya, ONA tidak

menyebabkan kontraksi fibroblas, dimana panjang sel tidak mengalami

perubahan. INCO merupakan satu-satunya toksin yang mampu

menyebabkan pemendekkan sel secara signifikan pada semua pengenceran

yang diperiksa. Untuk pasien, pemendekkan ini diartikan sebagai efek

pengangkatan secara cepat yang mungkin sesuai dengan durasi total dari

khasiat toksin yang dilaporkan. Kemampuan INCO untuk memicu

kontraksi fibroblas secara signifikan dan cepat dapat digunakan sebagai

target pengobatan dalam praktik klinis. Menurut penulis, 1:6 adalah rasio

pengenceran yang paling praktis untuk penggunaan secara klinis, karena

suntikan toksin pan-facial membutuhkan dosis total 50‐60 U. Penggunaan

dosis kurang dari 50 unit pada perawatan pan‐facial tidak menghasilkan

efek pengangkatan yang terlihat setelah 2 minggu, walaupun beberapa

pengangkatan diamati segera terjadi setelah injeksi. Selain itu, meskipun

banyak pengenceran dengan LETI dan PRABO yang dilaporkan dapat

menyebabkan kontraksi fibroblas, kebanyakan pengenceran dilakukan

dengan rasio lebih dari 1: 6 dan hanya efektif untuk waktu yang singkat.

Oleh karena itu kami menyimpulkan bahwa jenis BoNT‐A yang

berbeda menyebabkan kontraksi fibroblas dengan efektivitas dan

kecepatan yang berbeda. Apakah hal ini merupakan akibat dari jenis toksin

tertentu atau apakah komponen non-toksin dari sediaan tersebut yang

menyebabkan perbedaan ini, masih harus diteliti. Hasil penelitian kami

menunjukkan bahwa walaupun fibroblas menunjukkan penyusutan

panjang, ukuran keseluruhannya tidak berubah dan mereka tidak

menghilang dari lapang pandang. Karena itu, kami percaya bahwa BoNT-

A tidak memiliki efek sitotoksik pada fibroblas, dimana hal ini sesuai

dengan pengamatan oleh peneliti lain.36 Karena hasil yang bervariasi,

dokter harus mempertimbangkan dengan cermat kecepatan yang di mana

mereka harapkan mencapai suatu hasil, terutama jika kontraksi fibroblas

dapat menghasilkan "pengangkatan" jaringan yang terlihat.

Akan menarik juga untuk menentukan dan membandingkan profil

transcriptome dan/atau proteome pada fibroblas dermal yang diobati

dengan jenis toksin botulinum yang berbeda. Profil yang mendalam

mengenai perubahan ini dapat memberikan pemahaman kepada pengguna

toksin botulinum mengenai mekanisme molekuler yang mendasari hasil

berbeda dari intervensi estetik menggunakan toksin dan juga menjelaskan

mengapa sediaan komersial yang berbeda memberikan hasil yang berbeda.

Sebagai contoh, mRNA untuk kolagen 19a1, nitric oxide synthase 2

(NOS2), chromosome 13 open reading frame 15, dan FBJ murine

osteosarcoma viral oncogene homolog (FOS) semuanya mengalami

peningkatan regulasi dalam analisis transkriptom terbaru pada fibroblas

kulit manusia yang diobati dengan BoNT-A.49 Sebagai perbandingan,

tingkat ekspresi ficolin (collagen/fibrinogen domain containing lektin) 2

(hucolin), E2F transcription factor 1, dan baculoviral IAP repeat

containing five (BIRC5) diturunkan regulasinya. Penurunan kadar NOS2

diduga berkaitan dengan regulasi proliferasi sel, sementara peningkatan

kadar FOS dikaitkan dengan regulasi proliferasi dan penuaan sel.50-55

BIRC5 mungkin ikut berperan dalam mengurangi apoptosis, sementara

PLAC8 mengatur siklus sel dan membantu apoptosis dan pembelahan

fibroblas. Kadar FGFR3P long noncoding RNA ditemukan meningkat

secara progresif pada fibroblas yang diobati dengan BoNT‐A yang

diberikan dengan dosis yang meningkat (dari 2,5 U/106 sel menjadi 7,5

U/106 sel),48 dimana peningkatan serupa juga diamati pada kadar

COL19A1.

Interpretasi kami akan lebih bermanfaat jika studi ini dilakukan

dengan analisis sampel sel yang lebih besar; Saat ini, penelitian kami

terbatas pada pengukuran 20 fibroblast per lapang pandang, meskipun 50

fibroblas dipilih pada setiap pengenceran. Selain itu, masih banyak

pengenceran lain yang dapat digunakan dalam praktik klinis. Sayangnya,

penelitian ini dirancang untuk menguji hanya 1 pengenceran tertentu dari

setiap toksin. Penelitian kami sepenuhnya dilakukan berdasarkan kultur

sel, dan investigasi lebih lanjut perlu dilakukan untuk menetapkan

pengulangan— karena kultur sel dan uji toksin dalam studi ini dilakukan

pada kesempatan berbeda, perbandingan langsung (misalnya untuk

membandingkan secara langsung Fibroblas yang diobati dengan PRABO

dan INCO) untuk menentukan derajat pemendekan fibroblas tidak

mungkin dilakukan. Meskipun kami telah melakukan percobaan yang

sama dengan toksin lain dengan pengenceran 1:1, tidak ada yang

menghasilkan kontraksi yang signifikan kecuali INCO, dimana INCO

mampu menghasilkan kontraksi paling besar dalam waktu yang paling

singkat (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut

diperlukan untuk membandingkan efektivitas antar toksin secara langsung.

Terakhir, mengumpulkan hasil pengukuran pada fibroblas yang sama

selama 24 jam juga menjadi sebuah tantangan karena kemampuan

proliferasinya.