SNI ISO 9308-1:2010

Standar Nasional Indonesia

Kualitas air – Deteksi dan penghitungan bakteri

coliform dan Escherichia coli
Bagian 1: Metode filtrasi dengan membran
(ISO 9308-1:2000, IDT)

ICS 07.100.20 Badan Standardisasi Nasional

© BSN 2010

Hak cipta dilindungi undang-undang. Dilarang menyalin atau menggandakan sebagian atau seluruh isi
dokumen ini dengan cara dan dalam bentuk apapun dan dilarang mendistribusikan dokumen ini baik secara
elektronik maupun tercetak tanpa izin tertulis dari BSN

BSN
Gd. Manggala Wanabakti
Blok IV, Lt. 3,4,7,10.
Telp. +6221-5747043
Fax. +6221-5747045
Email: dokinfo@bsn.go.id
www.bsn.go.id

Diterbitkan di Jakarta
 SNI ISO 9308-1:2010

Daftar isi

Daftar isi.....................................................................................................................................i
Prakata .....................................................................................................................................ii
Pendahuluan............................................................................................................................ iii
1 Ruang lingkup.................................................................................................................... 1
2 Acuan Normatif .................................................................................................................. 1
3 Istilah dan definisi .............................................................................................................. 2
4 Prinsip................................................................................................................................ 2
5 Peralatan dan Peralatan Gelas.......................................................................................... 3
6 Media kultur dan pereaksi.................................................................................................. 4
7 Pengambilan contoh uji ..................................................................................................... 4
8 Prosedur ............................................................................................................................ 4
9 Pelaporan hasil uji ............................................................................................................. 6
10 Laporan hasil uji............................................................................................................... 6
11 Jaminan mutu .................................................................................................................. 6
Lampiran A .............................................................................................................................. 7
Lampiran B .............................................................................................................................. 8
Bibliografi ............................................................................................................................... 12

i
SNI ISO 9308-1:2010

Prakata

SNI ISO 9308-1:2010 Kualitas air – Deteksi dan penghitungan bakteri coliform dan
Escherichia coli - Bagian 1: Metode filtrasi dengan membran ini merupakan adopsi identik
dengan metode terjemahan dari ISO 9308-1:2000 Water quality — Detection and
enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method.

SNI ISO 9308-1:2010 ini disusun oleh Panitia Teknis 65-05 Produk Perikanan dan Panitia
Teknis 13-03 Kualitas Lingkungan dan Manajemen Lingkungan, dan telah dibahas dalam
rapat konsensus lingkup panitia teknis pada hari Selasa, tanggal 27 Oktober 2009 di
Jakarta.

ISO 9308 tentang Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and
coliform bacteria ini terdiri dari :
- Part 1: Membrane filtration method.
- Part 2: Multiple tube (most probable number) method.
- Part 3:Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and
enumeration of E. coli in surface and waste water.

SNI ISO 9308-1:2010 ini telah mengalami perubahan yaitu penggantian isinya sesuai
dengan corrigendum ISO 9308-1:2000/Cor.1:2007(E), terdapat pada pasal 1. Ruang
lingkup, Subpasal 3.1, Definisi untuk bakteri laktosa positif, Subpasal 8.3 pada paragraf
keempat, dan Subpasal B.5.3. pada Lampiran B. Paragraf yang mengalami penggantian
tersebut, diberi tanda garis vertikal didepan paragraf.

SNI ini disusun sesuai dengan ketentuan yang diberikan dalam:

a). Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 03.1:2007, Adopsi Standar Internasional dan
Publikasi Internasional lainnya Bagian 1: Adopsi Standar Internasional menjadi SNI.
b). Pedoman Standardisasi Nasional (PSN) 08:2007, Penulisan SNI.

Mengingat standar ini merupakan terjemahan langsung dari naskah bahasa Inggris mungkin
masih dapat terjadi masalah dalam menginterpretasikannya. Apabila timbul interpretasi yang
berbeda, agar memperhatikan naskah asli ISO 9308-1:2000 dan corrigendum ISO 9308-
1:2000/Cor.1:2007(E) yang berbahasa Inggris.

ii
 SNI ISO 9308-1:2010

Pendahuluan

Adanya dan meluasnya pencemaran fekal merupakan faktor penting dalam menilai kualitas
air dan resikonya sebagai penyebab infeksi pada kesehatan manusia. Pemeriksaan
terhadap contoh air untuk mengetahui adanya Escherichia coli, yang merupakan flora normal
usus besar manusia dan hewan berdarah panas lainnya, memberikan indikasi ada atau
tidaknya pencemaran. Pemeriksaan bakteri coliform dapat menjadi lebih sulit untuk
ditafsirkan karena beberapa bakteri coliform hidup di tanah dan permukaan air tawar, dan
tidak selalu berasal dari saluran pencernaan. Oleh karena itu, keberadaan bakteri coliform,
meskipun tidak membuktikan terjadinya kontaminasi fekal, dapat menjadi indikasi adanya
kelalaian dalam perlakuan atau distribusi. Identifikasi terhadap strain yang diisolasi
terkadang dapat menunjukkan indikasi asalnya.

iii
 SNI ISO 9308-1:2010

Kualitas Air - Deteksi dan penghitungan bakteri coliform dan Escherichia coli
Bagian 1 : Metode filtrasi dengan membran

1 Ruang lingkup

SNI ISO 9308 bagian ini meliputi metode acuan (Pengujian Standar) untuk mendeteksi dan
menghitung bakteri coliform dan Escherichia coli pada air untuk konsumsi manusia.
Pengujian Standar ini memiliki selektivitas yang rendah, dapat mendeteksi bakteri yang sel-
selnya sudah rusak. Karena selektivitasnya yang rendah, pertumbuhan bakteri lain yang
tidak diinginkan dapat mengganggu keakuratan penghitungan bakteri coliform dan E.coli,
misalnya pada beberapa air minum, seperti air sumur dangkal atau air permukaan. Metode
ini tidak sesuai untuk jenis air ini. Pengujian Standar didasarkan pada filtrasi dengan
membran, pertumbuhan kultur pada differential agar medium dan penghitungan jumlah
organisme target dalam contoh uji.

SNI ISO 9308 bagian ini terutama sesuai untuk air dengan jumlah bakteri yang rendah. Pada
kasus-kasus tertentu yang membutuhkan informasi cepat, ISO ini menyediakan metode
cepat (Rapid Test) untuk mendeteksi E.coli pada air untuk konsumsi manusia hanya dalam
waktu 24 jam.

Pengujian cepat didasarkan pada filtrasi dengan membran, pertumbuhan kultur pada media
selektif dan penghitungan jumlah E.coli dalam contoh uji.

Pengujian Standar dan Pengujian Cepat dapat digunakan untuk jenis air yang lain asalkan
bahan tersuspensi atau flora lain tidak mengganggu filtrasi, pengkulturan dan penghitungan.

2 Acuan Normatif

Dokumen normatif berikut ini sebagai acuan normatif yang membentuk SNI ISO 9308.1 :
2010. Untuk acuan yang bertanggal, hanya edisi yang disebutkan yang berlaku. Untuk acuan
yang tidak bertanggal, edisi terakhir dari dokumen acuan (termasuk setiap amandemennya)
yang berlaku. Anggota ISO dan IEC memelihara Standar Internasional yang valid dan
terdaftar.

ISO/IEC Guide 2, Standardization and related activities – General vocabulary.

ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use – Specification and test methods.
ISO 5667-1:1980, Water quality – Sampling – Part 1: Guidance on the design of sampling
programs.
ISO 5667-2:1991, Water quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling technique.
ISO 5667-3:1994, Water quality – Sampling – Part 3: Guidance on the preservation and
handling of samples.
ISO 6887-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test
samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1:
General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions.
ISO 8199:1988, Water quality – General guide to the enumeration of micro-organisms by
culture.

1 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

3 Istilah dan definisi

Untuk penggunaan SNI ISO 9308.1:2010, istilah dan definisi tercantum dalam ISO/IEC
Guide 2 seperti berikut ini.

3.1
bakteri laktosa-positif
(Pengujian Standar) bakteri yang mampu membentuk koloni secara aerob pada suhu
(36 ± 2)°C dalam (21 ± 3) jam pada selective and differential lactose culture medium dengan
menghasilkan asam

3.2
bakteri coliform
(Pengujian Standar) bakteri positif laktosa sebagaimana didefinisikan pada 3.1 yang bersifat
oksidase-negatif

3.3
Escherichia coli
(Pengujian Standar) bakteri coliform sebagaimana didefinisikan pada 3.2 yang juga
menghasilkan indol dari tryptophan pada suhu (44,0 ± 0,5)°C dalam waktu (21 ± 3) jam

3.4
Escherichia coli
(Pengujian Cepat) bakteri yang tahan terhadap bile (bile resistant) yang juga menghasilkan
indol dari tryptophan pada suhu (44,0 ± 0,5)°C dalam waktu (21 ± 3) jam

4 Prinsip

4.1 Deskripsi metode secara umum

Metode ini didasarkan pada filtrasi dengan membran dan terdiri dari dua bagian, yaitu
Pengujian Standar sebagai metode uji acuan dan Pengujian Cepat sebagai metode uji
pilihan, yang dapat dilakukan secara bersamaan sebagaimana dijelaskan dibawah ini.
Pengujian Standar mencakup inkubasi membran dalam media selektif yang dilanjutkan
dengan karakterisasi biokimia terhadap koloni tipikal laktosa-positif , sehingga deteksi dan
penghitungan bakteri coliform dan E.coli dapat dilakukan dalam waktu 2 hari - 3 hari.
Pengujian Cepat terdiri dari dua tahap inkubasi sehingga deteksi dan penghitungan E. coli
dapat dilakukan dalam waktu (21 ± 3) jam. Jika kedua uji, Pengujian Standar dan Pengujian
Cepat, dikerjakan bersamaan, hasil akhir untuk E. coli dapat lebih tinggi untuk pengujian
yang kedua.

4.2 Penyaringan dan inkubasi

Contoh uji disaring melalui membran yang mampu menahan bakteri. Pada Pengujian
Standar, satu membran diletakkan pada media agar selektif laktosa dan diinkubasi pada
suhu (36 ± 2)°C selama (21 ± 3) jam. Pada pengujian cepat, satu membran diletakkan pada
media agar yang mengandung kasein (tryptic digest) diinkubasi pada suhu (36 ± 2)°C
selama 4 jam sampai 5 jam, dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu (44,0 ± 0,5)°C selama
19 jam sampai 20 jam pada media agar yang mengandung kasein (tryptic digest) dan
bilesalts.

2 dari 12
 SNI ISO 9308-1:2010

4.3 Evaluasi dan konfirmasi pada Pengujian Standar

Karakteristik koloni pada membran dihitung sebagai bakteri laktosa-positif. Untuk bakteri
coliform dan E.coli, subkultur dilakukan secara acak terhadap karakteristik koloni untuk uji
konfirmasi: produksi indol dan oksidase. Hitung jumlah laktosa-positif coliform dan E.coli
yang ada didalam 100 ml contoh uji.

4.4 Evaluasi dan konfirmasi pada Pengujian Cepat

Koloni pada membran yang dapat membentuk indol dari tryptophan yang terdapat dalam
media agar dihitung sebagai E.coli. Hitung jumlah E.coli yang ada didalam 100 ml contoh uji.

5 Peralatan dan Peralatan Gelas

Peralatan laboratorium mikrobiologi pada umumnya, dan yang tertentu:

5.1 Seperangkat alat untuk sterilisasi (autoclave)

Peralatan dan peralatan gelas yang tidak steril harus disterilkan terlebih dahulu sesuai
dengan petunjuk dalam ISO 8199.

5.2 Penangas air (Water bath) dan/atau inkubator, dengan suhu yang terkontrol pada (36
± 2)°C.

5.3 Penangas air dan/atau inkubator, dengan suhu yang terkontrol pada (44,0 ± 0,5)°C.

CATATAN Untuk Pengujian Cepat, sebagai pengganti inkubator pada 5.2 dan 5.3, dapat
menggunakan inkubator yang dapat diprogram dengan pengaturan dua suhu pada (36 ± 2)°C dan
(44,0 ± 0,5)°C.

5.4 pH meter, dengan ketelitian ± 0,1.

5.5 Peralatan untuk filtrasi membran, sesuai dengan ISO 8199.

5.6 Filter membran, terbuat dari cellulose esters, biasanya berdiameter sekitar 47 mm
atau 50 mm, dengan karakteristik penyaringan sama dengan pori berdiameter 0,45 μm dan
lebih disukai dengan garis-garis.
Filter harus bebas dari bahan yang menghambat pertumbuhan atau pemacu pertumbuhan
dan tinta cetak yang dipergunakan untuk garis-garis harus tidak mempengaruhi terhadap
pertumbuhan bakteri. Jika tidak tersedia filter steril, filter tersebut harus disterilkan terlebih
dahulu sesuai dengan petunjuk manufaktur. Setiap batch membran sebaiknya diuji sesuai
dengan ISO 7704 untuk kesesuaiannya dalam pengujian, terutama sejak penggunaan merk
filter yang berbeda dapat menghasilkan pembentukan warna yang berbeda pula.

CATATAN Filter membran berwarna hijau dapat membantu deteksi pembentukan warna yang lebih
baik pada saat menggunakan Pengujian Cepat.

5.7 Forceps dengan ujung bulat untuk memegang membran.

5.8 Lampu Ultraviolet, dengan panjang gelombang 254 nm (lampu merkuri tekanan
rendah).

3 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

PERINGATAN Lampu UV dapat menyebabkan iritasi pada kulit dan mata. Gunakan kacamata
pelindung UV dan sarung tangan.

5.9 Bantalan filter, dengan diameter sekurang-kurangnya 47 mm

6 Media kultur dan pereaksi

Untuk persiapan media kultur dan pereaksi, gunakan bahan-bahan dengan kualitas yang
seragam dan bahan kimia dengan kualitas analitis (lihat catatan); ikuti petunjuk pada
Lampiran B. Sebagai alternatif, gunakan media dan pereaksi komersial yang komposisinya
sesuai dengan yang ada pada Lampiran B dan ikuti sepenuhnya petunjuk manufaktur.

CATATAN Penggunaan bahan kimia dengan kualitas yang lain dimungkinkan asalkan menunjukkan
kemampuan yang sama dalam pengujian.

Untuk persiapan media kultur, gunakan alat gelas untuk air destilasi atau air deionisasi yang
bebas dari bahan yang dapat mengganggu pertumbuhan bakteri pada saat pengujian, dan
sesuai dengan ISO 3696.

Apabila tidak ada ketentuan khusus, media yang sudah dibuat dapat disimpan sekurang-
kurangnya satu bulan jika disimpan di tempat gelap pada suhu (5 ± 3)°C dan terlindung dari
proses penguapan.

7 Pengambilan contoh uji

Lakukan pengambilan contoh uji dan pengiriman contoh uji ke laboratorium sesuai dengan
ISO 5667-1:1980, ISO 5667-2 :1991 dan ISO 5667-3 :1994.

8 Prosedur

8.1 Persiapan contoh uji

Untuk persiapan contoh uji, saring dan inokulasikan pada media isolasi, sesuai dengan
petunjuk dalam ISO 8199:1988 dan ISO 6887-1:1999. Lakukan pengujian secepatnya
setelah pengambilan contoh uji. Jika contoh uji disimpan pada suhu ruang (dalam keadaan
gelap, tidak melampaui 25°C), pengujian harus dilakukan dalam waktu 6 jam setelah
pengambilan contoh uji. Pada kondisi tertentu, contoh uji dapat disimpan pada suhu
(5 ± 3)°C hingga 24 jam sebelum pengujian.

8.2 Filtrasi

Saring 100 ml (atau volumenya lebih besar, misalnya 250 ml untuk air dalam kemasan)
contoh yang akan diuji dengan menggunakan membran filter (5.6). Letakkan filter pada
masing-masing media agar (8.3 dan 8.4), pastikan bahwa tidak ada udara yang terjebak
dibawahnya.

8.3 Inkubasi dan pembedaan pada Pengujian Standar

Setelah filtrasi (8.2) letakkan membran dalam cawan agar Laktosa TTC (8.1) dan inkubasi
pada suhu (36 ± 2)°C selama (21 ± 3) jam.

4 dari 12
 SNI ISO 9308-1:2010

CATATAN 1 Perpanjangan waktu inkubasi sampai (44 ± 4) jam dapat menghasilkan sensitifitas
yang tinggi pada hasil uji, terutama pada cawan yang tidak menunjukkan koloni tipikal setelah
inkubasi (21 ± 3) jam.

CATATAN 2 Penggunaan membran filter tambahan untuk inkubasi pada suhu 44°C dapat
mengatasi pertumbuhan bakteri lain yang tidak diinginkan.

Periksa membran dan hitung semua koloni karakteristik yang menunjukkan pertumbuhan
berwarna kuning pada media di bawah membran, tanpa melihat ukuran, sebagai bakteri
laktosa-positif. Untuk uji oksidase dan indol, subkultur semua koloni karakteristik lebih
disukai atau jumlah yang mewakili (sekurang-kurangnya 10 koloni) masing-masing ke dalam
media agar nonselektif (B.3) dan dalam tryptophan broth (B.2).

Inkubasi media agar nonselektif pada suhu (36 ± 2)°C selama (21 ± 2) jam dan lakukan uji
oksidase sebagai berikut.

- Teteskan dua sampai tiga tetes pereaksi oksidasi yang baru dibuat (B.5.3) pada
kertas saring.
- Usapkan koloni pada kertas filter dengan menggunakan batang gelas, batang kayu
applicator (wooden applicator stick), jarum inokulasi plastik atau platina (bukan
nikrom).
- Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna menjadi biru tua sampai keunguan
dalam waktu 30 detik.

Inkubasi tabung tryptophan broth (B.2) pada suhu (44,0 ± 0,5)°C selama (21 ± 3) jam dan
periksa ada tidaknya indol yang dihasilkan dengan menambahkan 0,2 ml sampai 0,3 ml
pereaksi Kovacs (B.5.1). Terbentuknya warna merah cherry pada permukaan broth
menunjukkan adanya indol.

Hitung semua koloni yang memberikan reaksi negatif pada uji oksidase sebagai bakteri
coliform.

Hitung semua koloni yang memberikan reaksi oksidase negatif dan indol positif sebagai
E.coli.

CATATAN 3 Pada kasus tertentu, identifikasi bakteri coliform, mungkin diperlukan misalnya untuk
membedakan antara strain fekal dan akuatik/telluric.

8.4 Inkubasi dan pembedaan pada Pengujian Cepat

Setelah filtrasi (8.2) letakkan membran pada media TSA (B.3) dan inkubasi pada suhu
(36 ± 2)°C selama 4 jam sampai 5 jam. Selanjutnya, letakkan membran pada media TBA
(B.4) dan inkubasi pada suhu (44,0 ± 0,5)°C selama 19 jam sampai 20 jam.

Jika diinginkan, kedua media agar dapat digabung ke dalam satu cawan sehingga dihasilkan
agar dua lapis (lihat catatan B.4). Pada kasus tersebut, letakkan membran pada cawan agar
dua lapis yang baru dibuat, terdiri dari TSA (B.3) dan TBA (B.4) dan inkubasi pada suhu
(36 ± 2)°C selama 4 jam sampai 5 jam dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu (44,0 ± 0,5)°C
selama 19 jam sampai 20 jam.

Setelah inkubasi, letakkan membran pada bantalan filter (5.9) yang jenuh dengan pereaksi
indol (B.5.2) dan sinari dengan lampu ultraviolet (5.8) selama 10 menit sampai 30 menit

5 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

tergantung pada pembentukan warna (lihat Catatan 1). Semua koloni merah pada membran
filter dihitung sebagai E.coli.

CATATAN 1 Pereaksi komersial berbentuk cair dapat memberikan hasil yang lebih cepat dan lebih
jelas tanpa perlu disinari dengan lampu ultraviolet.

CATATAN 2 Penyebaran koloni yang tidak merata atau adanya pertumbuhan yang padat dari
bakteri yang tidak diinginkan dapat mengganggu penghitungan dalam membedakan koloni positif indol
karena terjadinya difusi warna pada koloni yang berdekatan.

9 Pelaporan hasil uji

Dari jumlah koloni karakteristik yang dihitung pada membran (8.3) dan hasil uji konfirmasi
yang dilakukan, hitung jumlah E.coli, bakteri coliform, dan jika dibutuhkan, bakteri laktosa-
positif yang terdapat dalam 100 ml contoh uji sesuai dengan ISO 8199:1988. Pada kasus
dua pengujian (Pengujian Standar dan Pengujian Cepat) digunakan secara bersamaan
untuk E.coli, hasil akhir menjadi lebih tinggi untuk Pengujian Cepat.

10 Laporan hasil uji

Laporan hasil uji sekurang-kurangnya berisi informasi sebagaimana berikut.

a) pustaka yang diacu adalah ISO 9308;
b) keterangan lengkap yang diperlukan untuk identifikasi contoh uji;
c) pernyataan hasil sesuai dengan ketentuan 9 diatas;
d) kejadian khusus yang diamati selama jalannya analisa dan kegiatan spesifik yang
tidak tertulis dalam metode yang dapat mempengaruhi hasil pengujian.

11 Jaminan mutu

Gunakan laboratorium yang mempunyai sistem pengawasan mutu yang jelas untuk
menjamin bahwa bahan, pereaksi dan teknik yang digunakan sesuai untuk pengujian.

6 dari 12
 SNI ISO 9308-1:2010

Lampiran A
(informatif)
Informasi mikrobiologi lebih lanjut untuk bakteri coliform

Coliform merupakan bakteri Gram negatif, tidak membentuk spora, oksidase negatif,
berbentuk batang, yang dapat tumbuh pada lingkungan aerob mapun fakultatif anaerob
dengan adanya bile-salts [atau bahan permukaan aktif (surface-active agents) lain dengan
sifat penghambat pertumbuhan yang mirip], dan yang dalam keadaan normal dapat
memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam dan aldehida dalam 48 jam saat
diinkubasikan pada suhu (36 ± 2)°C. Bakteri ini juga memiliki enzim β-galaktosidase.

E. coli merupakan bakteri coliform yang dapat memproduksi indol dari tryptophan dalam
waktu (21 ± 3) jam pada suhu (44,0 ± 0,5)°C. Bakteri ini juga memiliki enzim
β-glucuronidase, memberikan hasil positif dalam tes methyl red dan dapat
mendekarboksilasi asam L-glutamat tetapi tidak dapat menghasilkan acetyl methyl carbinol,
memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya atau tumbuh dalam KCN broth.

7 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

Lampiran B
(normatif)

Media kultur dan pereaksi

B.1 Agar Laktosa TTC dengan natrium heptadesilsulfat

B.1.1 Media Basal

Laktosa 20 g
Pepton 10 g
Yeast extract 6 g
Meat extract 5 g
Bromothymol blue 0,05 g
Agar (dalam bentuk bubuk atau serpihan) 15 g sampai 25 g 1)
Akuades 1000 ml

Larutkan bahan-bahan dalam akuades dengan pemanasan. Jika diperlukan, atur pH

sehingga setelah sterilisasi mempunyai nilai pH (7,2 ± 0,1) pada suhu 25°C. Masukkan
media ke dalam botol, dengan volume maksimum 250 ml, dan sterilisasi dalam autoclave
pada suhu (121 ± 3)°C selama 15 menit.

B.1.2 Larutan triphenyltetrazolium chloride (TTC)

2,3,5-Trifeniltetrazolium klorida 0,05 g

Akuades 100 ml
Larutkan TTC dalam air dan tambahkan hingga 100 ml. Sterilisasi dengan filtrasi melalui
membran dengan ukuran pori 0,2 μm.

B.1.3 Larutan natrium heptadesilsulfat

Natrium heptadesilsulfat (Tergitol 2) 7) 0,2 g

Akuades 100 ml

Larutkan natrium heptadesilsulfat dalam akuades dan tambahkan hingga 100 mL. Sterilisasi
dalam autoclave pada suhu (121 ± 3)°C selama 15 menit.

B.1.4 Media lengkap

Media basal (B.1.1) 100 ml

Larutan TTC (B.1.2) 5 ml
Larutan natrium heptadesilsulfat (B.1.3) 5 ml

8 dari 12
 SNI ISO 9308-1:2010

Cairkan media basal dan dinginkan sampai suhu (50 ± 5)°C. Tambahkan TTC dan larutan
natrium heptadesilsulfat secara aseptis, campurkan sepenuhnya tetapi hindarkan
pembentukan gelembung setelah masing-masing penambahan. Tuangkan dalam cawan
petri dengan ketebalan minimal 5 mm. Jika tidak segera digunakan, simpan pada suhu
(5 ± 3)°C dalam ruangan gelap tidak lebih dari 10 hari.

CATATAN 1) Tergantung pada kemampuan agar dalam membentuk gel

2) Tergitol adalah contoh produk komersial yang sesuai. Informasi ini diberikan supaya
pengguna SNI ISO 9308.1 :2010 dapat menggunakan media ini tanpa memerlukan
persetujuan dari ISO.

B.2 Tryptophan broth

Tryptic digest of casein 10 g

L-Tryptophan 1 g
Natrium klorida 5 g
Akuades sampai 1000 ml

Larutkan bahan-bahan dalam akuades dengan pemanasan. Tuang 3 ml pada masing-

masing tabung reaksi. Tutup tabung dengan sumbat kapas, tutup plastik atau metal.
Sterilkan dengan autoclave selama 15 menit pada suhu (121 ± 3)°C. pH untuk media yang
siap digunakan harus (7,5 ± 1) pada suhu 25°C.

CATATAN Tetapkan bahwa ada cukup tryptophan dalam tryptic digest of casein yang digunakan,
tidak ada L-tryptophan yang harus ditambahkan. Namun demikian, tambahkan 10 g ekstra tryptic
digest of casein.

B.3 Tryptone Soy Agar (TSA)

Tryptic digest of casein 15 g

Soy peptone 5 g
Natrium klorida 5 g
Agar (dalam bentuk bubuk atau serpihan) 15 g sampai 25 g 1)
Akuades sampai 1000 ml

Larutkan bahan-bahan dalam akuades dengan pemanasan. Atur pH sehingga setelah

sterilisasi mempunyai nilai pH (7,2 ± 0.1) pada suhu 25°C. Masukkan media ke dalam botol
atau tabung dengan volume maksimum 250 ml dan sterilisasi selama 15 menit pada suhu
(121 ± 3)°C. Biarkan media hingga dingin, yaitu sampai suhu (50 ± 5)°C dan tuang dalam
cawan petri dengan ketebalan minimal 5 mm.

CATATAN Untuk uji oksidase, semua agar non selektif (sebagai pengganti TSA) yang tidak
mengganggu uji oksidase (dengan kandungan yang rendah pada fermentible carbohydrates) dapat
digunakan.

9 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

B.4 Tryptone Bile Agar (TBA)

Tryptone 20 g
Bile salts 1,5 g
Agar (dalam bentuk bubuk atau serpihan 15 g sampai 25 g 1)
Akuades sampai 1000 ml

Larutkan bahan-bahan dalam akuades dengan mendidihkan. Atur pH sehingga setelah

sterilisasi mempunyai nilai pH (7,2 ± 0,1) pada suhu 25°C. Masukkan media ke dalam botol
atau tabung dengan volume maksimum 250 ml dan sterilisasi selama 15 menit pada suhu
(121 ± 3)°C. Biarkan media hingga dingin, yaitu sampai suhu (50 ± 5)°C dan tuang dalam
cawan petri dengan ketebalan minimal 5 mm.

Siapkan cawan agar dua lapis dengan menuangkan TSA panas, bersuhu (50 ± 5)°C (B.3)
diatas cawan TBA (B.4) dan biarkan pada suhu ruang.

Ambil TSA, yang mempunyai ketebalan lapisan sekitar 1mm (misalnya 2,5 ml dalam cawan
petri berdiameter 55 mm). Biarkan memadat dan kering jika perlu balikkan cawan petri
tersebut dalam inkubator pada suhu (36 ± 2)°C.

Cawan agar dua lapis sebaiknya dibuat dalam keadaan segar untuk setiap analisis (30 menit
sampai 60 menit sebelum meletakkan membran dalam cawan agar).

B.5 Pereaksi

B.5.1 Pereaksi kovacs untuk uji indol pada Pengujian Standar

p-Dimetilaminobenzaldehida 5g
Amil atau butil alkohol (bebas dari basa organik) 75 ml
Asam klorida (ρ=1,18 g/ml) 25 ml

Larutkan aldehida dalam alkohol. Tambahkan dengan hati-hati asam pekat. Hindarkan dari
cahaya dan simpan pada suhu (5 ± 3)°C.

CATATAN Pereaksi harus berwarna kuning muda sampai coklat muda; beberapa amil alkohol tidak
memuaskan, dengan aldehida memberikan warna gelap.

PERINGATAN Lakukan preparasi di lemari asam (exhaust protection cabinet). Gunakan sarung
tangan pelindung dan cegah kontak kulit dengan p-Dimetilaminobenzaldehida. Amil alkohol dapat
mengiritasi membran mukosa dan menyebabkan pusing.

B.5.2 Pereaksi indol pada Pengujian Cepat

p-Dimetilaminobenzaldehida 0,5 g
asam klorida, c(HCL) = 1 mol/l 100 ml

Larutkan p-Dimethylaminobenzaldehida dalam asam klorida (Lihat peringatan pada B.5.1).

10 dari 12
 SNI ISO 9308-1:2010

Simpan pereaksi ini dalam botol tidak tembus cahaya pada suhu (5 ± 3)°C. Pereaksi ini
harus berwarna kuning muda dan tidak boleh digunakan jika warna berubah menjadi kuning
kecoklatan.

B.5.3 Pereaksi Oksidase

Tetramethyl-ρ-phenylenediamine dihydrochloride 0,1 g

Akuades 10 ml

Pereaksi ini tidak stabil. Pereaksi ini harus dibuat dalam keadaan segar setiap kali
dibutuhkan.

PERINGATAN - Tetramethyl-ρ-phenylenediamine dihydrochloride bersifat karsinogen. Lakukan

preparasi di lemari asam. Gunakan sarung tangan pelindung dan cegah kontak dengan kulit.

11 dari 12
SNI ISO 9308-1:2010

Bibliografi

Barrel, R.A.E. (1992). A Comparison Between Tryptone Bile Agar and Membrane Lauryl
Sulphate Broth for the Enumeration of Presumptive Escherichia coli in Water. Water Res. 26:
677-681.

Havelaar, A.H. and During, M. (1988). Evaluation of the Anderson Baaird-Parker Direst
Plating Method for Enumeration Escherichia coli in Water. J.Appl.Bacteriol. 64: 89-98.

Schets, F.M. and Havelaar, A.H. (1991). Comparison of Indole Production and β-
Glucuronidase Activity for the Detection of Escherichia coli in Membrane Filtration Method.
Lett. Appl. Microbiol. 13:272-274.

Schets, F.M., Medema, G.J. and Havelaar, A.H. (1993). Comparison of Colilert with Dutch
Standard Enumeration for Escherichia coli and Total Coliforms in Water. Lett. Appl. Microbiol.
17:17-19.

12 dari 12
 BADAN STANDARDISASI NASIONAL - BSN
Gedung Manggala Wanabakti Blok IV Lt. 3-4
Jl. Jend. Gatot Subroto, Senayan Jakarta 10270
Telp: 021- 574 7043; Faks: 021- 5747045; e-mail : bsn@bsn.go.id