METODE EKSTRAKSI, PURIFIKASI, KARAKTERISASI ENZIM LIPASE DAN

KARBOKSIMETIL SELULASE

MATA KULIAH KOLEKSI KULTUR DAN TEKNIK MIKROBIA

Oleh:
Akhmad Subkhan (20/470043/PBI/01739)
Cornelia Ratna K (20/470045/PBI/01741)

PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2021
I. Tujuan penelitian
1. Skrining dan identifikasi bakteri lipolitik baru Staphylococcus caprae NCU S6 yang
diperoleh dari saluran pembuangan.
2. Mengevaluasi karakteristik pertumbuhan dan mengoptimalkan kondisi kultur untuk
produksi lipase.
3. Memurnikan dan mengkarakterisasi lipase secara biokimia.

II. Metode
a. Isolasi dan indentifikasi secara molekuler strain penghasil mikrobia
Pertama-tama, sampel diambil dari lokasi saluran pembuangan yang diketahui
tercemar minyak di Universitas Nanchang. Selanjutnya, sampel diperkaya dalam medium
lisogen cair 25 ml, pH 7, yang disertai dengan pengocokan pada 150 rpm. Bakteri lipolitik
diskrining menggunakan plate agar berisi bromocresol purple (0.2%, w/v) dan tributirin
(1.0%, v/v). Setelah itu, bakteri yang diinginkan, diskrining kembali dengan rhodamin B
(0.5%, w/v) untuk produksi lipase.
 Setelah diperoleh bakteri yang diinginkan, selanjutnya dikarakterisasi morfologi,
biokimia dan molekulernya. Uji biokimia meliputi uji koagulase, sensitivitas novobiocin,
uji katalase. Pengujian ini digunakan untuk mengidentifikasi Staphylococcus dan
Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
digunakan sebagai standar. Selanjutnya, isolate diidentifikasi menggunakan sekuensing
gen 16S rRNA.
b. Kondisi kultur (kondisi optimal)
Isolat Staphylococcus caprae ditumbuhkan pada medium (mengandung 1% (b/v)
glukosa, 0,5% ekstrak khamir, 1% tripton dan 0,5% NaCl) selama semalaman pada suhu
37℃ dan pH 7,0. Setelah dilakukan preinkubasi, isolate pada medium sebelumnya,
diinokulasikan ke dalam 50 ml medium lainnya (mengandung glukosa 0,5% (w/v), tryptic
soy broth 25%, K2HPO4 0.25%, NaCl 1%, minyak zaitun 2% (v/v), dan Tween-80 1%)),
kemudian diinkubasi selama 51 jam pada orbital shaker kecepatan 200 rpm pada suhu 37℃
dan pH 7.
c. Pengukuran aktivitas Lipase
Pengukuran aktivitas lipase dilakukan menggunakan metode kolorimetri dengan
cara mengukur aktivitas hidrolisis lipase terhadap nitrofenil palmitat. Sampel direaksikan
ke dalam media mengandung 100μl pNPP (7,5mM, larutan metanol) dan 2,1 ml buffer A
(50mM TrisHCl, pH 8,0), kemudian dipanaskan ke dalam waterbath pada suhu 40℃
selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan sebanyak 100 μl enzim yang telah diencerkan.
Campuran diinkubasi pada suhu 40℃ selama 20 menit. Kontrol menggunakan lipase yang
tidak aktif secara termal untuk mempertimbangkan hidrolisis spontan pNPP. Reaksi
dihentikan dengan menambahkan 100μl ZnSO4 pada ice bath. Campuran reaksi
disentrifugasi dengan 8000 g selama 5 menit, kemudian supernatant diambil dan ditentukan
jumlah p-nitrofenol (NP) yang dibebaskan menggunakan spektrofotometer (410 nm). Satu
unit aktivitas enzim berhubungan dengan satu mikromol p-NP yang dilepaskan dari p-NPP
per menit, selain itu aktivitas spesifik dinyatakan sebagai U/mg protein.
d. Pengukuran konsentrasi protein
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradfrord. Bovine serum
albumin digunakan sebagai standar. Supernatan yang diperoleh dari media kultur terendam
setelah sentrifugasi pada 4000 g selama 30 menit digunakan sebagai ekstrak kasar pada
perlakuan pemurnian.
e. Evaluasi karakteristik pertumbuhan
Setelah mengkultur galur tunggal yang dimurnikan dalam 50 ml medium
(mengandung 1% (w/v) glukosa, 0,5% ekstrak khamir, 1% tripton dan 0,5% NaCl) selama
semalaman, kemudian isolate pada medium sebelumnya, diinokulasikan ke dalam 50 ml
medium lainnya (mengandung glukosa 0,5% (w/v), tryptic soy broth 25%, K2HPO4 0.25%,
NaCl 1%, minyak zaitun 2% (v/v), dan Tween-80 1%). Sampel diinkubasi dalam orbital
shaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 37℃ selama 5 hari. Sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis Double-Beam TU-1950 (600 nm)
setiap 3 jam sekali dan dinyatakan sebagai time-OD value curve. Selain itu, setiap 3 jam
sampel dikeluarkan dan disentrifugasi pada 8000 g selama 15 meni, dimana supernatan
akan diukur aktivitas lipasenya.
f. Produksi dan purifikasi lipase
Isolat Staphylococcus caprae NCU S6 yang telah ditumbuhkan pada medium
(mengandung glukosa 0,5% (w/v), tryptic soy broth 25%, K2HPO4 0.25%, NaCl 1%,
 minyak zaitun 2% (v/v), dan Tween-80 1%) di bawah kondisi optimal, yang telah
dipaparkan sebelumnya, kemudian diambil dan disentrifugasi pada 4000 g dengan suhu
4℃ selama 30 menit yang bertujuan untuk membuang sel. Supernatan yang dihasilkan
mengandung lipase ekstraseluler dianggap sebagai lipase kasar yang nantinya digunakan
untuk pemurnian selanjutnya. Lipase dimurnikan melalui tiga langkah, kemudian lipase
yang telah dimurnikan diberi kode SCNL. Pengukuran aktivitas lipase dan konsentrasi
protein dilakukan setelah setiap langkah.
1) Presipitasi ammonium sulfat (ASP), ultrafiltasi dan liofilisasi
Ammonium sulfat yang dibuat konsentrasi gradien (10-80%) ditambahkan ke
dalam cell-free crude extract saat dalam magnetic stirrer dengan suhu 4℃ untuk
overnight stratification. Adanya endapan pada campuran amonium sulfat diperoleh
dengan sentrifugasi pada 8000 g selama 30 menit dan disuspensikan kembali dalam
Buffer (mengandung 50mM TrisHCl, pH 8.0). Crude lipase disentrifugasi 8000 g
selama 5 menit untuk menghilangkan bahan yang tidak larut, kemudian dipekatkan
dengan ultrafiltrasi dengan Amicon-Ultra- 15. Selanjutnya, lipase pekat diliofilisasi
menggunakan freeze drier setelah dialisis untuk perlakuan selanjutnya.
2) Kromatografi filtrasi gel (GFC)
Freeze-dried powder dari larutan enzim dimuat ke dalam kolom Sephadex G-
50 (16 300mm) yang sebelumnya telah diberi Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0) pada
laju aliran 50ml/jam selama 1 jam. Selanjutnya, adanya fraksi yang menunjukkan
aktivitas lipase tertinggi dikumpulkan.
3) Kromatografi pertukaran ion (IEC)
Fraksi yang menunjukkan aktivitas lipase tertinggi sebelumnya, dimuat ke
dalam kolom DEAE-Sepharose Fast Flow (16 300mm) yang sebelumnya telah diberi
Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0). Lipase diserap oleh kolom, dan pengotor dibersihkan
menggunakan Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0) pada laju alir 50ml/jam hingga tidak
ada aktivitas lipase yang terdeteksi dalam fraksi yang dicuci. Setelah itu, yang
menunjukkan aktivitas lipase tertinggi dikumpulkan dan dipekatkan dengan ultrafiltrasi
Amicon-Ultra-15, kemudian dibekukan-kering.
g. Elektroforesis gel
Lipase dimurnikan melalui tiga langkah, kemudian lipase yang telah dimurnikan
diberi kode SCNL. SCNL di-running dalam elektroforesis gel poliakrilamida
menggunakan detergen natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE).
h. Karakterisasi biokimia lipase
1) Pengaruh suhu dan pH pada aktivitas dan stabilitas lipase
SCNL diinkubasi dalam Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0) pada suhu 10-60℃
dan pH 7,0 untuk mengetahui suhu reaksi optimalnya. Aktivitas lipase relatif dan
aktivitas spesifik ditentukan di bawah kondisi pengujian standar. Aktivitas lipase
tertinggi dianggap sebagai 100%. Lipase murni diinkubasi dalam Buffer (50mM
TrisHCl, pH 8,0) pada kisaran suhu yang sama selama 240 menit untuk mengetahui
termostabilitasnya. Aktivitas lipase yang tersisa ditentukan setiap 20 menit. Aktivitas
lipase awal diambil sebagai 100%. Aktivitas lipase diuji di berbagai buffer (Natrium
asetat (50mM, pH 3,0–5,0), natrium fosfat monobasa (50mM, pH 6,0–7,0), TrisHCl
(50mM, 8,0–9,0) dan glisin/NaOH (50mM, 10,0-12,0)) selama 30 menit pada 40℃
untuk mengetahui nilai pH optimalnya. Lipase murni diinkubasi dalam buffer-buffer
berbeda yang sebelumnya telah disebutkan, selama 7,0 jam untuk menguji stabilitas
 pH-nya, kemudian sisa aktivitas ditentukan setiap jam seperti yang telah dilakukan
sebelumnya.
2) Pengaruh pelarut organik pada stabilitas lipase
Enzim dalam Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0) dicampur dengan pelarut organik
yang berbeda (Lampiran; Tabel 1) selama 1 dan 28 hari, kemudian diinkubasi pada
37℃ dan 200 rpm untuk mengetahui pengaruh pelarut organik pada stabilitas
lipasenya. Selain itu, pengujian juga dilakukan pada kontrol tanpa pelarut organik.
Aktivitas residu lipase diukur dalam kondisi standar, sampel diambil secara berkala dan
konsentrasi akhir pelarut organik kurang dari 3% (v/v).
3) Pengaruh ion logam, inhibitor dan deterjen pada stabilitas lipase
Aktivitas relatif diukur dengan menginkubasi larutan lipase dengan masing-
masing aditif. Semua reagen disiapkan dalam Buffer (50mM TrisHCl, pH 8,0), dengan
masing-masing ion logam pada konsentrasi akhir 1 atau 10mM (Lampiran; Tabel 2).
Campuran reaksi yang mengandung 0,1 atau 1% (v/v atau w/v) deterjen dan inhibitor
(Lampiran; Tabel 3) juga diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Aktivitas lipase
tanpa penambahan ion logam, inhibitor atau deterjen didefinisikan sebagai 100%, dan
aktivitas relatif ditentukan dibandingkan dengan kontrol. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan p-NPP sebagai substrat.
4) Penentuan kinetika reaksi dan spesifisitas substrat
Aktivitas spesifik SCNL ditentukan dengan konsentrasi pNPP yang berbeda
yakni 0,1–5,0 mM dalam kondisi optimum. Spesifisitas substrat dengan panjang rantai
yang bervariasi dan saturasi yang berbeda diuji secara kolorimetri dan titrimetri.
Setelah itu, aktivitas spesifik dan aktivitas relatif SCNL terhadap ester asam lemak p-
NP (C2–C18), trigliserida (C2–C18) dan nature oil diukur.
i. Analisis statistik (SPSS 19.0).
I. Tujuan penelitian
1. Isolasi dan identifikasi mikrobia penghasil enzim selulolitik.
2. Pengaruh mutasi acak sinar UV pada Bacillus cereus FOA-2 terhadap aktivitas selulolitik
3. Mengetahui sifat-sifat enzim selulolitik yang telah dipurifikasi

II. Metode
a. Isolasi Mikroorganisme dan Skrining
Limbah batang pisang raja dipotong-potong sebanyak 2 g dan dipindahkan ke
Erlenmeyer yang berisi air suling steril secara aseptis. Larutan yang dihasilkan diencerkan
secara berseri untuk mengisolasi spesies bakteri yang tumbuh pada batang pisang raja.
Seratus mikroliter (100 L) larutan dari masing-masing tabung pengenceran berseri
diinokulasikan dengan metode spread pada media Nutrient agar (NA) dan diinkubasi pada
suhu 37°C selama 48 jam. Kultur murni bakteri diperoleh setelah subkultur dan
diidentifikasi dengan mengamati karakteristik morfologi, fisiologis dan biokimia. Isolat
yang teridentifikasi dipelihara pada Nutrient agar (NA) miring, disimpan pada suhu 4°C
dan disubkultur secara berkala pada agar miring yang baru.
 Metode skrining kualitatif dengan menggunakan media garam mineral (MSM)
yang dilengkapi dengan sumber karbon 1% karboksimetil selulosa (CMC). Pada media
skrining dibuat sumuran dengan diameter sebesar 5 mm, kemuadian masing-masing isolat
murni diinokulasi dengan hati-hati di dalam sumur, setalah itu diinkubasi pada suhu 37°C
selama 48 jam dan diamati zona beningnya dengan menuangkan 0.05% Congo red dye
pada sumuran. Koloni yang menunjukkan zona bening pada latar belakang gelap dianggap
sebagai bakteri penghasil selulase dan identitas isolat bakteri dengan indeks selulolitik
tertinggi dikonfirmasi menggunakan teknik molekuler.
b. Identifikasi Molekuler Isolat Bakteri
Karakterisasi molekuler organisme dengan potensi selulolitik tertinggi
(dilambangkan FAO-2) dilakukan dengan menggunakan analisis gen 16S rRNA. DNA
diekstraksi dari kultur bakteri menggunakan metode CTAB. Kualitas dan integritas DNA
yang diekstraksi ditentukan dengan elektroforesis gel Agarosa dengan fraksinasi ukuran
pada gel Agarosa 1,0%. Analisis PCR dijalankan dengan primer universal gen 16S rRNA
untuk bakteri: Forward primer: (518F 5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3') dan
Reverse primer: 800R: (5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3') dan amplikon selanjutnya
dimurnikan sebelum sekuensing menggunakan teknik pencucian natrium asetat 2M. Set
primer universal yang sama ini digunakan untuk pengurutan dan data urutan dipangkas
dengan menghapus data yang tidak diketahui menggunakan Perangkat Lunak CLC Free
Workbench. Data yang diperoleh disalin ke situs web NCBI untuk identifikasi bakteri.
Urutan gen 16S rRNA dari sepuluh (10) sebelumnya dilaporkan Bacillus sp. diambil dari
Genbank. Urutan ini disejajarkan dengan urutan gen 16S rRNA bakteri yang diperoleh dari
penelitian ini (FAO-2) menggunakan perangkat lunak Clustal W. Pohon filogenetik dibuat
menggunakan metode Neighbor dan perangkat lunak MEGA X.
c. Mutasi isolat dengan sinar Ultraviolet
Isolat pendegradasi selulosa yang diidentifikasi mengalami mutasin dengan
paparan sinar ultraviolet (λ254, 20 W) menurut metode yang dijelaskan sebelumnya oleh
Shahbazi dkk. Perlakuan UV media skrining dilakukan pada jarak 15 cm dari sumber
cahaya dengan lama waktu yang berbeda yaitu 20, 40 dan 60 menit. Setelah itu, koloni
mikroba yang selamat dari paparan diambil dan diinokulasi ke media agar nutrisi baru dan
diperiksa pertumbuhannya setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37°C.
d. Skrining Isolat Mutan untuk Aktivitas Selulolitik
Strain mutan yang diperoleh diskrining untuk aktivitas selulolitik pada pelat media
agar baru yang mengandung CMC (1% b/v). Kemudian diinkubasi pada suhu 30°C selama
24 jam untuk memeriksa aktivitas selulolitik. Untuk mengetahui produksi karboksimetil
selulase, pelat diwarnai dengan pewarna merah Kongo (0,05%). Strain mutan dengan
potensi selulolitik tertinggi dipilih berdasarkan indeks selulolitik maksimum dan
selanjutnya digunakan untuk produksi karboksimetil selulase (CMCase) dalam kultur cair
untuk pemurnian dan karakterisasi.
e. Produksi dan Pemurnian Enzim
1) Persiapan media dan Produksi
Produksi enzim dilakukan menggunakan media dari batang pisang raja sebagai
sumber karbon. Batang pisang raja dipotong kecil-kecil, dibilas dengan air mengalir
dan dikeringkan dalam oven pada suhu 90°C selama 48 jam. Kemudian digiling (≈2
mm) digunakan sebagai substrat dalam formulasi media untuk produksi enzim.
Medium mineral cair terdiri dari: K2HPO4 0.09%, KH2PO4 0.02%, MgSO4.7H2O
 0.05%, KCl 0.02%, FeSO4 0.02%, CaCl2.2H2O 0.01%, ZnSO4 0.0002%, (NH4)2NO3
0.1%, yeast extract 0.67% carboxymethyl cellulose 0.5% and Plantain stalk 1%. Media
di steril menggunakan autoklaf pada 15 psi selama 15 menit pada 121°C, setelah itu
diinokulasi dan diinkubasi suhu optimal terbaik. Kultur dipanen setelah 72 jam
inkubasi dan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 .°C untuk
mendapatkan filtrat kultur bebas sel atau supernatant.
2) Pengendapan Amonium Sulfat
Supernatan yang diperoleh dari biakan setelah sentrifugasi diambil sebagai
larutan enzim kasar dan pertama-tama dijenuhkan 60% dengan penambahan bertahap
garam amonium sulfat untuk mengendapkan protein pada suhu dingin 4°C. Larutan
yang dihasilkan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit untuk mengumpulkan
endapan yang didialisis secara ekstensif terhadap buffer asetat (20 mM, pH 5) di bawah
suhu dingin 4°C.
3) Kromatografi Kolom
Dialisat yang diperoleh setelah salting-out pertama dimuat ke dalam kolom
kromatografi penukar ion (2,5 cm x 40 cm) yang dikemas dengan resin DEAE-
Sephadex A-50 yang sudah dicuci dan diseimbangkan dengan buffer natrium asetat 20
mM, pH 5,0. Protein dielusi dari kolom pada laju aliran konstan 120 mM/jam
menggunakan buffer yang sama dan protein teradsorpsi dilepaskan dengan elusi
gradien dengan larutan natrium klorida 1 M. Fraksi 5 mL dikumpulkan dalam tabung
koleksi, dipantau keberadaan protein pada 280 nm dengan spektrofotometer UV-
Visible. dan diuji aktivitas karboksimetil selulase (CMCase) menggunakan metode
pengujian yang dijelaskan sebelumnya oleh Adrangi dkk. Tabung yang memiliki
aktivitas CMCase dikumpulkan bersama untuk menentukan aktivitas total dan
konsentrasi protein. Larutan sampel yang terkumpul dipekatkan dengan sistem
ultrafiltrasi 10 kDa sebelum dimasukkan ke dalam kolom filtrasi gel (diameter 2,5 cm)
yang dikemas hingga ketinggian 70 cm dengan Sephadex G-100. Kolom sebelumnya
diseimbangkan dengan buffer natrium asetat (20 mM, pH 5,0) dan dicuci dengan buffer
yang sama dengan pemantauan protein pada 280 nm. Tabung aktif dengan aktivitas
CMCase dikumpulkan dan digunakan sebagai enzim murni untuk studi karakterisasi
biokimia.
f. Aktivitas Karboksimetil Selulase dan Penentuan Kandungan Protein
Aktivitas karboksimetil selulase (CMCase) ditentukan dengan menggunakan
metode yang dijelaskan oleh Adrangi dkk. Dalam reaksi ini, 1 mL larutan enzim
ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL karboksimetil selulosa, CMC (1%)
tersuspensi dalam buffer natrium asetat (50 mM, pH 4,8). Tabung reaksi diinkubasi pada
suhu 40°C dalam penangas air termostatik 30 menit. Jumlah gula pereduksi yang
dilepaskan diukur menggunakan metode asam dinitrosalisilat (DNSA). Satu unit aktivitas
enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan satu
mikromol gula pereduksi per menit dalam kondisi pengujian. Konsentrasi protein diukur
menggunakan metode Bradford, dengan protein standar sebagai bovine serum albumin
(BSA)
g. Penentuan berat molekul
Massa molekul subunit dari karboksimetil selulase dimurnikan dari mutan B.
cereus FOA-2 ditentukan dalam kondisi denaturasi menggunakan 12% elektroforesis gel
natrium dodesil sulfat poliakrilamida menggunakan (12% SDS-PAGE). Berat molekul
 standar yang digunakan untuk estimasi terdiri dari protein dengan berat molekul berkisar
antara 20 kDa hingga 100 kDa.
h. Karakterisasi Biokimia Karboksimetil Selulase
1) Pengaruh pH Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Karboksimetil Selulase
Pengaruh pH larutan terhadap aktivitas enzim ditentukan dengan melakukan
reaksi enzim-substrat pada pH larutan yang berbeda di daerah asam dan basa. Substrat
(1% CMC) disiapkan dalam 50 mM dari masing-masing buffer; Glycine-HCl (pH 3.0),
Sodium Acetate (pH 4.0 - 5.0), Potassium Phosphate (pH 6.0 - 7.0), Tris-HCl (pH 8.0
- 9.0), Glycine-NaOH (pH 10 - 11) dan uji aktivitas enzim dilakukan seperti yang
dijelaskan sebelumnya kecuali untuk perubahan pH larutan jika diperlukan. Studi
stabilitas pH dilakukan dengan pra-inkubasi enzim murni yang diencerkan dalam
larutan buffer yang berbeda selama 3 jam dan memperkirakan aktivitas enzim residual
dalam alikuot yang diambil dari tabung setiap 30 menit.
2) Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Karboksimetil Selulase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ditentukan dengan melakukan reaksi
enzim-substrat pada suhu inkubasi yang berbeda (30 - 90°C) tetapi mempertahankan
kondisi reaksi lain dari waktu inkubasi dan pH. Stabilitas termal enzim ditentukan
dengan prainkubasi pada suhu yang berbeda dalam penangas air termostatik dengan
penarikan alikuot setiap 30 menit untuk memperkirakan aktivitas residu menggunakan
prosedur uji standar yang dijelaskan sebelumnya.
3) Pengaruh Ion Logam pada Aktivitas Karboksimetil Selulase
Efek dari ion logam yang berbeda diuji pada aktivitas selulase karboksimetil
dimurnikan pada CMC. Aktivitas enzim, seperti yang dijelaskan sebelumnya
ditentukan dengan adanya konsentrasi garam 5 mM ion logam ini (Na+, K+, M N2+,
Mg2+, Pb2+, Cu2+ dan Hg2+) disiapkan dalam buffer asetat (50 MM, pH 5.0). Aktivitas
dihitung relatif terhadap blanko yang tidak mengandung ion logam dan dikoreksi untuk
setiap absorbansi latar belakang enzim menggunakan bank enzim yang dibuat tanpa
substrat maupun ion logam.
4) Analisis Parameter Kinetik
Substrat (CMC) disiapkan pada konsentrasi yang berbeda antara 1-10 mg/mL
dan digunakan dalam reaksi substrat enzim untuk menentukan sifat kinetik (KM dan
Vmaksimal) dari karboksimetil selulase murni dari mutan B. cereus FOA-2. Uji enzim
dilakukan di bawah kondisi standar seperti yang dijelaskan sebelumnya dan nilai
parameter yang akurat diperoleh dari plot timbal balik ganda yang dijelaskan oleh
Lineweaver dan Burk.
i. Analisis Data
LAMPIRAN
 DAFTAR PUSTAKA

Olukunle, O.F., Ayodeji, A.O and Akinloye, P.O. 2021. Carboxymethyl Cellulase (CMCase) from
UV-irradiation Mutated Bacillus cereus FOA-2 cultivated on Plantain (Musa parasidiaca)
Stalk-based Medium: Production, Purification and Characterization. Scientific African 1:1-
11.
Zhaoa, J., Maa, M., Zenga, Z., Yua, P., Gonga, D and Deng, S. 2021. Production, purification and
biochemical characterisation of a novel lipase from a newly identified lipolytic bacterium
Staphylococcus caprae NCU S6. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
36(1): 248–256.