Anda di halaman 1dari 14

ISOLASI DNA GENOM BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Oleh:

Icananda Fransiska

150210103064/ Shift B/ Kelas B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI


JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS ILMU KEGURUAN DAN PENDIDIKAN
UNIVERSITAS JEMBER
2018
BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri, berasal dari kata Latin bacterium yang berati jamak, adalah
organisme yang berkoloni yang ukurannya sangat kecil (mikroskopik) dan
kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana.
Bakteri umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi
dengan komposisi yang berbeda (peptidoglikan).
Sel bakteri memilik materi genetik di dalamnya yaitu DNA dan RNA. DNA
merupakan materi genatik yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme. Molekul DNA yang terdapat diluar inti sel ini terikat
membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas.
DNA ini susunannya adalah heliks ganda dan akan terurai menjadi untai tunggal
(single helix), saat basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling
berpasangan.
Isolasi DNA adalah teknik yang dilaukan untuk memisahkan DNA dari zat
lain yang ada di dalam sel.fungsi dari isolasi DNA adalah mendapatkan DNA
murni dari dalam sel yang akan digunakan untuk penganalisisan genotip suatu
organism ( Triwibowo, 2005). Prosesnya, sel harus dihancurkan terlebih dahulu
melalui cara mekanik ataupun enzimatis. Isolasi DNA bakteri, yaitu proses
pemisahan molekul DNA dari sel bakteri. Tehknik yang digunakan dalam
praktikum kali ini, yaitu freeze and thaw.
DNA Genom nantinya juga melewati proses elektroforesis. Elektroforesi gel
merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik
ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning,
sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut. Nantinya, DNA dapat ditentukan ukurannya dengan
melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA
didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan,
maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida kemudian
dilihat diatas sinar UV.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana mekanisme isolasi DNA Genom?
2. Bakteri apa yang bisa digunakan dalam metode freeze and thaw?
3. Apa saja bahan dan alat yang digunakan untuk melakukan teknik isolasi
DNA pada praktikum kali ini?
4. Bagaimana proses elektroforesis?
5. Apa saja alat dan bahan yang digunakan untuk proses elektroforesis?
6. Bagaimana hasil dari isolasi DNA genom bakteri pada praktikum kali ini?

1.3 Tujuan
1. Mahasiswa mampu mengetahui mekanisme proses isoladi DNA Genom
pada bakteri.
2. Mahasiswa mampu mengetahui mekanisme proses elektroforesis.
3. Mahasiswa mampu membaca hasil dari isolasi DNA Genom bakteri.
BAB II
METODE PENELITIAN
2.1 Alat dan Bahan
 Alat:
- Mikropipet
- Penangas listrik
- Eppendorf
- Disentrifugator
- Kompor
- Stopwatch
- Panci
- Elenmayer
- UV transluminator
- Box Es
- Kulkas
- Rak eppendorf
- Seperangkat alat elektroforesis

 Bahan:
- Strain Bacteri E colli
- DNA genom
- Media NB (Natrium broth)
- Media NA (Natrium Agar)
- Tissue
- Alkohol 70%
- Sarung tangan latex
- PBS
- Aquadest
- Loading dey
- Buffer TAE ( Tris Acetic EDTA)
- EtBr (Ethidium Bromide)

2.2 Langkah Kerja


Hari ke-1:

Mengambil 1000 µl kultur cair bakteri menggunakan mikropipet

Memasukkan kultur tersebut ke dalam eppendorf kemuadian


melakukan sentrifugasi selama 5 menit, 4oC , dan 10000 rpm.

Mencuci Pelet yang didapat menggunakan PBS dan


mensentrifugasi kembali.

Melakukan kegiatasn tersebut sebanyak 3 kali ulangan.

Menyimpan pelet yang didapatkan pada suhu -20oC selama 24


jam.

Hari ke-2:

Mengekstraksi DNA genome dengan mendidihkan pelet beku


selama 4 menit.

Melarutkan pelet dengan 50 µl aquadest steril.

Meresuspensi pelet dengan cara mikropipeting.

Mensentrifugasi suspensi tersebut.


Memindahkan supernatan yang diperoleh pada tabung eppendorf
yang baru.

Menambahkan 1 µl loading dye pada supernatant.

Memasukkan campuran tadi pada sumuran gel yang mengandung


EtBr.

Mengelektroforesis selama 60 menit pada 80V dengan buffer


TBE sebagai running buffer.

Mencatat hasil elektroforesis yang tampak pada UV


transluminator.
BAB III
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Penelitian

Hasil Pengamatan Keterangan

Hasil yang ditunjuk


menggunakan anak panah
berwarna hitam, itu merupakan
marker. Marker menghasilkan
banyak garis-garis. Garis
setelah marker ke kanan
merupakan hasil urut dari
kelompok 1, 2, 3, 4.
Hasil dari kelompok satu dan
dua tidak ada atau bisa
dikatakan tidak terbentuk.
Kelompok 3 dan 4 ada
bayangan garis di atas yang
bisa dibilang bentuk semir.
Semir itu bayangan yang
terdegradasi agak kembawah.
Sehingga tidak terlalu jelas
pita DNA yang terbentuk.

3.2 Pembahasan

Praktikum ini merupakan praktikum isolasi DNA genom bakteri. DNA


merupakan salah satu jenis asam nukleat yang berperan sebagai materi genetic
yang menurunkan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi turunannya
(Wirahadikusumah, 1985). Kali ini, yang di pakai di dalam praktikum adalah
bakteri. Bakteri yang digunakan adalah bakteri E.coli dan Serratia marcescens.
Sel bakteri memilik materi genetik di dalamnya yaitu DNA dan RNA. DNA
merupakan materi genatik yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme.

Isolasi DNA adalah teknik yang dilaukan untuk memisahkan DNA dari zat
lain yang ada di dalam sel.fungsi dari isolasi DNA adalah mendapatkan DNA
murni dari dalam sel yang akan digunakan untuk penganalisisan genotip suatu
organism ( Triwibowo, 2005). Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka
pengklonan DNA atau gen sasaran (Anam, 2010).

Tahapan dalam melakukan isolasi DNA, yaitu yang pertama dengan


isolasi jaringan, ke dua dinding sel dan membran sel dilisiskan, ke tiga diekstrak
dalam larutan, ke empat di purifikasi, dan kelima dipresipitasi. Beberapa kali juga
dilakukan sentrifugasi, prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih
ringan akan berada di atas. Peralatan yang digunakan dalam proses isolasi DNA
harus steril dan tidak terkontaminasi agar diperoleh DNA yang benar-benar
murni. Barulah kemudian menggunakan prinsip dasar elektroforesis, yaitu setiap
genom nantinya akan dilihat menggunakan media gel (Gusrina, 2018).

Ekstraksi dan permurnian DNA merupakan langkah penting untuk


menentukan ukuran, bentuk, dan fungsi DNA. Beberapa metode kimia ataupun
fisik dari ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan DNA
yang ada di dalam inti sel dari komponen lainnya. Ekstraksi DNA memerlukan
beberapa waktu, beberapa hasil juga bisa jadi tidak memuaskan. Proses perebusan
yang melibatkan lisis merupakan teknik yang cepat dan sederhana untuk standar
isolasi DNA bakteri, walaupun proses ini merupakan tiga kali sentrifugasi untuk
mengumpulkan sel menjadi pelet total DNA. Setelah pengendapan, asam nukleat
kemudian dapat dipisahkan dari sisa larutan dengan sentrifugasi. Penelitian ini
bertujuan untuk mengevaluasi ekstraksi DNA bakteri menggunakan metode
pendidihan konvensional diikuti dengan pengendapan alkohol (Ahmed, 2017).

DNA genom biasanya diekstraksi dengan buffer ekstraksi khusus dan


selanjutnya dimurnikan oleh fenol/ekstraksi kloroform diikuti oleh isopropanol
atau pengendapan etanol. Banyak strategi saat ini digunakan untuk ekstraksi DNA
dari sel bakteri, seperti enzimatik, kimia atau termal lisis, gangguan mekanis
dinding sel oleh manik-manik atau sonication, atau kombinasi dari yang di atas.
Variasi dalam efisiensi lysing dan kemurnian DNA secara fundamental dapat
mempengaruhi analisis DNA yang berhasil dengan metode seperti PCR. Setiap
pendekatan gangguan sel memiliki kelebihan dan kekurangan tertentu. Chemical
me-thods menggunakan deterjen untuk melarutkan selaput sel. Detergen yang
digunakan adalah SDS, Triton X-100, dan CTAB. Kerugian dari lisis sel berbasis
deterjen adalah bahwa deterjen sering mengontaminasi DNA sam-ples dan
menghambat manipulasi lebih lanjut. Enzim yang menyerang komponen
permukaan sel atau sitosol sering ditambahkan ke buffer lisis berbasis deterjen
(Ahmed, 2014).

Praktikum ini bakteri yang digunakan merupakan bakteri E.coli dan


Serratia marcescens. Bakteri gram negatif ini mudah lisis meski hanya dengan
teknik yang sederhana. Lebih mudah dikarenakan konsentrasi peptidanya lebih
besar di dinding sel. Sebenarnya, bisa juga menggunakan bakteri gram positif
hanya saja, tekniknya berbeda (Tito, 2015). Pada E coli yang mempunyai
diameter 1-3 nm dengan lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga mudah untuk
selnya dilakukan ekstraksi melalui metode freeze dan thaw (pemanasan). Serratia
marcescens adalah bakteri gram negatif milik genus Serratia dan keluarga
enterobacteriaceae yang ukurannya lebih kecil dari bakteri coliform rata-rata.

Isolasi DNA genom bakteri ini memerlukan beberapa bahan, diantaranya


terdapat media NA dan NB yang berfungsi untuk media kultur bakteri yang akan
dipakai untuk di isolasi DNA. Alkohol 70% untuk teknik sterilisasi, ada juga EtBr
(Ethidium bromide).
Ethidium bromide (EtBr) adalah bubuk warna merah dan air
pewarna fluorescent larut. Ini menyerap cahaya dalam kisaran UV (UV
maksimum absorbansi pada 210 dan 285 nm) dan memberi terang
fluoresensi oranye dalam kisaran terlihat dengan panjang gelombang 605 nm
untuk dideteksi asam nukleat dalam gel di bawah sinar trans-UV (Kumar, 2017).
EtBr bersifat mutagen dan karsinogen, sehingga harus berhati-hati dalam
melakukan pemakaiannya (Lee, 2012).

Hasil yang akan di cek DNA Genom nya dibutuhkan alat elektroforesis.
Elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel polyacrilamide
(Alberts, et al. 2002). Agarose gel elektroforesis telah terbukti menjadi cara yang
efisien dan efektif untuk memisahkan asam nukleat. Agar kekuatan gel yang
tinggi memungkinkan untuk penanganan gel persentase rendah untuk pemisahan
fragmen DNA besar. Gel agarose tradisional paling efektif pada pemisahan
fragmen DNA antara 100 bp dan 25 kb. Untuk memisahkan fragmen DNA yang
lebih besar dari 25 kb, yang dibutuhkanmenggunakan elektroforesis gel medan
pulsa, yang melibatkan aplikasi arus bolak-balik dari dua arah yang berbeda. Gel
yang lebih tipis ini memiliki konsentrasi yang lebih tinggi, sehingga
memungkinkan pemisahan fragmen DNA (dan penentuan urutan DNA) dengan
cepat (Lee, 2012).

Loading dye digunakan untuk dicampurkan ke dalam gel agarose yang


mampu memberikan warna dan menyederhanakan proses, sehingga nanti akan
muncul warna dengan standart tertentu untuk memungkinkan perkiraan jarak
fragmen DNA saat dilakukan plot pada gel (Lee, 2012).

Teknik isolasi DNA Genom ini terdapat proses disentrifugasi


menggunakan PBS. Fungsi dari PBS untuk mencuci pelet agar terbebas dari
suspensi dan harapannya DNA yang didapatkan bisa bersih dan murni (Qamar,
2016).

Penambahan PBS yang telah ditambahkan kemudian di sentrifugasi untuk


mendapatkan pellet yang akan mengendap di dasar kolom. Ketika proses
pencucian selesai, kemudian disimpan dalam suhu -20o C. Hal ini bertujuan untuk
menghindari kerusakan DNA, karena DNA yang disimpan dalam waktu yang
cukup lama dapat menyebabkan kerusakan DNA. Hasil yang diperoleh adalah
pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatant. Sehingga, yang diambil
pada tahap ini adalah bagian  pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.
Pellet tersebut berupa larutan bening. Salah satu factor yang mempengaruhi
keberhasilan isolasi DNAadalah umur sampel dan kandungan senyawa pada
sampel tersebut.

Hasil dari praktikum ini dilihat dari hasil elektroforesis. Kelompok satu
dan dua tidak ada atau bisa dikatakan tidak terbentuk. Kelompok 3 dan 4 ada
bayangan garis di atas yang bisa dibilang bentuk smear. Smear itu bayangan yang
terdegradasi agak kembawah. Sehingga tidak terlalu jelas pita DNA yang
terbentuk.

Hal tersebut menjadi tidak bisa terbentuk, bisa jadi kemungkinan pada
waktu ekstraksi tidak melakukan prosesnya secara ‘benar’ akibatnya tidak
muncul. Bisa jadi juga, memang konsentrasi DNA yang terlalu tipis sehinggaa
yang terbentuk hanyaa smear. Untai DNA yang terbentuk dengan baik, yaitu
BAB VI

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Tahapan dalam melakukan isolasi DNA, yaitu yang pertama dengan isolasi
jaringan, ke dua dinding sel dan membran sel dilisiskan, ke tiga diekstrak dalam
larutan, ke empat di purifikasi, dan kelima dipresipitasi.

Metode freeze and thaw, yaitu metode isolasi DNA yang menggunakan
teknik pendingan dan pemanasan. Dibuat agar sel bakteri lisis dalam proses
pemanasan di suhu tertentu.

Hasil yang akan di cek DNA Genom nya dibutuhkan alat elektroforesis.
Kelompok satu dan dua tidak ada atau bisa dikatakan tidak terbentuk. Kelompok 3
dan 4 ada bayangan garis di atas yang bisa dibilang bentuk smear. Smear itu
bayangan yang terdegradasi agak kembawah. Sehingga tidak terlalu jelas pita
DNA yang terbentuk.

4.2 Saran

Disarankan agar pada saat praktikum, praktikan melakukan cara yang


setidaknya sudah mendekati benar, sehingga hasil yang di dapatkan dapat di
analisis dengan benar pula.
DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B. et al. (2002). Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. New York:
Garland Science.
Ahmed, Omar Bashir. 2017. Quality Improvement of the DNA extracted by
boiling method in Gram negative bacteria. International Journal of
Bioassays.
Ahmed, Omar B. 2014. Comparison of three DNA extraction methods for
polymerase chain reaction (PCR) analysis of bacterial genomic DNA.
African Journal of Microbiology. Vol 8 (6).
Anam, K. 2010. Laporan II –Isolasi DNA Genom. Institut Pertanian, Bogor.
Gusrina. 2018. Genetika dan Reproduksi Ikan. Yogyakarta: Deepublish.
Kumar, A. Swarupa, P. Gandhi, V.P. Kumari, S. 2017. Isolation of Ethidium
Bromide Degrading Bacteria from Jharkhand. Internasional Journal of
Applied Sciences and Biotechnology. Vol 5(3).
Lee, P.Y. Costumbrado, J. Hsu, Y. Kim, H. Y. 2012. Agarose Gel
Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of
Visualized Experiments.
Qamar, W. Khan, M. R. Arafah, A. 2016. Optimization of conditions to extract
high quality DNA for PCR analysis from whole blood using SDS
proteinase K method. Saudi Journal of Biological Sciences.
Tito, TM, et al. 2015. Choice of DNA Extraction Protocols from Gram Negative
and Positive Bacteria and Directly from The Soil. African Journal of
Microbiology. Vol, 9 (12).
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular.Jakarta : Erlangga
Wirahadikusumah, M. 1985. Biokimia, Protein, Enzim dan Asam Nukleat.
Bandung: Penerbit ITB.
Lampiran: