28
Buletin Teknik Pertanian Vol. 15, No. 1, 2010: 28-32 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflatoksin B1 pada jagung menggunakan kit ELISA
TEKNIK PENGUJIAN KADAR AFLATOKSIN B1 PADA JAGUNG MENGGUNAKAN KIT ELISA
Heny Yusrini
Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai Besar Penelitian Veteriner
Jalan R.E. Martadinata No. 30, Kotak Pos 52, Bogor 16114, Telp. (0251) 8334456, Faks. (0251) 8336425, E-mail: balitvet@indo.net.id
J agung merupakan salah satu komponen penting dalam
pakan ternak. Keperluan jagung untuk pakan dan industri
pangan lebih besar dibanding untuk konsumsi langsung.
Kebutuhan jagung untuk pakan diproyeksikan meningkat
dari 3,34 juta ton pada tahun 2005 menjadi 4,90 juta ton pada
tahun 2010 (Direktorat Jenderal Pengolahan dan Pemasaran
Hasil Pertanian 2007).
Komposisi jagung pada pakan ternak mencapai 60%.
Oleh karena itu, penggunaan jagung yang berkualitas baik
sangat penting untuk menghasilkan pakan yang bermutu
baik. Masalah yang sering timbul dalam pemanfaatan jagung
sebagai bahan pangan maupun pakan adalah kontaminasi
senyawa aflatoksin. Senyawa ini dihasilkan oleh kapang
Aspergilus flavus yang umumnya tumbuh pada jagung yang
berkadar air tinggi (>15%) akibat cara penyimpanan yang
kurang benar (Rachmawati 2004).
Secara kasat mata, kandungan aflatoksin pada jagung
dapat terlihat pada biji maupun tongkol yang berwarna semu
ungu sampai ungu, dan bila dilihat pada lampu florescens,
warna ungu tersebut akan berpendar. Namun, cara tersebut
hanya dapat digunakan bila kandungan aflatoksin pada
jagung sudah tinggi. Berdasarkan Standar Nasional Indo-
nesia (SNI 2000), kadar aflatoksin maksimal pada jagung
untuk pakan adalah 50 ppb (part per billion).
Untuk mengetahui kadar aflatoksin pada jagung secara
tepat, diperlukan metode yang terstandar, antara lain Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Metode ELISA dapat
dipilih sebagai metode skrining karena dapat menganalisis
sampel jagung secara cepat, sensitif, dan relatif murah
(Stanker dan Beier 1995). Balai Besar Penelitian Veteriner
(Bbalitvet) telah berhasil mengembangkan perangkat analisis
aflatoksin metode ELISA berupa kit yang berisi pereaksi
analisis dilengkapi dengan program pengolah data (Rachma-
wati 2005). Percobaan bertujuan untuk mengetahui teknik
pengujian aflatoksin pada jagung dengan kit ELISA.
BAHAN DAN METODE
Percobaan dilaksanakan di laboratorium toksikologi Bbalitvet,
Bogor, pada bulan Juni sampai November 2008. Kegiatan
pengujian diawali dengan pengumpulan sampel jagung dari
bagian diagnostik Bbalitvet dengan sampel jagung berasal
dari pasaran. Selanjutnya, sampel dianalisis untuk
mengetahui kadar aflatoksinnya.
Bahan yang digunakan untuk pengujian kadar aflatoksin
adalah sampel jagung, bahan untuk ekstraksi sampel yaitu
metanol 60%, dan bahan untuk analisis aflatoksin yaitu
perangkat kit ELISA yang terdiri atas seri standar aflatoksin
B1 (AFB1) 0,12 ppb sampai dengan 30 ppb, plat pencampur,
plat yang sudah dilapis antibodi (coated antibody plate),
konjugat AFB1 HRPO pekat (1/100), pengencer konjugat
larutan BSA/PBS, substrat A (bufer asetat), substrat B
(tetrametilbenzidin/DMSO), dan larutan penghenti H 2SO 4
1,25 M. Peralatan yang digunakan yaitu pipet mikro 1-10 µl,
40-200 µl, dan 200-1.000 µl, multichannel pipet 40-300 µl,
reservoir, tisu, pipet tip, effendorf, rak tabung, timbangan,
plat pencampur, pengocok, sentrifuse, dan ELISA reader.
Bagan alir analisis aflatoksin menggunakan kit ELISA
yang dilakukan di laboratorium Bbalitvet dapat dilihat pada
Gambar 1.
Cara Kerja
Preparasi Sampel
Sampel yang berupa biji jagung digiling dengan menggu-
nakan penggiling Retsel Muhle dan disaring dengan
saringan 0,75 mesh, kemudian diambil subsampel.
Preparasi Ekstrak Sampel
Untuk mengekstrak sampel, dibuat 100 ml metanol 60%
dengan cara mencampur 60 ml metanol pa dengan 40 ml
akuades. Selanjutnya, ditimbang 25 g sampel jagung lalu
dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, dan ditambahkan
50 ml metanol 60% lalu digoyang selama 30 menit. Campuran
lalu disentrifuse pada 3.000 rpm selama 15 menit. Larutan
yang jernih diambil untuk digunakan sebagai bahan analisis.
Plat mikro, baik plat pencampur maupun plat berlapis
antibodi terdiri atas lubang-lubang (sumur), lubang ke bawah
Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflatoksin B1 pada jagung menggunakan kit ELISA 29

Dalam plat pencampuran mulai dari A sampai H, ke samping mulai dari No 1 sampai 12,
t
sehingga jumlahnya 96 lubang. Untuk memudahkan pelak-
100 µl larutan standar AFB1 atau ekstrak sampel sanaan analisis, dibuat sketsa Bagan I dan II sebagai acuan,
t
(Tabel 1 dan 2)..
+ 100 µl AFB1-HRPO (konjugat)

t Preparasi Konjugat Encer

Kocok
Untuk keperluan analisis, konjugat yang digunakan adalah
Pipet 75 µl 75 µl konjugat encer, dibuat dengan menambahkan 25 µl konjugat
pekat yang tersedia ke dalam setiap ml pengencer konjugat
Dimasukkan ke dalam lubang pada plat berlapis antibodi atau 200 µl ke dalam 8 ml pengencer konjugat (BSA/PBS 1%).
t
Inkubasi selama 5 menit
Preparasi Larutan Substrat
t
Plat dicuci dengan akuades 3 kali Untuk pengembangan warna pada mikroplat sebelum tahap
t penambahan substrat, ke dalam botol berisi larutan substrat
+ Substrat TMB, biarkan 10 menit A masing-masing 11 ml ditambahkan 330 µl larutan substrat
t B (tetrametilbenzidin/dalam DMSO). Tahapan kerjanya
+ Larutan penghenti reaksi (50 µl), berubah warna kuning adalah sebagai berikut:
t • Semua bahan dikondisikan pada suhu kamar. Pada plat
Baca pada ELISA reader (450 nm)
pencampuran, dilakukan pencampuran antara standar
Gambar 1. Bagan alir analisis aflatoksin menggunakan kit AFB1 dan konjugat encer serta ekstrak sampel dan
ELISA, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008 konjugat encer.

Tabel 1. Bagan I: Posisi standar AFB1 dan sampel pada plat pencampur, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
Sumur 1 2
A 100 µl standar 0 + 100 µl std 0 100 µl ekstrak sampel 1 + konjugat
B 100 µl standar 1 (30 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 2 + konjugat
C 100 µl standar 2 (10 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 3 + konjugat
D 100 µl standar 3 (3,30 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 4 + konjugat
E 100 µl standar 4 (1,10 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 5 + konjugat
F 100 µl standar 5 (0,37 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 6 + konjugat
G 100 µl standar 6 (0,12 ppb) + konjugat 100 µl ekstrak sampel 7 + konjugat
H 100 µl standar 0 + konjugat 100 µl ekstrak sampel 8 + konjugat

Tabel 2. Bagan II: Posisi standar AFB1 dan sampel pada plat berlapis antibodi, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
Sumur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanko Blanko Spl 1 Spl 1 Spl 9 Spl 9 Spl 17 Spl 17 Spl 25 Spl 25 Blanko Blanko
B Std. 30 ppb Std. 30 ppb Spl 2 Spl 2 Spl 10 Spl 10 Spl 18 Spl 18 Spl 26 Spl 26 Std. 30 ppb Std. 30 ppb
C Std. 10 ppb Std. 10 ppb Spl 3 Spl 3 Spl 11 Spl 11 Spl 19 Spl 19 Spl 27 Spl 27 Std. 10 ppb Std. 10 ppb
D Std. 3,30 ppb Std. 3,30 ppb Spl 4 Spl 4 Spl 12 Spl 12 Spl 20 Spl 20 Spl 28 Spl 28 Std. 3,30 ppb Std. 3,30 ppb
E Std. 1,10 ppb Std. 3,30 ppb Spl 5 Spl 5 Spl 13 Spl 13 Spl 21 Spl 21 Std. 1,10 ppb Std. 3,30 ppb
F Std. 0,37 ppb Std. 0,37 ppb Spl 6 Spl 6 Spl 14 Spl 14 Spl 22 Spl 22 Std. 0,37 ppb Std. 0,37 ppb
G Std. 0,12 ppb Std. 0,12 ppb Spl 7 Spl 7 Spl 15 Spl 15 Spl 23 Spl 23 Std. 0,12 ppb Std. 0,12 ppb
H Kontrol Kontrol Spl 8 Spl 8 Spl 16 Spl 16 Spl 24 Spl 24 Kontrol Kontrol
Blanko (standar 0): tidak ada konjugat
Spl 1 = sampel no. 1 kode J1 dan seterusnya
Baris ke 11-12: diisi dengan deret standar kembali
Std = standar
30 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflatoksin B1 pada jagung menggunakan kit ELISA
• Larutan standar 0 dipipet 100 µl lalu dimasukkan ke dalam
sumur deret A 1 (untuk blanko) dan 100 µl pada sumur H
1 (untuk kontrol). Selanjutnya dimasukkan standar AFB1,
dimulai pada konsentrasi terkecil agar dapat menggunakan
pipet tip yang sama.
• Larutan standar 6 (0,12 ppb) dipipet 100 µl ke dalam sumur
deret G 1, 100 µl larutan standar 5 (0,37 ppb) ke dalam sumur
deret F1, 100 µl larutan standar 4 (1,10 ppb) ke dalam sumur
deret E1, 100 µl larutan standar 3 (3,30 ppb) ke dalam sumur
deret D1, 100 µl larutan standar 2 (10 ppb) ke dalam sumur
deret C1, dan 100 µl larutan standar 1 (30 ppb) ke dalam
sumur deret B1.
Untuk ekstrak sampel jagung, tahapan kerjanya adalah
sebagai berikut:
• Ekstrak sampel 1 dipipet 100 µl lalu dimasukkan ke dalam
sumur A2, selanjutnya ekstrak sampel 2 ke dalam sumur B
2, dan seterusnya. Pipet tip diganti untuk setiap sampel.
• Larutan konjugat encer AFB1 HRPO 100 µl ditambahkan
ke dalam deret sumur 1 (B-H), kecuali sumur A1 (untuk
blanko, standar 0 tidak ditambah konjugat), dan ke dalam
sumur yang berisi ekstrak sampel (A2 sampai H2, A3 sampai
H3, dan seterusnya). Ke dalam sumur A1 ditambahkan lagi
100 µl standar 0.
Ke dalam plat yang terlapis antibodi, cara kerjanya
adalah sebagai berikut:
• Dengan menggunakan multichannel pipet, dilakukan
pencampuran standar dan konjugat atau ekstrak sampel
dan konjugat, dipipet dan keluarkan kembali dalam lubang
yang sama sebanyak empat kali, kemudian dipindahkan
sebanyak 75 µl larutan yang telah dicampur dalam plat
pencampur ke dalam plat yang sudah dilapis antibodi
sumur A1 sampai H1, dilakukan dua kali untuk duplikatnya
(A2 sampai H2).
• Untuk sampel, 75 µl larutan sampel ekstrak (A2-H2) yang
sudah dicampur dengan konjugat dimasukkan ke dalam plat
pencampuran lalu dimasukkan ke dalam sumur plat yang
terlapis antibodi A3 sampai H3, dilakukan duplikatnya (A4-
H4), dan seterusnya. Setelah selesai lalu diinkubasi dan
biarkan selama 5 menit.
• Larutan dibuang dan plat dicuci tiga kali dengan air.
• Larutan substrat disiapkan dengan mencampurkan sub-
strat B (330 µl ) ke dalam satu botol larutan substrat A (11
ml). Selanjutnya, ditambahkan 100 µl larutan substrat yang
sudah dicampur (substrat A + substrat B) dan dibiarkan
10 menit. Pada tahap ini akan terbentuk warna hijau; makin
tinggi konsentrasi AFB1 pada plat mikro atau makin tinggi
konsentrasi AFB1 pada sampel, warna yang terbentuk
makin pudar.
• Tambahkan 50 µl larutan penghenti, warna larutan pada
plat mikro berubah menjadi kuning. Intensitas warna dibaca
pada ELISA reader (450 nm).
Pencatatan Data
Pembacaan plat mikro pada ELISA reader diperoleh nilai
serapan warna (optical density, OD atau absorban, A) untuk
masing-masing sumur ( blanko standar, standar, dan sampel).
Selanjutnya dihitung nilai persentase inhibisinya untuk
masing-masing standar dan sampel dengan rumus sebagai
berikut:
{1 - (A standar - A blanko standar)}
% inhibisi standar = —————————————— x 100
A kontrol - A blanko standar
{1 - (A sampel - A blanko standar)}
% inhibisi sampel = —————————————— x 100
A kontrol - A blanko standar
Persentase inhibisi standar dan sampel dihitung dengan
program yang disediakan dan kurva kalibrasi standar, yaitu
plot antara persen inhibisi standar versus log konsentrasi
AFB1 akan muncul. Selanjutnya, dengan memasukkan nilai
OD yang diperoleh ke dalam program pengolahan data yang
disiapkan dapat diketahui konsentrasi sampel.
Jika persentase inhibisi sampel yang diperoleh lebih
besar dari persentase inhibisi standar 10-30 ppb, berarti
sampel mengandung AFB1 tinggi. Jika persentase inhibisi
negatif berarti sampel tidak mengandung aflatoksin (AFB1
di bawah limit deteksi, < 0,30 ppb)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel 3 menyajikan hasil pembacaan seri standar AFB1 dari
konsentrasi tinggi (30 ppb) (B1,2 dan B11,12) sampai rendah
(0,12 ppb) (G1,2 dan G11,12). Pembacaan dilakukan duplo
(dua kali), yaitu untuk kolom 1 dan 2, sedangkan untuk kolom
selanjutnya (kolom 3-10) adalah hasil pembacaan OD sampel,
sedangkan kolom 11 dan 12 untuk OD standar. Nilai OD yang
diperoleh dirata-ratakan seperti disajikan pada Tabel 4.
Selanjutnya persen inhibisi dihitung berdasarkan rumus
(sudah disediakan dalam program) dan hasilnya disajikan
pada Tabel 5. Kadar AFB1 pada sampel jagung dapat
diketahui dengan mengacu pada kalibrasi standar pada
Gambar 2 untuk sampel J1- J16 dan kalibrasi standar (Gambar
3) untuk sampel J17-J28.
Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflatoksin B1 pada jagung menggunakan kit ELISA 31

Tabel 3. Hasil pembacaan optical density (OD) sampel jagung pada ELISA reader, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
Kolom
Sumur
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,085 0,080 0,432 0,783 0,196 0,186 0,367 0,370 0,075 0,080 0,076 0,075
B 0,179 0,175 0,391 0,469 0,219 0,184 0,460 0,467 0,074 0,074 0,103 0,114
C 0,274 0,225 0,207 0,186 0,245 0,196 0,502 0,470 0,075 0,080 0,148 0,163
D 0,369 0,369 0,579 0,555 0,661 0,391 0,389 0,376 0,280 0,348 0,193 0,230
E 0,438 0,432 0,379 0,609 0,703 0,572 0,077 0,079 0,341 0,341
F 0,536 0,489 0,192 0,194 0,416 0,681 0,077 0,079 0,408 0,399
G 0,557 0,564 0,166 0,159 0,474 0,561 0,310 0,316 0,460 0,432
H 0,602 0,601 0,167 0,197 0,170 0,148 0,561 0,424 0,574 0,587
Kolom 1 dan 2 serta kolom 7 dan 8 adalah nilai OD standar AFB1, dari A std 0 (blanko), B std 30 ppb, C 10 ppb, D 3,30 ppb, E 1,10 ppb, F 0,37
ppb, G 0,12 ppb, dan H kontrol positif
Kolom 3-6 dan kolom 9-12 adalah nilai OD sampel jagung masing-masing dianalisis duplo (3, 4), (5, 6), (9, 10), dan (11, 12)

Tabel 4. Rata-rata nilai optical density (OD) standar aflatoksin B1 (AFB1) dan sampel jagung, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
Standar AFBI OD Sampel OD Sampel OD Sampel OD Sampel OD Standar AFB1 OD
Std 0 0,085 J1 0,608 J9 0,191 J17 0,369 J25 0,078 Std 0 0,076
30 ppb 0,177 J2 0,430 J10 0,202 J18 0,464 J26 0,074 30 ppb 0,109
10 ppb 0,250 J3 0,197 J11 0,221 J19 0,486 J27 0,078 10 ppb 0,156
3,30 ppb 0,369 J4 0,567 J12 0,526 J20 0,383 J28 0,314 3,30 ppb 0,212
1,10 ppb 0,435 J5 0,494 J13 0,638 J21 0,078 1,10 ppb 0,341
0,37 ppb 0,513 J6 0,193 J14 0,548 J22 0,078 0,37 ppb 0,404
0,12 ppb 0,561 J7 0,163 J15 0,518 J23 0,313 0,12 ppb 0,446
Kontrol 0,602 J8 0,182 J16 0,519 J24 0,493 Kontrol 0,581

Tabel 5. Persen inhibisi standar aflatoksin B1 (AFB1) dan sampel jagung, laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
Standar AFB1 % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Sampel % inhibisi Standar % inhibisi
J1 -1 J9 68,2 J17 36,5 J25 86,6
30 70,6 J2 28,5 J10 66,5 J18 20,2 J26 87,3 30 81,3
10 58,5 J3 67,3 J11 63,3 J19 16,3 J27 86,6 10 73,2
3,30 38,7 J4 5,7 J12 12,6 J20 34,1 J28 45,9 3,30 63,6
1,10 27,7 J5 17,9 J13 -6,0 J21 86,6 1,10 41,3
0,37 14,8 J6 67,9 J14 8,8 J22 86,6 0,37 30,5
0,12 6,8 J7 73,0 J15 14,0 J23 46,1 0,12 23,2
J8 69,7 J16 73,6 J24 15,2

% inhibisi % inhibisi
100 100

80 y = 12,95Ln(x) + 26,508 y = 12,145Ln(x) + 43.396

80
R 2 = 0,9916 R2 = 0,9682
60 60

40 40

20 20

0 0
0 1 10 100 0 1 10 100
Aflatoksin B1 (ng/ml) Aflatoksin B1 (ng/ml)

Gambar 2. Kalibrasi standar aflatoksin B1 (AFB1) untuk Gambar 3. Kalibrasi standar aflatoksin B1 (AFB1) untuk
menghitung kadar AFB1 pada sampel jagung (J1-J16), menghitung kadar AFB1 pada sampel jagung (J17-J28),
laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008 laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
32 Heny Yusrini: Teknik pengujian kadar aflatoksin B1 pada jagung menggunakan kit ELISA

Hasil analisis kadar AFB1 pada sampel jagung disajikan
pada Tabel 6. Berdasarkan data pada Tabel 6 diketahui bahwa
8 dari 28 sampel jagung (28,60%) yang dianalisis me-
ngandung AFB1 dengan kadar di atas baku mutu yang
dipersyaratkan SNI 2000, yaitu kadar AFB1 > 50 ppb. Kadar
AFB1 yang tinggi pada jagung akan berpengaruh terhadap
kualitas pakan yang dihasilkan. Oleh karena itu, diperlukan
tindakan untuk mengamankan produksi pakan dengan
kualitas yang baik, terutama dengan kadar AFB1 rendah
sesuai dengan yang dipersyaratkan SNI. Upaya yang dapat
dilakukan meliputi pengeringan dan penyimpanan yang tepat
untuk mendapatkan kadar air jagung yang aman. Syarat mutu
kadar air jagung dalam SNI 2000 adalah 5-14%.
KESIMPULAN DAN SARAN
Sebanyak 8 sampel dari 28 sampel jagung yang dianalisis
(28,60%) mengandung aflatoksin B1 melebihi standar
berdasarkan Standar Nasional Indonesia (SNI 2000).
Sebaiknya kontrol kualitas jagung dari kontaminan aflatoksin
dapat dibakukan secara rutin sebagai tindakan antisipasi
untuk menghasilkan pakan berkualitas baik, bebas dari
aflatoksin, atau mengandung aflatoksinnya maksimal 50 ppb,
sesuai acuan dalam SNI.
UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Sri Rach-

Tabel 6. Kadar aflatoksin B1 (AFB1) pada sampel jagung,
laboratorium Bbalitvet, Bogor, 2008
mawati, BSc, MSc, peneliti pada Kelti Toksikologi Balai Besar
Penelitian Veteriner, atas bantuan perangkat kit ELISA untuk
Kadar AFB1
Sampel analisis aflatoksin serta bimbingannya.
(ppb)
J1 tt
J2 2,3
J3 46,8 DAFTAR PUSTAKA
J4 0,4
J5 1,0 Direktorat Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Pertanian.
J6 48,9 2007. Teknologi pascapanen jagung untuk penanggulangan
J7 72,4 aflatoksin dalam upaya peningkatan daya saing dan pendapatan
J8 56,4 petani. Makalah disampaikan pada Aflatoksin Forum II,
J9 50,2 Yogyakarta, Juli 2009.
J10 43,9
J11 34,4 Rachmawati, S. 2004. Uji banding antarlaboratorium, pengujian
J12 0,7 ELISA kit aflatoksin. Laporan hasil kegiatan kerja sama antara
J13 tt Balai Penelitian Veteriner dengan PT Sinta Prima Feedmill, PT
J14 0,5 Sierad Tbk, Balai Pengujian Mutu Pakan Ternak, dan Balai
J15 0,8 Penyidikan dan Pengujian Veteriner Regional IV. hlm. 2-9.
J16 75,7 Rachmawati, S. 2005. Aflatoksin pada pakan di Indonesia:
J17 1,1 Persyaratan kadar dan peraturan perundang-undangannya.
J18 0,3 Wartazoa 4(1): 26-35.
J19 0,2
J20 0,9 SNI (Standard National Indonesia). 2000. Maximum Residue Limit
J21 > 60 for Microbial and Chemical Contamination in Animal Product.
J22 > 60 National Standardization Agency, Jakarta, Indonesia.
J23 2,5 Stanker, L.H. and R.C. Beier. 1995. Introduction to immunoassay
J24 0,2 for residue analysis: Concept, formats and applications in
J25 > 60 immunoassays for residue analysis. p. 12-22. In. ELISA
J26 > 60 Workshop. Simple Test for Monitoring Mycotoxins and
J27 > 60 Pestisides in Produce. Postharvest Technology Institute. Ho
J28 2,5 Chi Minh City, Vietnam, 15-17 November 1999. University of
tt = tidak terdeteksi (kadar AFB1 < limit deteksi yaitu < 0,30 ppb) Sydney.