Manualdebioquimicaexperimental 12313

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010 0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO
Sección 1 Introducción al laboratorio de Bioquímica
Parte I: Reporte científico Objetivos
Parte II: Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curva − Conocer la importancia de realizar un reporte científico.
estándar de proteínas − Conocer las características o partes de un reporte científico: Introducción, hipótesis, objetivo,
métodos, resultados, discusión y conclusiones, y referencias.
− Conocer cómo se formulan las hipótesis.
− Plantear hipótesis.
Sección 2 Estructura y propiedades de proteínas: Purificación de la enzima lactato
− Aprender a realizar un reporte científico.
deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino
Parte I. Extracción y precipitación por salado. Introducción
Parte II. Purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son
Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de expresados de manera clara y fácil de seguir, difícilmente serán tomados en cuenta. Es de gran valor,
concentración de proteínas. tanto para empresas como pare instituciones educativas y de investigación, contar con personal que
Monitoreo del proceso de purificación. B. Separación por pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral.
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
En el desarrollo de las ciencias, la comunicación de las observaciones, resultados y propuestas, es
fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte
Sección 3 Actividad enzimática científico. En el reporte científico, no sólo se informa sobre los resultados de una investigación, sino
Parte I. Curvas temporales de actividad enzimática de la lactado también recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnológicos
deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. que pueden ayudar a replantear la dirección de una investigación o llevar a la resolución de un
Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la problema en particular.
concentración de sustrato y de un inhibidor.
De hecho, uno de los pasos comunes dentro del llamado método científico es la de dar respuesta a
las preguntas surgidas de la observación, a través de primero investigar la literatura cercana al tema
Sección 4 Genética de estudio (Figura 1.1.). Así como en el reporte, en todos los pasos que conforman al método
Determinación del tipo de herencia en base a frecuencias fenotípicas y científico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lógica. Por ejemplo, en el
genotípicas planteamiento de la hipótesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto,
Sección 5 Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos estableciendo en una frase corta las variables que se están manipulando o las mediciones que se
Transferencia de material genético I. Conjugación harán, siempre en términos mensurables. Adicionalmente, la hipótesis incluye aquella información
Transferencia de material genético II: Transformación que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigación. Para ayudarnos a construir la
Aislamiento de plásmidos hipótesis generalmente se utilizan las preposiciones “si” y “entonces”. Examinemos el siguiente
ejemplo:
Ensayos de restricción de plásmido
Inducción de proteína recombinante Si observamos que nuestra garganta nos duele, nos planteamos:
“Si tengo dolor de garganta entonces podría deberse a que tengo una infección en la
Sección 6 Regulación del metabolismo garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el día anterior”.
Parte I: Regulación genética en el operón lac
Parte II. Regulación hormonal del metabolismo de la glucosa Sin embargo, la anterior hipótesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al
replantearla podemos decir:
“Si sé que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que
Apéndice Preparación de soluciones estuviera contagiado, y además fui a un juego de fútbol en donde grite mucho,
entonces es probable que esto último me causará el dolor de garganta”.
A pesar de que mejoró, la hipótesis no establece como se validará o no la predicción. Se podría
plantear otra diciendo:
“Si no tengo fiebre o síntomas de una infección en la garganta, pero sí una
inflamación en la garganta, entonces el cultivo de exudado faríngeo y otros estudios
clínicos darán negativo para una infección bacteriana o viral, por lo que la
inflamación se deberá a un uso excesivo de las cuerdas vocales.
1 2
La hipótesis es una parte importante en una investigación y como se mostró, debe ser Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido,
cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se está investigando, el conocimiento introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones o
previo y el diseño del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hipótesis con los resultados sé perspectivas y referencias. La inclusión de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la
llegan a conclusiones válidas, que permiten replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado. industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuación
se da una breve descripción de cada una de las secciones que conforman un reporte científico.
Resumen. Su función es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el
lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes más relevantes, una
frase sobre el objetivo del experimento, una descripción corta del método que se usó, los principales
resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe
como un solo párrafo de 100 a 200 palabras.
Introducción. Contiene la información necesaria para que el lector conozca por qué es importante el
reporte, así como de que trata. La información que se utiliza en la introducción va de lo general a lo
específico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender
los conceptos y la importancia del tópico de la investigación en un área particular de estudio.
Después, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores
(literatura específica) para ayudar a justificar la presente investigación.
La introducción finaliza con un párrafo en el que se plantea la hipótesis.
En algunos casos se requiere que la parte final de la introducción contenga los objetivos del estudio.
Métodos. El propósito de está sección es describir precisamente los materiales y métodos usados
para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda
repetir el mismo procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qué se usó un método en
particular. La sección de métodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo.
Resultados. En esta sección se describe pero no se explican los resultados; solo presenta los
hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algún resultado que es
particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La sección de
resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como
diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas puede ser muy útil para mostrar o enfatizar la
información en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera
ordenada, son una herramienta útil para ayudar a los lectores a entender datos complejos o
numerosos. Es esencial que las figuras estén integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que
sean referidas inmediatamente después de mencionarlas y deben explicarse. Un error común es
Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método científico. Se observa que las flechas van mencionar la figura, colocarla y sólo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es
hacia delante pero también pueden en cualquiera de los puntos regresar. El método científico es un decirle al lector en qué dato debe poner atención en la figura, aquello que es significativo y que podría
proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del
analizados. siguiente experimento.
Discusión. La sección de discusión tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio
Reporte científico y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o causal. Para ello
Como se comentó con anterioridad, el principal propósito de escribir un reporte científico es el de se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en
comunicar la información que ha sido compilada como resultado de la investigación o la hipótesis han sido contestadas; c) mostrar cómo los resultados de la investigación se relacionan
experimentación y el análisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tópicos pero con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de
usualmente se enfocan en transmitir la información con un propósito claro y para una audiencia los resultados, esto es, si los resultados son estadísticamente significativos, o si existió algún defecto
específica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe también en el diseño o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o
estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector determinar si se abrieron nuevas áreas de interés.
mantenga la atención en él. Generalmente, el valor de una investigación se evalúa a través del
reporte, es decir el reporte escrito es el único producto tangible de cientos de horas de trabajo. Conclusiones. Está sección puede ser incluida como parte de la discusión o bien como una sección
Debido a que se juzga el trabajo a través de un reporte escrito, éste debe ser de gran calidad. aparte. Establece de manera clara y concisa cuál es la relevancia del trabajo y sus implicaciones.
3 4
Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo
del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabético, o numeradas de
acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la información PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y
bibliográfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros
los formatos que se utilizan. ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA
Objetivos
Actividades sugeridas
1. El profesor proporcionará al menos un artículo de investigación, para que identifiquen en éste
las partes de un reporte. Después cada equipo expondrá sus resultados. − Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína.
2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hipótesis y − Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros.
diseñen un experimento. Se podrán realizar al menos dos formas diferentes de reporte: La − Construir curvas de calibración y comprender su importancia.
primera podría ser un reporte oral al final de esta sesión y la segunda un reporte escrito para − Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar.
la siguiente sesión. − Comparar el intervalo de sensibilidad de dos métodos para determinar proteínas
Cuestionario Introducción
1. ¿Qué finalidad persigue el científico al escribir y publicar un artículo científico? El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo
2. Investiga como se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye ¿cuáles son las de moléculas biológicas. Parte de la identificación de una molécula se determina por el trazado del
variables independientes, las dependientes y las control? espectro de absorción (A en función de la longitud de onda λ) en la región visible y ultravioleta.
3. ¿Qué estructura debe tener una hipótesis? Mientras que la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia
4. ¿Cuáles son las secciones de un reporte científico? absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación del compuesto mediante una
5. ¿Qué diferencia (s) hay entre la sección de resultados y la discusión? reacción química).
6. ¿Qué información bibliográfica deben de contener las referencias, si son libros, artículos o
catálogos o páginas de internet? Leyes que rigen la espectrofotometría
Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe,
Referencias por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P0. La relación entre
• Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: ambos se denomina transmitancia, T:
Oryx Press, 1994.
• Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)
Longman,2000.
La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber
energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta.
Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la
disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de
radiación ∆P, que es proporcional a ∆N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la
concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante,
podemos llegar a la ecuación general:
-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)

donde:
c es la concentración
b es la longitud de la celda o paso óptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad
La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende

de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud
de onda. Definiendo que la relación -log P / P0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que
define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:
Aλ= aλbc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)
Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por

ello se le coloca el superíndice λ así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se
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expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de 1 caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta.
absortividad molar o coeficiente de extinción (ε). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, 1 Micropipeta 10 µL
por lo que entonces las unidades de ε son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya 1 Micropipeta 20-200 µL
que por definición es un índice. 1 Micropipeta 200-1000 µL
Vórtex
Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una Espectrofotómetro (por grupo)
función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea
recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es εb. Conociendo ε y la longitud del paso de la luz b, Reactivos
la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de − Albúmina de suero bovino o BSA.
Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción. − Solución problema de proteínas (los profesores la proporcionarán)
− Disolución de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composición en apéndice.
Determinación de proteínas − 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS)
Dos aplicaciones comunes de la determinación de proteínas son: 1) para reportar la actividad − 0.8 N NaOH
específica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogéneo de proteína en geles de − H2O
poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios métodos para medir proteínas totales, ¿Cómo se escoge
− Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10%
entre estos métodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el
SDS, 0.8 N NaOH y H2O.
cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en los resultados, mientras
− Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volúmenes de
que para colocar cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisión es más
H2O. Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse.
importante.
Desarrollo experimental
Cuantificación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm.
El uso de la absorbancia en la región ultravioleta para medir la concentración de proteína es Determinación de proteínas por absorbancia a 280 ηm
posiblemente el método más simple y rápido, aunque puede producir resultados poco exactos. La 1. Rotular los tubos de microfuga.
cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm, depende de la presencia de 2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la Tabla 1.1 y completar con
aminoácidos aromáticos: tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). La medida a 260 nm depende de la agua.
presencia de fenilalanina (Phe) ya que es en esta longitud de onda donde presenta su absorbancia 3. Colocar los volúmenes indicados de la muestra problema y H2O.
máxima. Un alto orden de estructuración puede modificar la contribución de las Tyr y Trp en la 4. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de la determinación y
absorbitividad molar del péptido o proteína y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios seleccionar la λ de 280 ηm.
en el pH y fuerza iónica del medio. 5. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones.
6. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua.
En la práctica determinaremos la concentración de una muestra problema utilizando, además de la 7. Realizar las lecturas y llenar la tabla con los datos de absorbancia.
ecuación de la Ley de Lambert y Beer, una curva patrón de absorbancia a 280 nm, esto último sólo 8. Calcular la concentración de proteína de la curva estándar de acuerdo al volumen añadido de
con fines didácticos, ya que de manera rutinaria, la concentración de proteínas utilizando el método la solución estándar.
de absorbancia a 280 nm se obtiene solamente empleando la ecuación de Lambert y Beer y el 9. Construir la gráfica con los datos obtenidos.
coeficiente de extinción molar. 10. Calcular la concentración de proteínas de la muestra con los datos de la regresión de la curva.
Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico. El ensayo de determinación de Tabla 1.1. Volúmenes y cantidades del estándar de BSA para determinar la concentración de proteínas de una muestra
proteínas por Lowry es uno de los más usados en Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en utilizando la absorbancia a 280 nm.
disolución básica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación Tubo H2O BSA Muestra Proteína**
entre los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el reactivo de Folin- A280ηm
(1mg/mL) problema* (µg)
Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color
0 500 µL ⎯ -
desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los
electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que 1 485 µL 15 µL -
se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de 2 470 µL 30 µL -
tirosina y triptófano de la proteína. 3 455 µL 45 µL -
4 440 µL 60 µL -
Material y equipo 5 425 µL 75 µL -
Celdas de plástico para espectrofotómetro 6 410 µL 90 µL -
Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro
Tubos de microfuga
7 395 µL 105 µL -
1 gradilla para tubos de microfuga 8 475 ⎯ 25 µL
1 caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 9 450 ⎯ 50 µL
* La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores.
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** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los µL que se añadieron del estándar de BSA. 5. Grafica ambas curvas patrón en una sola gráfica y compara la cantidad de proteína que se
Y en el caso de la muestra problema de acuerdo a la fórmula y/o a los datos de la regresión de la curva estándar. necesita para tener una absorbancia de 0.15 en ambos métodos. ¿Qué te dicen ambos
valores respecto a la sesibilidad de cada uno de los métodos? Compara tus datos con los de
11. Calcular la concentración de proteínas de la muestra usa la ecuación de Lambert y Beer y el tus compañeros y analiza ¿Qué tan reproducibles son los datos?
coeficiente de extinción molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o 6. ¿Se obtiene una línea recta después de graficar absorbancia vs µg proteína?
bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solución de BSA al 1% 7. De acuerdo a tus resultados, ¿cuál es el intervalo en el que se podría determinar la
(10 mg/mL) y usando la fórmula 4 para determinar la concentración de la muestra. concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación
de proteínas por Lowry? Da una explicación.
⎛ Absλ 280nm ⎞ 8. ¿Cuáles son las aplicaciones en general de una curva de calibración o estándar?
Concentración L ( µg / µL) = ⎜⎜ ⎟⎟ *10 (4)
⎝ ε (%) ⎠
12. Comparar los resultados obtenidos al haber realizado el punto 10 y el punto 11. Referencias
• Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring
Determinación de proteínas por el método de Lowry. Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la Tabla 1.2. • Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Recuerda: debes mezclar con el vórtex después de añadir cada una de las disoluciones. • Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more
2. Encender el espectrofotómetro, seleccionar la λ de 750 nm. generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356.
3. Utilizar las celdas de plástico para realizar las mediciones. • + Wang, Y., et al. Julio 2007. Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx
4. Ajustar el espectrofotómetro con la disolución del primer tubo de la tabla (sin BSA). degradation for P53 activation. PNAS, (104). 30, 12365-12370.
5. Realizar las lecturas.
6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia.
7. Construir la gráficas de absorbancia vs concentración de proteína (µg). Notas y Cálculos.
8. Calcular la concentración de la proteína en la muestra
Tabla 1.2. Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA y la determinación de la concentración de
proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry para su determinación.
Tubo H2O BSA Muestra Reactivo A Reactivo B A750ηm Proteína*
(1mg/mL) Problema* (µg)
ambiente por 30 minutos
450 µL ⎯ ⎯ 500 µL 250 µL

Incubar a temperatura
1
2 445 µL 5 µL ⎯ 500 µL 250 µL
3 440 µL 10 µL ⎯ 500 µL 250 µL
4 435 µL 15 µL ⎯ 500 µL 250 µL
5 430 µL 20 µL ⎯ 500 µL 250 µL
6 425 µL 25 µL ⎯ 500 µL 250 µL
7 420 µL 30 µL ⎯ 500 µL 250 µL
8 415 µL 35 µL ⎯ 500 µL 250 µL
9 425 µL ⎯ 25 µL 500 µL 250 µL
10 400 µL ⎯ 50 µL 500 µL 250 µL
* La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores.
** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los µL que se añadieron del estándar de BSA.
Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresión de la curva estándar generada.
Cuestionario
1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la

absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer).
2. De acuerdo al fundamento de los dos métodos de cuantificación de proteínas aplicados en
está práctica ¿cuáles son las principales diferencias entre ambos métodos? Considera los
costos, facilidad, sensibilidad, el material utilizado
3.
4. ¿Qué sustancias pueden interferir con cada una de las determinaciones?
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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS. diferente peso molecular. Una purificación posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por
la adición de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán
los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína.
Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo
esquelético de bovino. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar
una proteína.
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína,
microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas1, entre otras. La elección de la
Objetivos procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades
- Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico, masa suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido
molecular y afinidad. o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su
- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular,
celulares. aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos,
- Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida.
utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado,
cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su
afinidad. clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son
- Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y
purificación de una proteína. estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son
diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El
Introducción método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material
Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la
generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesta la proteína y en el
Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un método para purificar una proteína, que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solución, la fuerza iónica, inhibidores
como por ejemplo, para que se usara la proteína, cuales son las características propias de la proteína de proteasas o algún estabilizador de la proteína.
(tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el
costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas, no obstante, si Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso
hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una de centrifugación. La centrifugación aprovecha las propiedades de tamaño, forma y densidad de las
proteína toma en consideración lo siguiente: proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado,
el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos
A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria.
requeridos. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución
B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación:
tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.
C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o
contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la
separación de la proteína mediante electroforesis. distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo.
D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre
el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento. La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad)
E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o
proteasas. sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado
F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes
amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede
aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario. centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan
G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en
fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. solución y las moléculas ligeras sedimentan.
H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay
que combinar los pasos de manera lógica. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que
pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para
Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden
incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en 1
Células que fueron obtenidas a través de la introducción de un gene que codifica para una proteína distinta a la suya, a través del uso de técnicas de
gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de biología molecular. Ver sección 5 del manual.
11 12
eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la proteína de interés se utilizan
modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína soluciones que modifican el pH o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación
pueden interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en de las proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las
solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas tales como cambio de pH, proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración.
incremento en la temperatura, adición de solventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más
comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4.
Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de iones, fenómeno

denominado de “salting in”. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, disminuye la
solubilidad de las proteínas y precipitan (“salting out”). El mecanismo de salting-out se basa en la
exclusión del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de
agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la
concentración de los iones, la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen
con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de
la proteína y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas,
produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy
económico, se han diseñado tablas y fórmulas en las que se pueden determinar las cantidades a Figura 2.1. Separación por cromatografía de intercambio iónico. Dependiendo de la carga iónica de los soportes o resinas
añadir de (NH4)2SO4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración de cromatografía entonces ocurrirá la interacción con moléculas cargadas positiva o negativamente.
dada.
Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando
Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la
para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el
ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular. NAD+ o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.2). Cuando la muestra
atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale
La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y
una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa elimina a muchos contaminantes.
de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra.
La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirá reducir la
concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que A B
originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis: el costo de la membrana de
diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h.
Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con
Sefadex-G25® puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La
muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz,
mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elución, las
proteínas de alto peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero,
después eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala,
concentra, cambia de amortiguador y pierde proteínas o moléculas contaminantes. Figura 2.2. Comparación entre las moléculas de Cibacrón blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el
Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por
TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para
Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD+.
cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A
continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio. En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la
primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante
La cromatografía de intercambio iónico es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación
características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con con (NH4)2SO4. En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra mediante filtración en
los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas gel, para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad.
depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las Posteriormente, en la tercera parte del protocolo se evaluará el rendimiento, al determinar la
negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pI. La carga neta de una proteína es cantidad total de proteína y por último en la cuarta parte del protocolo se determinará su pureza al
positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o realizar la separación de las muestras proteicas y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS.
intercambiador catiónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe
encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aniónico que Material biológico
100 g de carne de res preferentemente filete de ternera
13 14
de precipitados de 1L. NOTA. Puede tomarse una alícuota de está fracción y denominarla
Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo) Fracción 0.
1 Tijeras 4. Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4°C durante 10
1 Espátula minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al
1 Recipiente para hielo sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fracción 1). Apartar 1 mL de la fracción
1 Par de guantes de látex 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso.
Gasa Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.
1 Vasos de precipitados de 1L
1 Probeta de 250 mL
1 Probeta de 100 mL B. Precipitación con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) por equipo.
4 Botellas de centrífuga 5. Tomar 25 mL de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados.
Licuadora 6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magnético, mientras se
Balanza granataria añade lentamente sulfato de amonio sólido (8.15g de (NH4)2SO4 por 25 mL del sobrenadante).
Balanza de dos platos La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal
no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún
Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver los grumos. Se recomienda colocar
2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 mL una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la
1 Recipiente para hielo solución se caliente.
2 Vasos de precipitados de 100 mL 7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 55% con
1 Espátula sulfato de amonio.
Tubos para microfuga de 1.5 mL 8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 mL y se
Gradilla para tubos de microfuga centrífuga a 10,000 rpm 4°C por 10 minutos.
1 Caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 9. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 mL de
1 Caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. la fracción 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a –20°C para su posterior uso.
1 Micropipeta 20-200 µL 10. Calcular el peso de (NH4)2SO4 para obtener una solución al 75% de saturación, (0.125 g de
1 Micropipeta 200-1000 µL (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente.
1 Bandeja pequeña 11. Una vez disuelto el (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a
1 Barra magnética 10,000 rpm a 4ºC por 10 min y descartar el sobrenadante.
1 Agitador magnético 12. Resuspender el botón en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL.
Centrífuga (por grupo) 13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe
Balanza (por grupo) contener 1000 µL, ese volumen se usará en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a
Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) –20°C.
Reactivos
− Tris 50 mM pH 7.0 SUGERENCIAS:
− (NH4)2SO4 sólido. 1. Para evitar la congelación y descongelación innecesaria de las muestras es conveniente que
al final de está sesión se almacenen las muestras en alícuotas y que se etiqueten
Desarrollo experimental apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra.
Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4°C). Mantener las soluciones y 2. Se recomienda sólo descongelar la alícuota una sola vez y después desecharla.
suspensión proteica en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el
volumen de la solución de homogeneización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los
pasos de purificación (Figura 2.3). Ya que estos valores son necesarios para calcular el rendimiento,
contenido de proteína y actividad enzimática.
A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y
se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos.
1. Cortar en trozos pequeños 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso que acompaña a
la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el
cuarto frío hasta su uso).
2. Agregar 3 volúmenes de 50 mM Tris/HCl pH 7.0 frío por cada g de tejido (240 mL) y licuar
brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente.
3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua
destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso Número Alícuota almacenada para: Volumen
15 16
de Determinación PAGE-SDS Curva Obtención de Desalado total _____g Tejido
Fracción de proteínas. temporal de parámetros almacenado ______mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0
actividad cinéticos. Moler
enzimática.
I II III IV Homogeneizado
0 ⎯ ⎯
Filtrar con gasa
1 ⎯ ⎯
Homogeneizado
2 ⎯ ⎯ Distribuir en botellas de centrífuga
3 Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4°C
4* ⎯ ⎯
Botón Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL
FPA* ⎯ ⎯ (FRACCIÓN 1; _________mL)
FPB* ⎯ ⎯
A _______mL SN añadir ________g (NH4)2SO4 (55% saturación)
* Fracciones que se obtendrán en la siguiente sesión Agitar
Notas y cálculos:
Distribuir en tubos de centrífuga

Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C
Botón Sobrenadante
(FRACCIÓN 2;_________mL)
Añadir ________g (NH4)2SO4 (75% saturación)

Agitar
Recuerda que ya está al
55% de la sal
Distribuir en tubos de centrífuga

Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C
Botón Sobrenadante
(FRACCIÓN 3)
Añadir 1 mL de H20;
Volumen total obtenido______mL
Figura 2.3 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con
sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas.
17 18
PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO

Cuestionario
1. ¿Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas? IÓNICO Y DE AFINIDAD
2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va
a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué. Objetivos
3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de - Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado y cambio de
acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso, solubilidad y unión a ligandos. la solución amortiguadora de extractos proteicos.
4. ¿Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4°C? - Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad para purificar una proteína
5. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como localización
subcelular, secuencia primaria de aminoácidos, pI (punto isoeléctrico), actividad enzimática Material biológico
que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. Fracción 3 obtenida en la sección anterior
6. De acuerdo al pI de la lactato deshidrogenasa que encontraste predice cual será su carga
eléctrica cuando la proteína se encuentre en un amortiguador de fosfatos pH 7.0. ¿Qué tipo de Material y equipo
columna y eluyente recomiendas para su purificación y porqué? 1 Columna de cromatografía vacía
7. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿por qué 1 Columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina
existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína? 1 Probeta de 50 mL
8. ¿Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico?
Menciona al menos 2 y para que se usan Tubos para microfuga de 1.5 mL
1 Recipiente para hielo
Referencias 1 Soporte universal
• Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and 1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez
ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New Micropipeta de 1000 µL
York, USA. Micropipeta de 200 µL
• Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1- 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta
4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta
• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John
Centrífuga (por grupo)
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4
Balanza (por grupo)
• Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.
Code number 18-1132-29 Pp 94.
Reactivos
• Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Desalado
Pp 1-7. Consultar la página www.els.net − 2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama de
• Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega empacada para su uso
John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net inmediato.
• Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, − Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM β-
USA. Pp 71-104 Mercaptoetanol. (Ver preparación en el apéndice)
− 400 mM PMSF
− Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF (1 mM). Se prepara poco antes de su uso.
Sitios recomendados para (Se entrega por grupo: Un frasco ámbar con 26 mL del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol,
1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas añadir 65 µL de 400 mM PMSF para obtener una concentración final de 1 mM (agitar
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html página desarrollada por el Dr. Rogelio vigorosamente para disolver el PMSF añadido)
Rodríguez Sotres. − Agua destilada estéril para el lavado de las columnas.
2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra. Purificación por cromatografía de intercambio iónico
http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm − Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (ver Apéndice).
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl − Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0.
− Amortiguador de elución I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de
3. calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. NaCl.
http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm − Amortiguador de elución II. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 3.0.
Purificación por cromatografía de afinidad

− Matriz para purificación por afinidad. DEAE affi-gel blue gel (ver Apéndice).
− Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF El mismo que se uso para el desalado
19 20
− Amortiguador de elución A. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF-NAD+, preparado Figura 2.3 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B.
al momento según se indica a continuación: adicionar la solución de Tris-β-Mercaptoetanol- Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución.
PMSF al frasco que contiene NAD+ en polvo, para una concentración final 5 mM (ver
apéndice).
Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad.
La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra
Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de
la fracción 4.
1.- Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex, como se muestra en la Figura 2.3.
2.- Tomar 1 mL de la fracción 3 y añadirlo a la columna. A. Empacado de la columna para la fase tres de la purificación.
3.- Adicionar a la columna poco a poco la mezcla de proteína y esperar a que entre a la columna por Adicionar 1 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar
gravedad (aproximadamente en 1 minuto o menos). intercambio catiónico o de afinidad. (Dejar drenar hasta obtener 0.5 mL de volumen contenido
4.- Desechar el primer mL que eluye de la columna (correspondiente al volumen vacío), agregar a la inicialmente en la columna). Si es necesario colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100
columna 1 mL de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF y colectar en un tubo de microfuga para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4°C). Es importante revisar que no se hayan
frío el segundo mL. Esta fracción contiene a la LDH (Fracción 4). Se guardan 100 µL para llevar a producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante; eliminar el eluato.
cabo la medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el
siguiente paso. B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico
NOTAS. 1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico.
1La columna se lava con 10 mL de agua destilada estéril y se mantiene hidratada para 2. Equilibrar la columna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 1.0 mL de
reutilizarla, entregarla al profesor. Amortiguador de equilibrio I. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de
2No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a
ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna para el uso posterior de otro 3000 rpm por 5 minutos a 4°C.
grupo de estudiantes. 3. Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de la columna con
parafilm y adicionar los 900 µL de la fracción 4. Posteriormente tapar la parte superior de la
columna y agitar por inversión entre 5 a 10 veces. Destapar la salida y dejar que pase el líquido
por la columna desechando éste volumen (Este es el volumen muerto y no contiene proteína).
Nuevamente, se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C.
4. Realizar un lavado con 1 mL de Amortiguador de equilibrio I (para eliminar la unión no específica).
Alternativamente se centrífuga como se mencionó en los pasos 2 y 3.
5. Solicitar a su profesor el amortiguador de Elución I o II considerando las características de
pI de la LDH. Para la elución se adiciona poco a poco 1.0 mL de amortiguador de elución y se
recolectan ± 900 µL en al menos 2 fracciones de 450 µL cada una (Figura 2.3), las que
denominamos, Fracción purificada FPIa y FPIb. Alternativamente se centrífuga como se
mencionó anteriormente.
6. Estas fracciones se usaran posteriormente para determinarles proteína, actividad y realizar el
corrimiento electroforético.
NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 mL de agua estéril y se guarda la

columna lavada para ser reutilizada por otro grupo de estudiantes. Entregar al profesor.
C. Purificación por cromatografía de afinidad.

1. Se utiliza una columna que se empaca con DEAE Affi-gel Blue (ver apéndice)
2. Se equilibra la columna al adicionar poco a poco 1 mL de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-
PMSF (preparado al momento, como se indica en Reactivos o Apéndice I). El volumen que drena
se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede
centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4°C.
3. Enseguida se adiciona poco a poco 900 µL de la Fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min
a 4°C o se deja drenar y se elimina la fracción no adsorbida (aproximadamente 900 µL, este es el
volumen muerto, y no contiene proteína.
4. Añadir 1 mL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la
columna.
21 22
5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 µL de Amortiguador de elución A
(amortiguador adicionado con NAD+) y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga frío Parte III. Monitoreo del proceso de purificación.
(Fracción purificada A o FPA).
6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de proteína que haya quedado aún unida a la A. Determinación de la concentración de proteínas
columna (Fracción purificada B o FPB).
Objetivos
NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 10 mL del agua estéril, y entregar la − Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una
columna lavada al profesor para ser utilizada nuevamente por otro grupo proteína.
− Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína.
− Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína.
Cuestionario − Determinar la concentración mediante la detección de la absorbancia a 280nm.
1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fracción 3 del protocolo − Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico:
experimental? Determinación de proteínas por Bradford.
2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a − Analizar el progreso de la purificación de una proteína.
desalar una suspensión de proteínas? − Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína:
3. ¿Qué intervalo de fraccionamiento de moléculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones rendimiento y pureza.
tiene? − Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.
4. ¿Qué es el volumen vacío en una columna de filtración en gel?
5. ¿A que se refiere el término volumen muerto en una columna cromatográfica? Introducción
6. Investiga la composición de la matriz de intercambio iónico que se uso para purificar a la Para evaluar de manera cuantitativa el éxito de una purificación de proteínas es necesario conocer
LDH?. dos parámetros el rendimiento y el grado de pureza en cada paso del proceso de purificación.
7. De acuerdo al pI de la LDH y conociendo el tipo de columna de intercambio iónico que estás
utilizando, indica que amortiguador de los que están enlistados en los reactivos usarías para El rendimiento es un parámetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad
su purificación y fundamenta tú respuesta. biológica de la proteína de interés en cada paso de la purificación, el 100% corresponde a la actividad
8. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de del extracto inicial. Mientras que el grado de pureza se refiere al incremento en pureza, valor que se
intercambio catiónico? obtiene de dividir la actividad específica de cada paso entre la actividad específica del paso inicial
9. ¿Que debe contener el eluyente para la purificación de la LDH en la cromatografía de de purificación, este índice da el valor de 1 para el extracto inicial.
intercambio iónico que se propone en este protocolo y porqué?
10. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad y Para obtener el valor de la actividad específica que se encuentra generalmente expresado en
cuál es el componente clave para la purificación de la LDH en está columna? Unidades/ mg proteína-1 es necesario contar con a) una técnica que determine la concentración de
proteínas en la muestra, y b) una técnica que específicamente detecte o mida la cantidad de la
proteína blanco (Unidades de actividad). En casos raros, la proteína blanco es fácil de detectar,
Referencias porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (proteína verde fluorescente). Cuando la
• • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John proteína es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimático
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 específico para determinar si estamos llevando a cabo la purificación de manera adecuada, actividad
• • Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. que se realizará y que se encuentra descrita en la sección 3 del manual. Para las proteínas que no
Catálogo 18-1132-29 Pp 94. son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biológica de la proteína.
• • Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.
Pp 1-7. Consultar la página www.els.net En está sección se realizará la determinación de proteínas de cada una de las fracciones obtenidas
• • Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life durante el protocolo de purificación de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino,
sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net paso necesario para determinar la actividad específica de la proteína de interés. Además es
• • Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, necesario conocer la concentración de proteínas ya que llevaremos a cabo el corrimiento
USA. Pp 71-104. electroforético de las muestras.
• Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com
Sitios recomendados para Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico.

La determinación de proteínas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida,
1. Aprender sobre cromatografía barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibración para determinar la concentración
• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm de las muestras. El método se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante
2. Realizar una autoevaluación sobre los fundamentos de la cromatografía G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los
• http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante
libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del Lowry (otra técnica colorimétrica para
Revisado por los Profesores: Carmen Parra G., Elpidio García R y Diana Sánchez R. determinar proteínas) que es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las
23 24
proteínas, el Bradford sólo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford 6. Usar este estimado para determinar las diluciones o alícuotas a usar en la determinación
es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda colorimétrica de proteínas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 µg de
usar vidrio o cuvetas depolipropileno. Al usar cuvetas de polipropileno se facilita su limpieza con un proteína con una absorbancia máxima aproximada de 0.6.
poco de alcohol.
Determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford. Se utilizará una curva
Determinación de proteínas estándar de BSA y las muestras se harán por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las
mezclas de ensayo.
Material biológico.
Fracciones 0 a la 4 y FPA y FPB Para la curva estándar:
7. Etiquetar los tubos de microfuga según se indica en la tabla 2.2, después añadir los reactivos
Material y equipo en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con
1 Recipiente para hielo cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!.
Celdas metacrilato grado UV para espectrofotómetro 8. Registrar la absorbancia a 595 nm. Importante incubar a temperatura ambiente por al menos
Celdas de polipropileno para espectrofotómetro 5 minutos. La absorbancia se incrementará con el tiempo por lo que las muestras no deben
Tubos para microfuga de 1.5 mL incubarse por más de 1 h a temperatura ambiente.
1 Vórtex
Micropipeta de 200-1000 µL Tabla 2.2 Orden de adición de reactivos para la determinación de proteínas del estándar de BSA
Micropipeta de 20-200 µL Tubo B 1 2 3 4 5
Micropipeta de 5 a 10 µL H2O (µL) 800 770 760 740 720 700
1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta BSA (µL) 0 30 40 60 80 100
1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta Reactivo Bradford (µL) 200 200 200 200 200 200
1 piceta con etanol y una con agua bidestilada. Absorbancia
1 gradilla para tubos de microfuga 9. Graficar absorbancia del estándar vs cantidad de proteína (µg) y obtener los parámetros de
Espectrofotómetro regresión.
Reactivos
Reactivo de Bradford Para las muestras:
Solución estándar de albúmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL. 10. Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y
que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa o usar las
Desarrollo experimental muestras que descongelaste para la determinación de proteínas por Abs 280nm.
11. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.
Determinación de proteínas por el método Abs 280 nm. Sección sugerida pero puede omitirse 12. Hacer las diluciones de cada una de las fracciones, según indicaciones de su profesor. Cada
y realizarse directamente la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. muestra diluida se determinará por duplicado. Anotar la dilución empleada en la Tabla
2.2
1. Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y 13. Numerar los tubos según se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volúmenes de
que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. proteína que te indique el profesor, registrarlos y completar la tabla. Una vez llena la
2. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. tabla añadir los reactivos según se indica.
3. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. 14. Usar el tubo B como blanco
4. Leer la absorbancia las fracciones que te indique tú profesor a la longitud de 280 nm. 15. Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva estándar, para calcular el
5. Calcular la concentración de proteína usando la fórmula descrita en la sección 1 del Manual. contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula:
Llenar la Tabla 2.1
⎛ Abs λ 595 nm − b ⎞
Tabla 2.1 Concentración de proteína calculada por la Absorbancia a 280nm Contenido de proteína K ( µg ) = ⎜ ⎟* F
Tubo Absorbancia Concentración (µg/µL) ⎝ m ⎠
F0 Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilución de cada muestra.
F1
F2 16. El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo,
obteniendo la concentración de proteína en µg/µL.
F3
17. Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para
F4 cada fracción.
FPA
FPB
25 26
Tabla 2.3. Determinación de la concentración de proteína de las fracciones obtenidas durante los 7. Da el fundamento de otro método para determinar proteínas.
diferentes pasos de la purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. F corresponde a
Fracción y conc a que la muestra se usará concentrada. Referencias
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 • Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring
H2O (µL) 780 760 780 760 Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
cbp 800 µL • Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
F0 ____ (µL) − − − − − − − − − − − −
Páginas web que se pueden consultar:
F1 ____ (µL) − − − − − − − − − − − − Http://www.histosoft.com/services/background/colorimetric-assay-html
F2 ____ (µL) − − − − − − − − − − − −
F3 ____ (µL) − − − − − − − − − − − −
F4 ____ (µL) − − − − − − − − − − − −
FPA conc − − − − − − − − − − 20 40 − −
(µL)
FPB conc − − − − − − − − − − − − 20 40
(µL)
Reactivo 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
Bradford
(µL)
Absorbancia
18. Determinar la cantidad de proteína total que se obtuvo de cada una de las fracciones de los
diferentes pasos de purificación, para ello multiplicar el volumen total de la fracción por el
promedio obtenido en el punto 7, colocar los datos en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificación de la LDH
Fracción Promedio Volumen total en la fracción Proteína total en la fracción
µg proteína/µL (µL) (µg o mg )
0
1
2
3
4
FPA
FPB
Cuestionario
1. Compara los resultados de concentración que obtuviste con los dos métodos empleados en la
práctica.
2. ¿Qué desventajas tiene determinar la concentración de proteína por Abs 280 con respecto al
Bradford en muestras que tienen una cantidad variada y diferente de proteínas, como en
nuestras fracciones de la purificación de la lactato deshidrogenasa?
3. ¿Puedes usar otra proteína como estándar que no sea BSA? Si es así ¿porqué y cuál?
4. ¿Qué sustancias pueden interferir en cada uno de los métodos empleados y si se puede como
evitas su interferencia?
5. Investiga el intervalo de concentración que detectan cada uno de los métodos.
6. ¿Porqué es necesario construir una curva de calibración en la determinación colorimétrica de
proteínas por Bradford?
27 28
Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. 1 Recipiente para hielo

1 Micropipeta de 2-10 µL
B. Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS 1 Micropipeta de 20-200 µL
1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta
Objetivos 1 Recipiente de plástico/gel para la tinción.
− Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una 1 Cámara para electroforesis
proteína. 1 Fuente de poder
− Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. 1 juego de placas de vidrio
− Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una proteína. 1 Peine
− Analizar el progreso de la purificación de una proteína. 1 juego de separadores
− Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína: Pinzas para sujetar las placas
rendimiento y pureza.
− Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas. Reactivos
− Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% N’N’metilen-bisacrilamida.
Introducción − 2 M Tris /HCl pH 8.8
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida es una herramienta analítica indispensable − 0.5 M Tris/HCl pH 6.8
y rutinaria en un laboratorio de Bioquímica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar − 20% SDS
una mezcla compleja de proteínas, evaluar la pureza de una proteína durante el proceso de − TEMED
aislamiento y provee algunos valores aproximados de las características fisicoquímicas de las − 10% Persulfato de amonio
proteínas como la composición de subunidades, punto isoeléctrico, tamaño y carga. − Agua destilada
− Isopropanol o butanol
En la electroforesis la migración de las partículas o moléculas cargadas ocurre cuando se establece − Mezcla de estándares de peso molecular de proteínas.
un campo eléctrico. La velocidad de la migración depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado y − Amortiguador de muestra *
la carga neta de las moléculas a separar. Si el reservorio de la solución que se encuentra en contacto − Amortiguador de corrida *
con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a − Solución teñidora *
9.0, la mayor parte de las proteínas se encontrarán cargadas negativamente, por lo que al aplicar el − Solución desteñidora *
campo eléctrico migrarán al ánodo. La migración diferencial de las proteínas dependerá no sólo de su *La composición de las soluciones se encuentra en el apéndice.
tamaño sino también de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente
desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria Desarrollo experimental
de la proteína y se uniforman las cargas de las proteínas, llevando a que la migración sólo dependa
de su peso molecular. Preparación del gel de poliacrilamida-SDS.
1. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los
Existe una gran variedad en la composición de los geles, que responde a las necesidades de separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las
separación de diferentes mezclas de proteínas. En este caso se utilizará a la electroforesis en geles pinzas.
de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificación de una proteína. El gel de 2. Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.5).
poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monómeros de la 3. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, añadiendo al
acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N’-metilen bisacrilamida para final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solución (USAR
formar una red. La tetrametiléndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerización y el ión GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA).
persulfato (S2O8-) realiza la función de catalizador con la formación de radicales libres. Las proteínas
pequeñas viajan más rápido que las de mayor tamaño, porque el tamaño del poro entorpece el paso Tabla 2.5. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS.
de las proteínas de mayor peso molecular.
Reactivos Gel separador Gel concentrador
Material biológico 30% Acrilamida + 2 mL 0.66 mL
Fracción 0 o 1 0.8% Bisacrilamida
Fracción 2
2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL ⎯
Fracción 3
Fracción PA 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 ⎯ 0.6 mL
Fracción PB 10% SDS 50 µL 50 µL
H2O 1.94 mL 3.67 mL
Material y equipo TEMED* 2 µL 2.5 µL
2 vasos de precipitados 25 mL 10% Persulfato de amonio* 40 µL 40 µL
1 Pipeta Pasteur con bulbo Volumen total 5 mL 5 mL
Tubos para microfuga de 0.5 mL *Añadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.
29 30
Cabe señalar que los pozos tienen una capacidad máxima de 30 µL por lo que la mezcla
4. Añadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio. proteína:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen.
5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con 15. Realizar también una mezcla de estándares de peso molecular. Usar 7 µL del estándar y
agua, con la finalidad de disminuir la tensión superficial y que no se forme un menisco en la mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra.
parte superior del gel.
6. Se espera a que polimerice la acrilamida, no más de 20 minutos. Tabla 2.6. Preparación de muestras para su corrimiento electroforético.
7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el Fracción Concentración de µL para 35 µg Amortiguador de Estándar
exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel proteína muestra (µl)
8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2. (µg/µL)
9. Se añade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior 0 ⎯
para formar los depósitos en los que colocaremos la muestra. 1 ⎯
10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.
2 ⎯
11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cámara de
electroforesis. 3 ⎯
12. Añadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios. 4 ⎯
FPA ⎯
FPB ⎯
Estándar ⎯ ⎯ 23 µL 7µL
Adición de muestras y corrida

16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se obtuvieron las
fracciones y colocando al final el estándar, PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS
MOLECULARES DE LOS ESTÁNDARES (Figura 2.6).
Figura 2.6 Aplicación de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.

Figura 2.5. Pasos a seguir para la preparación de un gel de poliacrilamida-SDS.
17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador.
Preparación de muestras Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.
13. Ya que conoces los µg proteína/µL, calcular cuál es el volumen necesario para tener 25 µg de 18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o según se
proteína. Con los datos llenar la tabla 2.6. desee.
14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calculó en un tubo de microfuga y a 19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una
ese volumen añadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.
también, si los volúmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al 20. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución
añadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total. desteñidora. Poner a agitar suavemente.
31 32
21. Tomar una foto al gel teñido.
22. De acuerdo a los resultados señalar el o los pasos de purificación en donde se produjo el
mayor enriquecimiento en la proteína de interés, la lactato deshidrogenasa. 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Cuestionario
1. Con la información de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis, realizar la curva de PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
log. movilidad electroforética (Rf) vs log. peso molecular. LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO.
2. Determinar el Rf en el que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa.
3. De acuerdo a la anterior información señale en la foto del gel en donde se localizaría la LDH. Objetivos
4. En cuál de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH. - Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos.
5. Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH, - Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método
la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico. espectrofotométrico.
6. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de - Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que
afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y
una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo tú equipo y los otros equipos cuál sería el grado de pureza o enriquecimiento).
resultado si primero realizan la cromatografía de intercambio catiónico y luego la de
cromatografía de afinidad. Introducción
7. ¿Qué cantidad de proteína enriquecida en LDH se obtuvo en la fracción purificada de tú Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción y no se
columna consumen o modifican durante ésta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioquímicas
8. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas obtenida en el proceso celulares no podrían proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reacción
cromatográfico final? se encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reacción en ausencia del catalizador. Otra
9. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa, utilizando semillas de propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reacción en la
girasol. que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas características
A) Busca cual es la función de la proteína químicas y geométricas comunes (especificidad de grupo).
B) En que material biológico se encuentra
C) En que compartimento subcelular se encuentra La enzima, al ser una proteína, tiene una estructura geométrica característica y la porción de la
D) Busca la información estructural y/o fisicoquímica de la proteína. enzima que específicamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro catalítico o sitio
E) Diagrama de flujo del protocolo de purificación propuesto, indicando en cada paso en activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminoácidos son suficientes para efectuar la catálisis,
donde se queda tú proteína. para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de éste no se cataliza la
reacción. El cofactor es un ión metálico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita
Referencias una coenzima, es decir una molécula orgánica con características no proteicas, que generalmente se
• Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une
protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo
• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John catalítico. Éste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 ocupará en ésta sección experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea
• Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo
• Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, prostético.
USA. Pp 71-104
• Diseño de un ensayo enzimático
Problemas resueltos de purificación de proteínas Durante el aislamiento y purificación de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html la cantidad y pureza de la enzima, así como evaluar sus características cinéticas. Para el diseño de
un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza, es decir: A) cuales son las
especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la
estequiometría completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la
enzima.
Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un método para identificar y monitorear

cualquier cambio físico, químico o biológico que ocurre durante la conversión del sustrato a producto.
Se pueden utilizar distintas técnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato
o producto como la espectrofotometría, la fluorometría, la titulación ácido-base y el conteo radiactivo.
La elección de alguna de ellas depende esencialmente de las características estructurales del
sustrato y/o producto, así como de la química de la reacción.
33 34
Si un ensayo enzimático involucra el seguimiento de la concentración del sustrato o producto durante
un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cinético. Por otro lado, cuando se realiza la Material y equipo
determinación de la concentración del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a Celdas de plástico
tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reacción, ya que cualquier Tubos de microfuga
desviación de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la Parafilm
reacción pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentración de sustrato, la 1 Recipiente para hielo
desnaturalización de la enzima y a la inhibición causada por el producto de la reacción. Pero, hay que 1 Micropipeta de 200-1000 µL
aclarar que la velocidad inicial de una reacción ocurre en los primeros minutos de la reacción, una 1 Micropipeta de 20-200 µL
relación lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va más allá del 5% de la 1 Micropipeta de 2-10 µL
concentración inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimática, es 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta
fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales. 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta
1 Vórtex
Lactato deshidrogenasa de mamífero. Espectrofotómetro (por grupo)
El nombre científico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC
1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración Reactivos
del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad física intensa, cuando la tensión de 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
oxígeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de 10 mM Piruvato de sodio
manera reversible la conversión de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el
disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con amortiguador de fosfatos para su disolución. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de
la concomitante conversión de NADH a NAD+. La regeneración del NAD+ permite que el flujo de la vía 1.0, si no es así volver a pesar y medir. El NADH no se puede almacenar disuelto, por lo que al final
glucolítica continúe. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato →Lactato cuando la la sesión experimental se desecha el reactivo.
demanda de energía cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.
Desarrollo experimental.
Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa.

Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fracción 3, que es
la fracción que usarán para obtener los parámetros cinéticos de la enzima. Para obtener las curvas de
actividad se determinará la dilución óptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que
concluyan con esa fracción y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesión, realizar
posteriormente las curvas temporales de actividad a la fracción 1 y/o la fracción purificada A o B.
Figura 3.1. Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reducción del piruvato para formar lactato es
reversible y dependiente de la presencia de una coenzima. Las mezclas de reacción se realizarán directamente en las celdas de plástico. Se usará agua para
ajustar a 0 el espectrofotómetro.
La LDH es un tetrámero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos
de subunidades, la H que predomina en el corazón y la M que predomina en el músculo y el hígado. 1. Descongelar la proteína y mantenerla a 4°C en un recipiente con hielo. Hacer una primera
Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrámeros con estequiometrías distintas: dilución de la fracción 3, se recomienda 1:50.
H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes 2. Se etiquetan 5 celdas.
afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reacción pero difieren en 3. A cada una de las celdas se les añadirán los siguientes componentes:
su estructura son llamadas isoenzimas. 515 µL 100 mM Amortiguador de fosfatos
29.3 µL 10 mM Piruvato
En la práctica se determinará la actividad de la LDH de músculo esquelético de bovino, enzima que 210.7 µL H2O
contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En está parte del protocolo se
medirá a diferentes tiempos la reacción en el sentido de Piruvato →Lactato, utilizando como fuente de 4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Adicionar a una de la celdas 50 µL de 4 mM NADH
enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificación de la LDH de la e inmediatamente agregar 10 µL de la muestra de enzima diluida o la cantidad indicada por
sección II del manual. los profesores.
5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversión dos veces y se lee inmediatamente la
El ensayo de actividad está basado en la detección del cambio de absorción del NADH y el NAD+. El absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la primera absorbancia
NADH es una molécula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la leída una vez que se añadió enzima es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima
enzima en las muestras se detectará como una disminución en la absorbancia a 340 nm, debido a sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas
que en la reacción el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+. y hacer una dilución mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir
menos la muestra.
Material biológico.
Fracciones obtenidas durante la purificación de la LDH (sección 2 del manual)
35 36
6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). inicial. Para la obtención del rendimiento se considera que el 100% es la actividad total
El ensayo de actividad se realizará a temperatura ambiente, por lo que una vez recuperada en la fracción inicial en relación con la actividad total recuperada en cada paso de
adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotómetro. purificación.
Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificación de proteínas. Anotar la Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino.
fracción y su dilución. Procedimiento Proteína Actividad total Actividad Veces de Rendimiento
total en la mmolmin—1 enzimática purificación
Tiempo F3 F__ F___ F____ F____ F____ F____ F____ F____
fracción específica
(min) dilución dilución dilución Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución (mg) (mmol min-1mg-1)
Homogeneizado 1 100
(F1 o F0)
Sobrenadante de la
0.5 precipitación con
sulfato de amonio
1.0
45% (F2)
1.5 Botón obtenido de
la pp con sulfato de
2.0 amonio 70% (F3)
Primera Fracción
2.5 que salió de la
cromatografía*
3.0 (FPA)
Segunda Fracción
3.5 que salió de la
cromatografía*
4.0
(FPB)
4.5 Anotar cual cromatografía se realizó de intercambio iónico o de afinidad.
5.0 11. Analizar los resultados.
Cuestionario
7. Realizar una gráfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de 1. ¿Por qué se usó H2O como blanco para calibrar el espectrofotómetro en la práctica?
cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta. Se sugiere colocar todas las 2. Realiza el análisis dimensional de la fórmula que se propone para calcular la actividad de la
fracciones en una misma gráfica. enzima.
8. Para calcular la actividad total de la enzima se utiliza la siguiente ecuación: 3. ¿Cuáles son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima?
4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una
⎛ Abs ⎞ curva temporal de aparición de productos.
m⎜ ⎟ * Vol . ensayo (mL ) * F 5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el
Actividad = ⎝ min ⎠ = mmol min −1
( )
ε M −1 cm −1 * b (cm )
que la proteína se enriqueció más. ¿Por qué?
6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad ¿en qué
pasos de la purificación se eliminan más contaminantes?.
Donde: 7. ¿Cuál es la utilidad de realizar una tabla de purificación en la que se toma en cuenta la
m: es la pendiente de la recta (∆Abs/∆t) en unidades de abs / min actividad de la enzima?
ε: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Referencias
Vensayo: es el volumen total del ensayo. • Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-
190. Localización QP514.2
F: es el factor de dilución de la proteína
• Kopperschläger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases
and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.
9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la práctica de purificación de proteínas llena la
• Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización
Tabla 3.2.
QP514.2
10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad específica hay que dividir la actividad total
entre los mg totales de proteína en la fracción. Para obtener las veces de purificación o Grado • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-
de pureza se divide la actividad específica de cada una de las fracciones entre la fracción 233. QH345 L43
37 38
• Pardo-Vázquez JP. Cap 10. Cinética enzimática. En Bioquímica de Laguna. El Manual la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad
Moderno, SA de CV., 2002, pP185 teórica máxima de una reacción. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se
• Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localización QP514.2 aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Los valores de Km y
Vmax son característicos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llevó a
cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína que responde modificando
PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS su estructura y carga eléctrica cuando los componentes de la solución cambian.
ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN
INHIBIDOR. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima también llamados parámetros
cinéticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato.
Objetivos: Este método tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una línea recta por lo que la
- Determinar la concentración de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad máxima. interpolación es difícil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemáticas que
- Entender el significado de los parámetros cinéticos Vmax y Km. producen una línea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la más popular la de
- Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa Lineaweaver-Burk y que es la ecuación que a continuación se muestra:
utilizando diferentes gráficos de la ecuación linealizada de Michaelis-Menten.
- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa
- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parámetros cinéticos de la enzima.
Introducción
El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una
enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten son
estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se expresiones matemáticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretación son útiles
modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentración para obtener los valores de Km y Vmax.
de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros.
Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que
Curva de velocidad en función de la concentración de sustrato. Tanto en una reacción catalizada disminuyen su velocidad de reacción, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera
por una enzima como en una reacción química, se espera que la velocidad de la reacción de natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser
conversión de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentración de los compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las
reactantes que participan en la reacción, es decir si se duplica la concentración de cualquiera de los reacciones enzimáticas. Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son
sustratos la velocidad de la reacción también se duplica. A una reacción así se denomina reacción de inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula. La interacción de
segundo orden y se representa como una línea recta con pendiente positiva y diferente de cero. un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del
inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción
Pero en una reacción que es catalizada por una enzima, sólo a concentraciones bajas del o los entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de
sustratos se obtiene una reacción de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad la enzima.
es independiente de la concentración de sustrato, debido a que no hay más enzima que lleve a cabo
la reacción. La reacción a concentraciones altas de sustrato se llama reacción de orden cero y Inhibidores competitivos. Son moléculas que tienen una similitud estructural y química al sustrato
también se representa como una línea recta pero con pendiente casi igual a cero. de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el
inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El
En resumen, en una reacción catalizada por una enzima la variación en la concentración del o los inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el
sustratos presenta diferentes órdenes de reacción. Para un gran número de enzimas la gráfica que se sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona más sustrato y el inhibidor es
produce se puede describir mediante la expresión matemática de una hipérbola rectangular. Como reversible, el aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición. El inhibidor afecta
en cualquier expresión matemática se expresan en ella la relación entre las variables junto a 1 o más exclusivamente el valor de la Km de la reacción catalizada por la enzima (Figura 3.2).
constantes.
El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llevó a describir la ecuación de la
hipérbola rectangular, ahora conocida como ecuación de Michaelis-Menten, con ella es posible
predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la
ecuación se describe así:
V max [s ]
v=
Km + [s ]
Donde las dos variables de la ecuación son la velocidad (v) y la concentración de sustrato (s).
Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis-
Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a
39 40
Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima. − 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
− 10 mM Piruvato de sodio
Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del − 10 mM Oxamato de sodio
sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no − 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.
competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte
de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también Desarrollo experimental.
la conversión del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor
de la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2). Efecto de la concentración de sustrato.
1. Numerar las celdas.
Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se 2. En una celda de plástico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de
une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se añaden 50 µL de NADH 4
crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor mM y 10 µL de la muestra de enzima diluida, fracción 3 obtenida en la práctica de purificación.
se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km
como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la gráfica que se produce con un inhibidor Tabla 3.3. Efecto de la concentración de sustrato.
de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en Solución 1 2 3 4 5 6
este último.
*Concentración final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
En la práctica se determinarán las constantes cinéticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de 100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515
músculo de bovino, para la reacción en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la H2O c.b.p. 815 µL (µL) 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200
concentración de enzima, el pH y la temperatura de reacción. También se determinará el tipo de
inhibición que un ácido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a 10 mM Piruvato (µL) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40
través de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola
concentración de inhibidor su efecto en las constantes cinéticas de la reacción catalizada por la 4 mM NADH (µL) 50 50 50 50 50 50
enzima. ENZIMA (diluida*) (µL) 10 10 10 10 10 10
*Usar la dilución apropiada de enzima, preguntar a su profesor.
3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversión.

4. Ajustar el espectrofotómetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de
onda de 340 nm.
5. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).
Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usará en la práctica, el oxamato.
Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.
Tiempo Piruvato (mM)
Material biológico
Fracción 3 obtenida en la práctica de purificación. (seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
Materiales y equipo 30
10 celdas de plástico 60
Tubos para microfuga
1 Recipiente para hielo 90
1 Vaso de precipitados de 25 mL
1 Micropipeta de 1000 µL 120
1 Micropipeta de 10 µL
Puntas para micropipeta de diferentes capacidades 210
1 Vortex
Parafilm 240
Espectrómetro (por grupo)
270
Reactivos
41 42
300
6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la práctica

anterior.
7. Posteriormente se grafican:
Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.
A) Actividad vs concentración de sustrato (gráfica de Michaelis-Menten); Tiempo Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM
B) La actividad de acuerdo a la ecuación de Lineweaver-Burk y (seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff.
8. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos 30
anteriores.
60
90
Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH.
120
Al igual que en la sección anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes
150
concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la
actividad de la LDH (Tabla 3.5). 180
Tabla 3.5. Composición de medio de reacción para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato 210
deshidrogenasa. 240
Solución 1 2 3 4 5 6
270
*Concentración final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
300
100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515
H2O c.b.p. 815µL 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200
10 mM Oxamato (µL) 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2 Cuestionario
10 mM Piruvato (µL) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40 1. ¿Por qué es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima?
4 mM NADH (µL) 50 50 50 50 50 50 2. Diseña un protocolo diferente al presentado en está sección para determinar la actividad de la
lactato deshidrogenasa.
ENZIMA (diluida) (µL) 10 10 10 10 10 10 3. ¿Cuál fue el blanco de la reacción?
4. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de
primer orden?
1. Se adiciona en una celda de plástico los reactivos de acuerdo a los volúmenes y el orden que
5. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de
se encuentra en la Tabla 3.5.
orden cero?
2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6). 6. ¿ En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de
3. Obtener la pendiente y calcula la actividad enzimática por mg de proteína. orden cero orden mixto?
4. Realizar los siguientes gráficos: A) Actividad vs concentración de sustrato; B) La gráfica de 7. ¿Qué significado tiene?
actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff. 8. Define Km e indica qué unidades tiene.
5. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos 9. Define Vmax e indica qué unidades tiene.
anteriores. 10. ¿Qué tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.
6. Determinar el tipo de inhibición que oxamato ejerce sobre la LDH. 11. ¿Cuáles son los inhibidores naturales de la LDH de músculo?
12. ¿En el humano que tejidos contienen LDH?
13. ¿Qué es el ciclo de Cori y como participa la LDH en el ciclo?
Referencias
• Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización
QP514.2
• Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.
202-233. QH345 L43
43 44
• Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localización QP514.2
Sitios recomendados para 4. GENÉTICA

1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax
• http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la página pulsar la tecla
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS
kinetics_model.xls, después regresa a la página inicial y contesta las preguntas que FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS.
se te hacen.
• http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm Objetivos:
− Entender los principios de la transmisión de los caracteres hereditarios.
− Explicar y usar la terminología relevante: dominante, recesivo, portador, mutación,
NOTAS Y CÁLCULOS heterocigoto, homocigoto, síndrome, alelo y locus.
− Resolver problemas aplicando las leyes de Mendel: Determinación de frecuencias
− Distinguir entre enfermedades autosomales y ligadas al sexo.
Introducción
La descripción morfológica o funcional de un organismo vivo en cualquier momento dado de su
desarrollo es el fenotipo de ese organismo. Mientras que el genotipo se define como el conjunto de
instrucciones o genes, contenidos en su material genético heredable; es decir, la información
contenida en las secuencias de su ácido desoxirribonucleico (DNA), que se transmite de generación
en generación entre los miembros de una especie. Este conjunto de instrucciones es una amplísima,
pero finita, predeterminación de las posibilidades fenotípicas de un organismo. Por otro lado, existen
los factores epigenéticos, tales como las influencias o eventos que no están escritos en el material
genético heredable de los seres vivos, pero que modifican los fenotipos. Los fenómenos epigenéticos
como por ejemplo el ambiente, pueden determinar, en un momento dado, el modo en que se
expresan las instrucciones genotípicas y por lo tanto, el fenotipo del individuo.
Una característica del genotipo es su heredabilidad. Los mecanismos implicados fueron publicados
por Gregor Johann Mendel en 1866. Él identifico ciertos rasgos fenotípicos que se transmiten de
manera predecible en plantas de chícharos y Propuso que estos caracteres están determinados por
factores genéticos que segregan independientemente, es decir, que se heredan de padres a hijos en
forma de unidades de herencia individuales, los genes.
Los estudios de Mendel se basaron realizando cruzas entre individuos de líneas puras que diferían en
un par de caracteres de fácil identificación fenotípica y la observación del aspecto de la primera
generación híbrida (F1 o primera generación filial, formada por plantas monohíbridas).
Posteriormente, cruzó las plantas híbridas entre sí y obtuvo la segunda generación filial (F2). Contó el
número de individuos de la F2, que presentaron cada uno de los caracteres utilizados que podrían ser
comparados, tales como color de las flores, el color y textura de la testa de las semillas y la longitud
de los tallos.
Mendel, a partir de sus experimentos, concluyó que los chícharos tienen una dotación genética doble.
Es decir, que son organismos diploides, en los que existen dos copias o alelos del gen causante de
un rasgo fenotípico. En los organismos diploides cada copia alélica proviene de cada uno de los
progenitores. Mendel, también postuló que, frecuentemente, una de estas copias en particular puede
ser dominante sobre su contraparte heredada del otro progenitor. Cuando en la descendencia se
encuentra un alelo recesivo del gen y uno dominante, el fenotipo observado en esta combinación
heterocigota, corresponderá al tipo dominante. Para la aparición de un fenotipo recesivo es
indispensable la transmisión, por ambos progenitores, de una combinación homocigota de alelos
recesivos. Obviamente, la combinación homocigota de las variantes alélicas dominantes resultará en
un fenotipo dominante. Las interpretaciones que Mendel dio a sus observaciones han resultado
correctas para un tipo de herencia que hoy llamamos Mendeliana, precisamente por manifestarse de
la manera en que Mendel lo descubrió. En este caso un rasgo fenotípico está determinado por la
combinación de dos copias alélicas de un gen, cada una de ellas en distinto grado de dominancia,
45 46
combinaciones que se heredan en los miembros de una familia en una forma matemáticamente
predecible.
Con los datos que obtuvo, formuló una explicación teórica con postulados, que ahora constituyen las
leyes de la herencia. La primera Ley de Mendel o Ley de la segregación dice que durante la
formación de los gametos, los pares de factores se separan o segregan al azar, de manera que cada
gameto recibe uno u otro miembro del par con la misma probabilidad. Segunda Ley de Mendel o Ley
de la distribución independiente postula que la segregación de diferentes pares de factores se realiza
de manera independiente durante la formación de los gametos.
Enfermedades genéticas y la herencia mendeliana

Se cree que cerca de 400 enfermedades en humanos son resultado de cambios en un solo gene.
Muchas de ellas son enfermedades raras, pero discapacitantes que pueden llevar a la muerte del
individuo. Aunque las enfermedades genéticas en un individuo son raras, el número total de personas
afectadas es significativo, alrededor del 2% de todos los nacimientos al año. Actualmente no existen
medios totalmente efectivos de tratamiento o cura para la mayor parte de ellos.
Muchos de los desórdenes genéticos pueden ser mantenidos en la población, ya sea por la
transmisión de genes desde los padres hacia los hijos o por la aparición de mutaciones. Los cambios Figura 4.1. Frecuencia fenotípica de la aparición de la fibrosis quística cuando ambos padres son portadores (progenitores
en el DNA o en los cromosomas, mutaciones, pueden provenir desde la formación de las células heterozigos). La fibrosis quística es una disfunción o síndrome producido por la alteración en un gen presente en el
sexuales (óvulos y esperma) o en el estadío temprano del desarrollo del feto. Un ejemplo de esto cromosoma 7. En este ejemplo, la descendencia de progenitores heterozigotos siempre tendrá una distribución de
último es la aparición del síndrome de Down, el cual causa retardo mental, estatura baja y algunos frecuencias NN=25%, cfcf=25% y Ncf=50%.
otros cambios. Proviene de un error durante la división celular (meiosis) llevando a contener 47
cromosomas en el niño en lugar de 46, generalmente causado por la disyunción o separación Condición ligada al sexo. Debido a que los varones sólo poseen un cromosoma X frente a los dos
incompleta del cromosoma de uno de los progenitores (cromosoma 21). que poseen las mujeres, las enfermedades de un solo gen recesivas localizadas en el cromosoma X,
aunque raras, afectan con mayor frecuencia a los hombres que a las mujeres. Como ejemplos
Los humanos presentamos células diploides en la mayor parte de nuestras células. Con un contenido tenemos al daltonismo y a la hemofilia.
de 23 pares de cromosomas, donde sólo un par es diferente entre hombres y mujeres y es el que
define el sexo. Las mujeres presentan 2 cromosomas X similares, mientras que los varones un Otro tipo de herencia de gran relevancia médica es la llamada herencia poligénica. Un gran número
cromosoma X y otro más pequeño denominado Y. A los genes que se localizan en el par 23 de de enfermedades, entre las cuales destacan el asma, la diabetes y la hipertensión, tienen un
cromosomas son a menudo denominados genes ligados al sexo, mientras que los otros 22 son componente genético poligénico. Se dice que un rasgo fenotípico es poligénico cuando está
denominados genes autosomales. determinado por más de un gen; mientras que los ejemplos discutidos anteriormente, son casos de
herencia monogénica.
Todas las enfermedades causadas por el cambio de sólo un gene tienen patrones claros de herencia,
lo cual significa que es posible determinar las probabilidades de que alguien herede una condición Existen otros tipos de herencia que no siguen las reglas mendelianas. Esto ocurre cuando los genes
particular. Tres patrones de herencia están involucrados: Condiciones recesivas, dominantes y que causan el fenotipo son “móviles”, es decir que a diferencia de los genes que siguen una
ligadas al sexo. segregación mendeliana, hay genes que no tienen una residencia o locus fijo en el genoma o
cromosoma, lo cual hace imposible predecir su heredabilidad de acuerdo a las leyes de Mendel.
Condición recesiva. Para presentar los síntomas de la enfermedad, el individuo debe presentar las
dos copias del gen afectado. Su descendencia presentará la enfermedad sólo que el otro padre Actualmente, se han desarrollado técnicas para la determinación de mutaciones o modificaciones en
también sea portador del gen, como en la fibrosis quística (Figura 4.1). los cromosomas. Sin embargo, sólo cubren una gama limitada de alteraciones, por lo que el
Condición dominante. La enfermedad es causada por un alelo dominante, por lo que un individuo diagnóstico y la prevención es difícil. Para aquéllos en los que hay protocolos de detección de si se es
sólo tiene que heredar una copia para presentar la enfermedad. Los hijos de padres que presentan la o no portador de una enfermedad congénita, es posible orientarlos sobre el tratamiento, las
enfermedad, tienen 50% de probabilidades de presentarla también. Un ejemplo grave de está posibilidades de transmitir la enfermedad a sus hijos y las técnicas de detección una vez que se está
condición es la enfermedad de Huntington, la cual se desarrolla entre los 35 a 45 años, disminuyendo esperando a un hijo.
la movilidad motora y ocasionando demencia.
Material y equipo
Computadora conectada a internet, por cada 2 personas.
Resolver los problemas interactivos que les entregarán los profesores
Cuestionario
47 48
1. ¿Cómo se aplican las Leyes de Mendel a las enfermedades hereditarias en humanos?
2. ¿Cuáles son las características principales de la herencia autosómica dominante, autosómica
recesiva, recesiva ligada al X y dominante ligada al X?
5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
3. ¿Es posible determinar todas las características fenotípicas a través de las reglas de Mendel?
4. Fundamente su respuesta. TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN
5. Dé un ejemplo de una enfermedad autosómica diferente a las señalas en la introducción.
6. Proporcione un ejemplo de una enfermedad ligada al sexo diferente a la indicada en la Objetivos
introducción. − Identificar al DNA como portador de la información genética
7. ¿Cuáles son los pasos a seguir para la prevención o tratamiento si se sospecha ser portador − Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plásmido.
de una enfermedad congénita? − Reconocer a la conjugación bacteriana como un fenómeno de transferencia horizontal de material
8. ¿Cuáles son los pasos a seguir si su pareja se encuentra embarazada y usted es portador de genético.
una enfermedad congénita? − Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugación bacteriana.
9. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos
adquiridos al realizar esta práctica? Introducción
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente,
Referencias de tamaño pequeño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de
• Gardner JE. Garder E. Principios de genética. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios
Localización QH581.2 M 65 para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la
• Garvin W, Adley C, Dixon B, Frings J, Madden D, Marcussen L, Turner J, Wymer PEO. Unit sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales,
4. Issues in human genetics. European initiative for biotechnology education 1995. etcétera. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación
http://www.reading.ac.uk/NCBE relajada", esto es, están presentes en muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su
aislamiento y su purificación.
Una bacteria sólo puede adquirir un plásmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por
transmisión vertical o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal
de material genético. Estos son: la transformación, la transducción y la conjugación.
En la transformación, el DNA liberado de una célula bacteriana entra a otra célula, generalmente de la
misma especie. En la transducción, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o
de un plásmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias.
La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia de material genético, en el que la

información genética de un plásmido con o sin parte del cromosoma bacteriano es transferido a otra
célula (Figura 5.1). Este proceso, a diferencia de la transducción, tiene como condición esencial el
contacto celular. A la célula que aporta el material genético se le llama donadora y aquella que lo
recibe, receptora. No todos los plásmidos pueden llevar a cabo la conjugación, es decir ser
conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro
de este grupo de plámidos se encuentra el factor de fertilidad o plásmido F de E. coli. El plásmido
F confiere a la célula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra célula que no lo posea. El
plásmido F se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano. Cuando se integra al
cromosoma bacteriano, suprime su sistema de replicación y se replica como parte del cromosoma
bacteriano.
El plásmido F contiene más de 40 genes tra, la mayoría de los cuales son necesarios para la
construcción de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una proteína, la pilina,
codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las
bacterias donadora y receptora y para la formación de un puente citoplasmático por donde pasará el
material genético. La transferencia se inicia a partir de un sitio determinado en el plásmido y que
forma parte de los genes tra, denominado oriT
49 50
Material biológico
Un cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC.
Un cultivo de E. coli W3110/F´KmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a
37ºC.
Materiales y equipo
1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estéril
5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 µg/ml)
2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml)
100 palillos de madera estériles
1 asa bacteriológica
1 propipeta
Figura 5.1. Conjugación bacteriana. Paso del plásmido F de una célula donadora a una receptora a 1 mechero
través del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra como sólo una de las hebras del Incubadora a 37°C
DNA del plásmido se inserta en la célula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las Baño María a 37°C
bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas células presentan al plásmido F. Refrigerador a 4°C
Algunos plásmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugación por sí mismos, pero pueden ser Por grupo para controles de las cepas
transferidos (plásmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plásmidos con genes − 1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 µg/ml)
tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio − 1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml)
oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugación, incluyendo los que codifican para
la formación del pili. Desarrollo de la práctica
1. En condiciones estériles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estéril y hacer la
En relación al plásmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: siguiente mezcla de conjugación: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str más 0.2 mL del cultivo
E. coli W3110/F´KmTn3 (Figura 5.2).
Cepa F-. Célula bacteriana que no posee un plásmido F, y que actúa como célula receptora en la 2. Incubar el tubo a 37ºC SIN AGITACIÓN durante 30 min.
conjugación. 3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la
zona 1 como “bacteria receptora”, la zona 2” como conjugación” y la zona 3 como “bacteria
Cepa F+. Célula bacteriana que posee un plásmido F independiente del cromosoma bacteriano, actúa donadora”. Colocar una gota pequeña de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se
como célula donadora en la conjugación y transfiere al plásmido F a la célula receptora absorba. Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota del
transformándola en célula F+. cultivo se puede sembrar por estría cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja de adelantar un
día.
Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plásmido F integrado a su 4. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugación,
cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (célula refrigerar a 4ºC.
donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. No transfieren el plásmido F, por lo 5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja
que al término de la conjugación de las células receptora permanece como F. petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estría las cepas donadora y
receptora en cada mitad respectivamente de las cajas. Incubar a 37°C durante 24 h. Al observar
Cepa F’. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromasómico, pero que antes estuvo crecimiento refrigerar las cajas.
integrado al cromosoma y que se encidió llevando consigo genes bacterianos. Actúa como célula 6. Después del tiempo de incubación trabajar con la caja del paso 3. Si no se sembró por estría en
donadora en la conjugación y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a el paso 3 entonces este es el momento de tomar una asada de las zonas ”receptora y de
la célula receptora en una célula F′, la cual será un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendrá dos “conjugación” y sembrar por estría en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina,
copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F′. A ese tipo de transferencia se cada una en una caja diferente. Incubar a 37ºC durante 24 h.
le conoce como sex-ducción. 7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2%
sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y después la
Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una célula F- en un tiempo constante. Se calcula replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias
en aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo
característica ha sido utilizada en el mapeo genético localizando un determinado marcador genético para así transferir la bacteria. En la práctica una colonia se transferirá con el palillo del cultivo de
en un tiempo dado. bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibiótico
estreptomicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrás de las
En esta práctica se comprobará la conjugación bacteriana mediante la transferencia de un marcador 4 cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja (ver Figura).
genético, la resistencia a la kanamicina. El marcador genético de selección que se utilizará para la 8. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los
cepa receptora será la resistencia a la estreptomicina. resultados. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes. Refrigerar las cajas.
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0.2 mL Cuestionario
Luria-
1. ¿Qué es un plásmido?
E. coli JM1452Str Mezcla de E. coli W3110/F´KmTn3
2. ¿Cuáles son los mecanismos de transferencia horizontal de material genético en bacterias?
cepa receptora conjugación cepa donadora
3. ¿Qué es la conjugación?
4. ¿Qué diferencia existe entre la conjugación y los otros mecanismos de transferencia horizontal
de material genético?
5. ¿Cuáles son las principales características del plásmido F y qué genes contiene?
Incubar 30 min a 37°C 6. ¿Cuáles son los genes del plásmido F necesarios para la transferencia de material genético
sin agitación por conjugación y para qué codifican?
7. ¿De acuerdo al plásmido F cuántos tipos de cepas bacterianas se conocen? y ¿qué diferencia
existe entre ellas?
8. Señale que tipo de transconjugantes se obtiene en cada una de las siguientes “cruzas”:
a) F+ X F-
Luria-Estreptomicina
b) F’ X F-
c) Hfr X F-
Incubar 24 h, 37°C 9. ¿Qué características tiene las cepas empleadas en la práctica?
10. ¿Por qué tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de resistencia?
Sembrar por estría las cepas receptora y transconjugante 11. ¿Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la práctica en las cajas controles con
en Agar Luria-estreptomicina antibióticos? ¿Por qué son importantes estas cajas control?
(se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso) 12. ¿Por qué se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con
estreptomicina como kanamicina? ¿Qué resultados se obtuvieron en esas cajas?
Incubar 24 a 37°C 13. ¿Cómo se comprobó la conjugación en la práctica? ¿Qué porcentaje de bacterias
transconjugantes se obtuvo?
14. ¿Cuál es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la práctica?
15. ¿Qué diferencias existen entre que un plásmido sea conjugativo o sea movilizable?
16. ¿La conjugación puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o solo se da en las
bacterias Gram negativas?
17. ¿Con qué frecuencia y dónde se realiza la conjugación en forma natural?
Cepa receptora Cepa transconjugante 18. ¿Cuál es la importancia biológica de la conjugación?
19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibióticos
utilizados en la práctica.
20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos
adquiridos al realizar esta práctica?
Marcar las cajas
Parchar 50 colonias Referencias
• Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467.
• Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272.
• Genética General, Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac.
Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002.
Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina

Figura 5.2. Esquema experimental de conjugación bacteriana. Producción de una cepa transconjugante, a partir
de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la información
genética para la resistencia a kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos.
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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN
Objetivos
− Conocer el fundamento para transformar células bacterianas.
− Realizar la técnica de transformación bacteriana.
− Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo.
− Conocer la definición de organismo transgénico.
− Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.
Introducción
Desde épocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con características fenotípicas
deseables. La domesticación ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando
la producción de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 años una vaca producía en
promedio 2000 a 3000 litros de leche al año. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un
promedio de 6000 litros al año, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000.
Asimismo, una gallina hace 100 años producía en promedio 70 huevos al año, en este siglo las
mejores razas producen cerca de 250 al año.
Las técnicas convencionales de reproducción han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin Figura 5.3. Vector de clonación pET-24. Se muestran algunas características del vector, como el sitio origen de
embargo, la recombinación cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por la transcripción (ori), el sitio de clonación múltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; fl
ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llevó a producir a la mula, organismo estéril. Así, el ori, origen de replicación fl y el sitio que servirá para controlar la expresión del transgene una vez que sea
número de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse sólo insertado en el sitio de clonación múltiple, el sitio de unión al represor lacI.
entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.
Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de Los plásmidos poseen un interés singular en la Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas
técnicas de manipulación y de selección del material genético, la ingeniería genética. Debido a que vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una
el DNA contiene un código genético esencialmente similar para todos los organismos, en principio se célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener múltiples copias); en esta
pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir célula hospedera el vector se replica y se expresa. La molécula que resulta de la unión de un DNA
organismos con características útiles y particulares, que de otra manera sería imposible de obtener, vector con el DNA de interés (inserto) se denomina molécula vector recombinante.
los denominados organismos transgénicos.
Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres
Un número amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad características (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicación y, por tanto, la capacidad de
de buscar métodos para introducir o modificar un gene para adquirir una característica deseable, replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonación
como por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar múltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restricción (enzimas que cortan
que al introducir genes no propios al huésped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que secuencias internas de DNA de manera específica) y hace posible la clonación de insertos de DNA
la característica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiología en la forma y orientación deseada. 3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que
y sobrevivencia del individuo, o bien que se “escape” la nueva información de manera indiscriminada permitan aislar a las células hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un
a otros organismos. antibiótico. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que
una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales,
Requisitos para construir un vector de clonación combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales.
Aún cuando el código genético es básicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite
del control genético difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en
introducido en una célula eucarionte. Para la producción de un organismo genéticamente modificado presencia de dicho antibiótico.
se tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de
interés más una parte extra de DNA que controle correctamente la función del gene en el nuevo Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan sólo bajo ciertas circunstancias
huésped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte metabólicas y/o en tejidos específicos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del
se le debe agregar una región promotora en el extremo 5’ del gen para que sea reconocido por el donador por uno que asegure su expresión, denominados promotores fuertes, que también pueden
aparato transcripcional del organismo receptor. Asimismo, se debe añadir una secuencia de poli A en ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento.
la porción 3’ del gen para que el RNAm pueda ser traducido.
Transformación
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Existen varias técnicas para la introducción del transgene en la célula u organismo, como son la Material biológico
microinyección, la infección de una célula huésped con virus que contenga al vector o bacterias. En − 1 tubo de microcentrifuga con 100 µL células competentes de E. coli por grupo mantenerlas
este último caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el congeladas hasta su uso.
factor Ti ocasiona los síntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se − 1 tubo de microcentrifuga con 100 µL células competentes de E. coli por equipo mantenerlas
conduce a la expresión del transgene en la planta. En el caso de la transformación de bacterias, congeladas hasta su uso.
generalmente se introduce el DNA extraño por microelectroporación o por choque térmico. − Plásmido PET-TEM-1.
En el caso del choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes Materiales y equipo
que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura, 2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL)
así como de iones que se encargan de cambiar la carga eléctrica de la membrana al recubrir las Tubos de microfuga de 1.5 mL
cabezas polares de lípidos (por ejemplo con iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas Varilla de vidrio en forma de L
eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del Recipiente para hielo
plásmido al interior celular. A las células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo Mechero Bunsen
la introducción de material genético se denominan células competentes. Micropipeta de 100-1000µL
Micropipeta de 10-100 µL
Posteriormente a la introducción del material genético a las células competentes, se disminuye la Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles
temperatura y se diluye el calcio, con lo que se permite que se restaure la permeabilidad membranal. Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles
Al colocarlas en una condición óptima de crecimiento se obtienen las células transformantes. Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles
En la práctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se Material por grupo
encuentra insertado el gen de la β-lactamasa (transgene). Se realizará la transformación mediante la Baño de incubación a 42°C
técnica de choque térmico y la resistencia a kanamicina se utilizará como indicador de que las células
Incubadora con agitación a 37°C
son transformantes.
Reactivos
− Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. 5 mL por grupo.
Las células competentes se proporcionarán congeladas. En el apéndice se encuentra el protocolo de
preparación de las células competentes.
Preparativos
1. Revisar y/o equilibrar el baño de incubación a 42°C.
2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente.
3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37°C por 30 min
antes del plaqueo.
Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque

térmico.
1. Tomar un tubo de células competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo.
Descongelar las células competentes en el hielo (las células competentes son muy sensibles a
los cambios de temperatura).
Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la 2. Añadir 1 a 5 µL (1 a 50 ηg) del plásmido a un microtubo que contiene 100 µL de células
construcción del vector pET-TEM-1. Adicionalmente se añadió el sitio de restricción BamHI para entonces insertar el gen competentes.
que codifica para la β-lactamasa (transgene) en el sitio de clonación múltiple del vector pET24. El transgene, ompA-βlac, 3. Mezclar invirtiendo el tubo.
contiene la secuencia completa de la proteína TEM-1 β-lactamasa. Además se colocó hacia la región 5’ del gen, a la 4. Dejar en hielo por 30 minutos.
secuencia que codifica para la secuencia señal o de tránsito de una proteína que se encuentra en la membrana externa de 5. Dar choque térmico a 42°C durante 45 segundos NO AGITAR.
bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la proteína OmpA, la β-lactamasa es una enzima soluble, por lo que la 6. Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37°C con agitación (225 a 250
secuencia señal permitirá que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las células con rpm).
el vector pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las células es a Kanamicina ya que contiene un 7. Si es necesario, concentrar las células por centrifugación a 14,000 rpm por 1 min. Eliminar el
gene que confiere la resistencia a ese antibiótico en particular. sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC.
8. Esparcir los 100 µL de las bacterias transformadas, en las cajas con el medio de selección
(Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.
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9. Incubar a 37°C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4°C.
10. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en una caja con LB- TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:
Kanamicina por 24 h a 37°C.
11. Calcular la eficiencia de la transformación para lo cual se necesita conocer la concentración
AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS
del DNA usado para la transformación, el volumen añadido a la mezcla de transformación, el
Objetivos
volumen usado para el plaqueo y el número de colonias obtenidas.
− Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA
genómico.
Cuestionario − Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.
1. ¿Qué es un organismo transgénico?
2. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los métodos de reproducción asistida y la de Introducción
producción de organismos transgénicos para la producción de organismos mejorados? Desde finales de la década de los años 70 del siglo pasado, se desarrolló un gran número de
3. ¿Cuáles son las consideraciones éticas que consideras se deben de tomar en cuenta para métodos de aislamiento de plásmidos. La mayoría tomando en cuenta las diferencias topológicas
producir los organismos transgénicos? entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de
4. ¿Qué es un vector de clonación? ambos. Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido
5. ¿Cuáles son los requisitos que debe cumplir un vector de clonación para ser utilizado para circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas
transformar a un organismo? ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las
6. ¿Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonación de fragmentos de cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido
DNA de alto peso molecular? desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al
7. ¿Qué tipo de vector de clonación es el pET24? restaurar el pH neutro de la solución, la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente
8. ¿Cuál es el método de transformación que se utilizará en la práctica? para ambas macromoléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que
9. Describe al menos otros dos métodos para transformar células ya sea de animales, hongos o las cadenas están próximas. Mientras que, las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos
plantas. precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por
10. ¿Cuál es el marcador de selección de las cepas transformantes y donde se encuentra centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de
codificado? que el DNA cromosomal ha sido removido.
11. Para realizar la transformación de células además del vector de clonación se necesitan las
células receptoras, ¿qué tipo de células receptoras son las E. coli DH5α y las células E.coli Material biológico
BL21? Células de E. coli transformante obtenidas en la práctica anterior.
12. Después de obtener un organismo transgénico, ¿cuáles son los cuidados que se deben tener
para su manipulación o almacenamiento? Materiales y equipo
Referencias Recipiente para hielo
• Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localización QP514.2 Microcentrifuga
• Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring
Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442.
Micropipeta de 0.5-10 µL
• Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL
317. QH345 L43
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL
• Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL
science. A.4D.1-A.4D.2.
• Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium Reactivos
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance − Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 µg/mL)
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
− Solución GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
• Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Reverté, pp.745-773.
− 3 M Acetato de potasio pH 4.8
− 70% Etanol
• http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
− Isopropanol
• http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
− 10 N NaOH
• http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
− 10% SDS
• http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
− Para preparar 500 µL de solución de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 µL de 10 N
• http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinación de eficiencia de la
NaOH y 50 µL 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deberá
transformación)
hacerla justo antes de usarla.
Desarrollo experimental (Figura 5.5)
59 60
Trabajo previo
1. Inocular una colonia de las células transformadas en 5 mL de medio Luria que contenga
kanamicina a una concentración de 30 µg/mL, e incubar a 37°C por 12 h con agitación
horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal para que se agiten
bien las células y haya buen crecimiento. Inocular 5 mL Medio LB + Kanamicina
Obtención de plásmido por el método de lisis alcalina
2. Tomar la mitad del cultivo y colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a 10,000
rpm por 1 min a 4°C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir
Incubar a 37 0C / agitación durante 12- 16 h
este paso en el mismo tubo dos veces más. Células transformantes
3. Eliminar el sobrenadante por decantación.
4. Resuspender el paquete celular en 300 µL de solución GTE fría, agitando en el vórtex. Incubar
a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solución de lisis durante este tiempo de
incubación.
5. Adicionar 300 µL de la solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión del tubo. a. Tomar 1.5 mL del cultivo
IMPORTANTE no agitar en el vórtex. Incubar en hielo por 5 min. y centrifugar
b. Eliminar el sobrenadante
6. Agregar 300 µL de la solución fría de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente
por inversión del tubo. Incubar en hielo por 5 min.
7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min a 4°C. Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo
8. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de isopropanol frío. Eliminar el sobrenadante
9. Incubar por 20 min a -20°C.
10. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4°C.
11. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA añadir 1 mL de etanol al 70% y centrifugar a Resuspender el paquete celular con sol. GTE fría.
12,000 rpm durante 5 min.
12. Remover el sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación a Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb
temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min).
13. Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril, guardar a –20°C. Adicionar sol. de lisis
Nota. Se recomienda cuantificar el DNA por su absorbancia a 260 nm. Obtener los µg/mL Mezclar por inversión (no agitar).
considerando que 1unidad de A260 nm de DNA de doble cadena es igual a 50 µg/mL. Incubar en hielo máximo 5 min.
Adicionar sol. de acetato de potasio fría

Mezclar por inversión (no agitar).
Incubar en hielo máximo 5 min.
Centrifugar y tomar el sobrenadante
Adicionar isopropanol (v/v)
Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.
Añadir etanol al 70%, agitar en vórtex

Centrifugar
Eliminar sobrenadante por decantación y
eliminar el etanol residual por evaporación
Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril.
5 a 10 uL para la cuantificación Cuantificar ácidos nucleicos (relación Abs260 nm / Abs 280 nm).
61 62 plasmídico a partir de las células

Figura 5.5. Protocolo de obtención de DNA
transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:

Cuestionario
1. ¿Cuáles son las propiedades del DNA plasmídico que nos permiten separarlos del DNA ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDO.
cromosomal o genómico?
2. Explica por qué se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificación de
plásmidos. Objetivos
3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de una preparación de plásmidos? − Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa.
4. ¿Cómo los eliminas? − Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos.
5. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos una vez purificados? − Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de agarosa.
6. ¿Cuáles son los métodos utilizados para cuantificar a los ácidos nucleicos? − Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la
7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si el plásmido que obtuviste se encuentra puro? biotecnología.
8. ¿Porqué a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmídico?
9. Busca el factor de conversión de pares de bases a número de aminoácidos y de número de Introducción
aminoácidos a peso molecular de proteína en kDa. Las endonucleasas de restricción se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia
usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla específicamente en ambas cadenas de la
molécula de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en
Referencias biología molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que
• Tümmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005, han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de
John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por
• Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.745-773. bacteriofagos, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.
• Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edición, WH
Freeman. Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palindrómicas, es decir segmentos
de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de
restricción (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro
del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena,
denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre
los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos (Figura 5.6).
EcoRI HindIII HaeIII
Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restricción en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el último ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del género y especie de la bacteria de donde
se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.
Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las
técnicas para el análisis y la manipulación de los ácidos nucleicos. Han sido utilizadas en la
eliminación de secuencias genómicas desde un nucleótido hasta cientos de bases, así como en la
introducción de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la producción de proteínas
recombinantes.
Diferentes factores afectan la reacción de restricción por endonucleasas. Se inhiben usualmente con
los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras
proteínas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentración de sales. Los
63 64
efectos de la contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima añadida a la Transiluminador
reacción, arriba de 10 a 20 U /µg DNA, incrementando el volumen de reacción, lo que diluye a los Pantalla de acrílico
inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación. La digestión del DNA genómico Cámara fotográfica
puede facilitarse por la adición de policationes como espermidina, la cual actúa uniendo
contaminantes cargados negativamente. Cuando un plásmido está superenrollado es necesario Reactivos
añadir más enzima o bien desnaturalizarlo. − NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C.
− BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C.
El tratamiento de una molécula de DNA con enzimas de restricción permite producir fragmentos NOTA. Las enzimas de restricción son muy sensibles a la temperatura mantenerlas en frío
definidos que pueden ser separados mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los durante su manipulación.
fosfatos de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo − Amortiguador TANGO de restricción. Reactivo que es proporcionado por el proveedor junto
eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. Cuando la migración toma lugar con la enzima NdeI.
en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, en donde las moléculas − TAE 1X. Ver preparación en el apéndice.
pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes. − Agarosa
− Amortiguador de muestra
Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. − Estándar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizará de acuerdo a las
Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias instrucciones del proveedor.
enzimas de restricción, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molécula de DNA en − Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)
donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción se denomina mapa de restricción.
El análisis de los mapas de restricción constituyen una importante herramienta para localizar Desarrollo experimental
secuencias de bases específicas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre Ensayo de restricción
cromosomas relacionados. 1. Etiquetar dos tubos de microfuga.
2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 µL de Plásmido y 1 µL de Amortiguador
Existen varias aplicaciones de los mapas de restricción, como la obtención de los patrones de RFLP
Tango10X
(“Restriction Fragment Length Polymorphism”) utilizados en las pruebas de paternidad, así como
3. Incubar a 100°C por 5 min.
también en la identificación de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen,
4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.
cabellos etc.
5. Pasado el tiempo de incubación añadir al tubo 1 solo una de las dos enzimas de restricción
En la práctica se utilizarán dos enzimas de restricción en una mezcla, debido a que el vector utilizado que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 µL BamHI y otro par
en la transformación no presenta dos sitios de restricción para la misma enzima (Figuras 5.3 y 5.4). de equipos 1 µL NdeI. Mezclar suavemente después de añadir la enzima.
De tal manera que sólo se podrá liberar el fragmento de DNA de interés al cortar por los extremos con 6. Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1µL de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al
dos enzimas distintas. tubo de microfuga.
7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el líquido se deposite
Material biológico en el fondo.
DNA plasmídico purificado de la práctica anterior. 8. Incubar a 37°C por 1.5 h.
9. Se sugiere añadir 0,5 µl de una solución de RNasa (1 µg/ml) e incubar 30 min a 37°C. Este
Materiales y equipo procedimiento eliminará el RNA y facilitará la visualización de los productos de la restricción
Recipiente para hielo en el gel. Otra opción para la eliminación de la RNAasa es añadir 2 µl de la solución de RNA
Tubos para microfuga a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cámara de electroforesis.
Gradilla para tubos de microfuga 10. Al término de la incubación colocar los tubos en hielo.
Recipientes para teñir el gel. 11. Tomar una alícuota de 10 µL o todo el volumen de restricción de cada tubo para correr en un
Micropipeta de 100-1000 µL gel de agarosa.
Micropipeta de 0.5-10 µL Preparación del gel
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles • Durante el tiempo de incubación del DNA con las enzimas de restricción, preparar el gel de
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles agarosa, se sugiere utilizar 1 gel por cada 2 equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles carriles en el gel.
Cámara de electroforesis horizontal • Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja del gel, colocar el peine (Figura 5.7 A).
Fuente de poder • Preparar un gel de agarosa al 1.2%. Pesar 0.42 g agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir
Vórtex 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodón o una servitoalla. Se calienta la mezcla en
Horno de microondas microondas por 1 a 3 min o hasta que la agarosa se disuelva bien.
Microfuga • Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60°C, añadir entonces 2 µL bromuro de etidio
Baño de incubación a 37°C (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGÉNICO) para obtener una concentración
Baño de incubación o bloque de calentamiento a 100°C
65 66
final de 0.5 µg/mL, agitar el matraz para mezclar. SUGERENCIA, EN LUGAR DE USAR EL
BROMURO DE ETIDIO AÑADIR 1µL de Syber-safe 2X por cada 1 mL de Agarosa.
• Depositar el gel en la bandeja de la cámara (Figura 5.7 B), evitando la formación de burbujas.
Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).
• Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja con el gel en la cámara de electroforesis.
• Añadir el amortiguador TAE en la cámara. La cámara de electroforesis se llena con
aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.
Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.
6. Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro
con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras
migren hacia el lado positivo de la cámara.
7. Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observación
de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de
luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiación ultravioleta es peligrosa, usar lentes
especiales o colocar una pantalla de acrílico entre el observador y la fuente de luz UV.
8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propósito, los geles serán incinerados, junto con los guantes y puntas si estuvieron en contacto
con el bromuro de etidio.
9. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de
DNA detectadas. Estimar el tamaño aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA así
Figura 5.7. Preparación de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendrá el gel y como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estándar de peso molecular que
se proporcionaran durante la práctica. Llenar la siguiente tabla 5.2.
B. Adición de la agarosa disuelta en TBE.
Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras
Preparación y cargado de las muestras.
1. Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2
analizadas.
2. Añadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta Bandas Estándar de DNA Plásmido sin restringir Plásmido restringido Plásmido restringido
para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación cruzada. con 1 enzima de con 2 enzimas de
restricción restricción
Distancia Pares de Distancia Pares de Distancia Pares de Distancia Pares de
Tabla 5.1. Preparación de muestras para aplicar en el gel de agarosa. en mm bases en mm bases en mm bases en mm bases
Reactivos Estándar* Plásmido sin Plásmido digerido Plásmido digerido estimado estimado estimado
(E) digerir con una enzima con dos enzimas 1
(P) (R1) (R2) 2
Muestra 1 µL DNAλ-HindIII 10 µL 10 µL 10 µL 3
H2O 9 µL − − 4
Amortiguador de 2 µL (Stop Mix) 3 µL 3 µL 3 µL 5
muestra 6
• El estándar que se usa en el laboratorio lambda DNA digerido con HindIII puede calentarse a 65°C por 7
10 min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el
carril del estándar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb. 10. Analizar los resultados.
3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el Cuestionario
fondo.
4. Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tienen que estar 1. ¿Qué parte de la molécula de DNA le confiere la carga negativa?
orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota: 2. ¿Cuál es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los dos
Procurar colocar la cámara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se colorantes que contiene?
incremente durante la corrida del gel. 3. ¿A que se le denomina topoisómeros?
5. Se toman los 13 µL de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra 4. ¿En la práctica se pudieron observar topoisómeros?
en la Figura. 5. ¿Qué peso molecular tienen los topoisómeros?
67 68
6. ¿Qué tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la práctica, romos o cohesivos? TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE
7. ¿Cuántos fragmentos de DNA o restricción se obtuvieron al utilizar las dos enzimas NdeI y
BamH1? PROTEÍNA RECOMBINANTE.
8. ¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al utilizar sólo una de las enzimas de restricción? ¿Por
qué? Objetivos
9. ¿Cuál fue el peso molecular del DNA liberado y del plásmido o vector? − Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli.
10. ¿Cuáles son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restricción? − Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa)
− Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante.
− Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante
Referencias − Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes
• Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2
• Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein Introducción
Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. La necesidad de producir proteínas heterólogas o recombinantes para varias aplicaciones científicas
• Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences © 2001, John Wiley & Sons, Ltd. como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
www.els.net. proteínas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas más utilizados para este fin, debido a que
• Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring son fácilmente manipulables genéticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son
Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442 económicos y se requiere sólo un entrenamiento mínimo para su manejo. Además, muchas de las
• Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279- características inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en
317. Localización QH345 L43 proyectos de producción a gran escala, donde se requiere la producción y muestreo de cientos de
• Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold clonas.
spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
• Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las proteínas de eucariotes o
Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914. las proteínas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico
del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, así como las enzimas que se encargan de las
modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por
ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias no glicosilan a las proteínas. Otros sistemas de
expresión como los sistemas de células de mamífero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de
procesar las proteínas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las
proteínas es crítica, aunque el costo de éstos sistemas es considerablemente más alto y la tecnología
que se necesita es más complicada. Adicionalmente, la producción de grandes cantidades de
proteínas como algunos productos terapéuticos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas
animales.
Muchas compañías ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresión muy
variadas, con o sin proteínas de fusión que funcionan como etiquetas para la detección y/o
purificación de la proteína deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante
y con promotores distintos. Los vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la
expresión de proteínas heterólogas.
En los sistemas pET, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del
bacteriofago T7, la expresión de la proteína es inducida cuando la célula hospedera provee una
cantidad de RNA polimerasa T7. En unas pocas horas de inducción, la formación del producto puede
llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula. Otro beneficio importante es que en
ausencia del inductor la transcripción del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas
pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador
de la lactosa, sistema que se estudiará con más detalle en el siguiente protocolo experimental del
curso. Basta mencionar ahora, que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a
cabo la expresión de nuestra proteína de interés, se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta,
el más utilizado es el Isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable de la lactosa que
sirve como un inductor artificial o gratuito del operón de la lactosa.
La producción de la proteína recombinante en una organismo no relacionado, como se mencionó

anteriormente, puede llevar a que la proteína no sea funcional, ya sea porque no presenta las
69 70
modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque adquirió un plegamiento inadecuado. 2. Para verificar que se llegó a la absorbancia indicada, tomar una alíquota de 1 mL y leerla en el
Cuando las proteínas se aglomeran formando agregados que sólo pueden solubilizarse a través del espectrofotómetro a 600 ηm contra un blanco de medio Luria. Si aún no llega volver a incubar
uso de soluciones de detergentes, se dice que están formando cuerpos de inclusión. Una proteína el matraz con agitación vigorosa.
que no se encuentra soluble aumenta los costos en su producción y/o recuperación. 3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alícuota a la que llamaremos tiempo 0
(mantener en hielo el tubo de microfuga).
En la práctica se llevará a cabo el monitoreo de la inducción de la β-lactamasa, en células completas 4.
de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa (Figura 5.4), vector que fue 5. Después agregar el IPTG para tener una concentración final en el tubo de 0.5 mM. El volumen
producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostró en la Figura 5.3. del medio con células puede variar, dependiendo del número de alícuotas que se hayan
tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el cálculo tomando
Material biológico por grupo en cuenta el volumen final de medio con células.
1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo líquido saturado de células transformadas de E. coli (crecidas 6. Incubar nuevamente a 37°C con agitación horizontal y tomar alícuotas de 1 mL cada 30 min
por 12 a 16 horas con agitación vigorosa). por 1.5 o 2 h.
7. Guardar todas las alícuotas en tubos de microfuga y a 4°C.
Material y equipo
1 mechero Preparación de un gel de poliacrilamida-SDS
1 recipiente para hielo Durante el tiempo de incubación e inducción de la proteína recombinante, preparar un gel de
Tubos para microfuga de 0.5 mL poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las
2 vasos de precipitados 25 mL instrucciones de elaboración se encuentran en la sección II, parte III del manual.
1 Pipeta Pasteur con bulbo
Recipiente de plástico para la tinción. Preparación de las muestras y separación en un gel de poliacrilamida-SDS
Micropipeta de 2 a 10 µL 1. Directamente de cada una de las alícuotas que fueron recolectadas se toman 15 µL y se
Micropipeta de 20 a 200 µL mezclan con 10 µL de amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. También hacer una
Micropipeta de 200 a 1000 µL mezcla apropiada de estándares de peso molecular, se sugiere 7 µL de los estándares de
1 caja de puntas de 10 µL para micropipeta peso molecular más 18 µL de amortiguador de muestra.
1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 2. Ensamblar el gel en la cámara de electroforesis.
1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 3. Aplicar las muestras en el gel.
Placas de vidrio 4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del
Peine colorante haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA,
Separadores siempre y cuando no se caliente el gel.
Pinzas para sujetar las placas 5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.
Cámara para electroforesis 6. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una
Fuente de poder charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.
Vórtex 7. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución
Incubadora a 37°C con agitación desteñidora. Poner a agitar suavemente.
Cámara fotográfica 8. Tomar la foto del gel.
9. Analizar los resultados. La proteína tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el
Reactivos péptido señal de la proteína ompA y de 29 kDa sin péptido señal.
− 1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 µg/mL)
− 100 mM IPTG
− Estándar de peso molecular de proteínas
− 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotómetro.
Inducción de proteína recombinante, β-lactamasa (Figura 5.8).
1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de células de E. coli transformadas con el vector PET-
TEM-1-ompAβ-lactamasa, y añadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina, tomar una alíquota
de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 ηm contra un blanco de medio Luria la
absorbancia debe ser menor a 0.3, incubarlos con agitación vigorosa a 37°C (colocarlos en
posición diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una
absorbancia entre 0.6 a 0.8.
71 72
Cuestionario
1. ¿Qué es una proteína recombinante?

2. ¿Por qué el cultivo de células debe de llegar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8 antes de
comenzar el proceso de inducción de la proteína recombinante?
3. ¿Cuál es la función del IPTG?
4. ¿Cuál fue el tiempo en el que produjo la máxima cantidad de proteína recombinante?
5. ¿Qué otros parámetros se podrían modificar para obtener el mayor rendimiento de la
proteína?
6. ¿Qué son los cuerpos de inclusión?
7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si la proteína se encuentra en forma soluble o
en forma agregada?
8. ¿Qué método propondría para purificar a la proteína recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de proteínas recombinantes que se producen actualmente de manera
comercial, explicando sus usos.
Referencias
• Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning
vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442.
• Hammlev D, Madden D, Nørby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for
biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
• LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in
Protein Science 5.1.1-5.1.8.
• Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold
spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
• Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
• Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.
Figura 5.8. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli.
73 74
pegue al operador. La subsecuente unión de la RNA polimerasa al promotor ocasiona

la transcripción de los genes estructurales y la posterior traducción en las enzimas
6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO necesarias para la utilización de la lactosa como fuente de carbono y energía. Cuando
se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador bloqueando la expresión
PARTE I: REGULACIÓN GENÉTICA EN EL OPERÓN lac de los genes estructurales.
Objetivos La presencia o ausencia de la lactosa no es el único factor que influye sobre la

- Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo para expresión del operón de la lactosa. Si la célula tiene una fuente de glucosa suficiente
controlar los niveles de enzimas en la célula. para sus requerimientos energéticos, no necesita metabolizar lactosa aún cuando esté
- Conocer los elementos que integran el operón de la lactosa. presente. El proceso por el cual esto ocurre se denomina represión catabólica e
- Entender el funcionamiento del operón de la lactosa en presencia y ausencia involucra una segunda proteína reguladora, CAP (proteína activadora de catabolito),
de este carbohidrato. y un segundo sitio de unión, el sitio CAP, adyacente al promotor.
- Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.
La CAP se une al sitio CAP sólo en presencia de AMP cíclico (AMPc), un nucleótido
Introducción modificado derivado del ATP por la adenilato ciclasa. La cantidad de AMPc en la
La regulación metabólica es el incremento o el decremento de una reacción enzimática célula depende de la concentración de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la
o de toda una secuencia de reacciones enzimáticas de las rutas metabólicas. Esto adenilato ciclasa. Si los niveles de glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco
surge de la necesidad de la célula de estar en equilibrio normal, distinto al equilibrio AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP bajos). Al controlar la cantidad
que tiene en un estado de enfermedad. de AMPc en la célula, la glucosa indirectamente regula la unión del complejo CAP-
AMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc
La célula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimáticas, a través, principalmente, está unido, se estimula la unión de la RNA polimerasa al promotor (regulación
de la modificación de la actividad simultánea de sus enzimas presentes. Dado que el positiva), lo que ocasiona la transcripción de los genes estructurales del operón de
número de enzimas es alto, lo logra a través de algunos mecanismos globales de lactosa.
regulación metabólica.
Una de las modalidades de regulación es la que involucra la expresión diferencial en Material biológico
aumento o disminución de la concentración de enzima, la regulación de la expresión Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.
genética.
Material y equipo de laboratorio
El DNA de una célula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. 5 Tubos para microfuga de 1.5 mL (estériles)
Sin embargo, sólo una parte de esta conformación genética es requerida por la célula 1 gradilla para microtubos
en todo momento (expresión constitutiva). Además, existen genes con una función 1 mechero
más especializada y cuya participación sólo es requerida por la célula bajo ciertas 1 Micropipeta con capacidad de 200-1000 µL
circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de regular la expresión de 1 Micropipeta con capacidad de 50-200 µL
sus genes. En el caso de las bacterias, la regulación de la expresión genética les 1 Micropipeta con capacidad de 10 a 50 µL
permite responder metabólicamente a los cambios en su ambiente de manera rápida y
1 Caja de puntas para micropipeta de 200 µL
precisa.
1 Caja de puntas para micropipeta de 1000 µL
Centrífuga clínica
Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulación de la expresión génica en
bacterias fueron propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, Incubadora a 37ºC
junto con André Lwoff, compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teoría del
operón. Reactivos
− 1 tubo con medio M9-glicerol estéril
El operón de la lactosa está formado por los genes estructurales lacZ, lacY y lacA, − Solución de glucosa al 2% estéril
que codifican para las enzimas β-galactosidasa, permeasa y transcetilasa − Solución de lactosa al 2% estéril
respectivamente. Todos ellos se transcriben en una molécula de RNA mensajero − Solución de glucosa 2% + lactosa 2% estéril
(RNA policistrónico), a partir de un promotor localizado río arriba de lacZ. También − Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM,
descubrieron el gen lacI, que no se encuentra adyacente al operón, pero cuyo MgSO4-7H2O 1mM, β-mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0).
producto proteico es un represor que se une al operador, localizado entre el promotor − Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe
y lacZ. De hecho, el operador y el promotor están traslapados, de manera que cuando prepararse justo antes de usarse para mejores resultados.
el represor esta unido al operador la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y − SDS al 0.1%
por lo tanto no hay transcripción de los genes estructurales. − Na2CO3 1M
− Cloroformo
Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas moléculas de ellas y las
convierte en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que éste se
75 76
Desarrollo de la práctica (Figura 6.1)

Sólo los pasos 1 al 4 requieren condiciones de esterilidad.
1. Coloca 1 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 microtubos Cultivo E. coli
estériles y rotúlalos de la A a la D. El tubo E no contendrá células pero si 1 mL
de medio M9-glicerol como E (blanco).
2. Añadir a cada tubo lo siguiente:
Colocar 1 mL / Tubo
Tubo A 250 µL de glucosa 2%
Tubo B 250 µL de lactosa 2%
Tubo C 250 µL de glucosa 2% + lactosa 2%
Tubo D 250 µL de glucosa 2%
Tubo E 250 µL de glucosa 2% + lactosa 2%
3. Incubar los tubos a 37ºC con agitación ocasional. A los 7.5 minutos de
incubación añadir, únicamente al tubo D, 250 µL de lactosa 2% y reintegrarlo a
la incubadora a 37ºC.
4. Cuando hayan transcurrido 15 minutos de incubación, centrifugar los
microtubos en la Microfuga durante a 10,000 rpm 1 minuto.. 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL 250 µL
5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 250 µL de amortiguador Z. Glucosa 2% Lactosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2%
6. Añadir a cada tubo 25 µL de cloroformo y 12.5 µL de SDS 0.1%. Agitar durante Lactosa 2% Lactosa 2%
10 segundos.
7. Añadir a cada tubo 50 µL de reactivo ONPG y agitar.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos o hasta el desarrollo de
color amarillo. Nota: monitorear la aparición del color amarillo y no dejar Incubar a 37 0C / 15 min
que el color se iguale en todos los tubos. (*A los 7.5 min de incubación añadir 250 µL de lactosa 2% al tubo D)
9. Parar la reacción con 125 µL de Na2CO3 1M.
10. Anotar que tubos desarrollan color amarillo y con qué intensidad. Centrifugar a 10,000 rpm / 1 min
11. Para un resultado cuantitativo se puede leer la absorbencia de la solución a
420 nm.
12. Analizar y reportar los resultados obtenidos.
Decantar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular en 250 µL amortiguador

Z
Añadir 25 µL de CHCl3 + 12.5 µL SDS 0.1%

Agitar suavemente 10 seg
Añadir 50 µL de reactivo ONPG

Agitar
Incubar a Tamb / 2 min
Añadir 125 µL Na2CO3 1 M
Observar la intensidad de color amarillo o leer la Abs 420 nm
Figura 6.1. Protocolo de inducción de expresión de los genes involucrados en la utilización de

lactosa
77 78
• Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.868-873.

Cuestionario PARTE II: REGULACIÓN HORMONAL DEL METABOLISMO DE
1. ¿Qué es la regulación genética? LA GLUCOSA
2. ¿Cuáles son las diferencias entre la expresión genética constitutiva, la
Objetivos
inducible y la represible? - Conocer la definición de hormonas.
3. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresión - Conocer que las hormonas participan en la regulación del metabolismo.
genética? - Conocer los mecanismos de acción y transducción de la señal por insulina:
4. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresión activación de proteínas cinasas y de proteínas involucradas en transporte y
genética? metabolismo.
5. ¿Qué son un activador y un inductor? - Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la
6. ¿Qué son un represor y un co-represor? toma de glucosa por diferentes tejidos.
7. ¿Qué es un operón y cuáles son sus componentes? - Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transducción de señales en el
8. ¿Cuál es la estructura del operón de lactosa de E.coli? transporte de glucosa.
9. ¿Cómo funciona este operón en ausencia y en presencia de lactosa?
Introducción
10. ¿Qué es la represión catabólica y como se ejerce este proceso sobre el
Los seres vivos coordinamos los eventos intracelulares a través de complejos
operón de lactosa? sistemas de señales químicas. La comunicación intracelular mantiene la síntesis o
11. ¿Por qué la bacteria utilizada en la práctica fue cultivada inicialmente en modifica la concentración de una gran variedad de moléculas, por tanto controla la
medio M9-glicerol? actividad de las vías metabólicas. Las hormonas, los factores de crecimiento y los
12. ¿Para qué se utiliza cada reactivo de la práctica? neurotransmisores, son las señales químicas que alteran o regulan la actividad celular.
13. Explique que ocurre en los tubos A-E en la práctica. Una gran variedad de moléculas mensajeras (primeros mensajeros) no entran a la
14. ¿Qué reacción es responsable del color amarillo observado en los célula para iniciar sus acciones biológicas, sino que interaccionan con diferentes
tubos? receptores en la superficie de éstas. La unión de los ligandos con sus receptores
15. ¿Qué ocurriría si a los tubos B y C se agregara ATP? induce un cambio conformacional en el receptor que lo convierte en una forma activa,
16. ¿Cuál será el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada capaz de interaccionar directa o indirectamente sobre diversas moléculas, tales como
uno de los siguientes mutantes del operón lac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc? factores de acoplamiento. La asociación con otras proteínas activan o inhiben una
cascada de sucesos moleculares (proceso de transducción de señales) que llevan a
Explique por qué.
una respuesta biológica específica y determinada de acuerdo al ligando que se unió al
17. ¿Qué diferencias existen en la regulación de una vía metabólica como la receptor.
de la degradación de la lactosa y una vía anabólica, como la de la
síntesis de triptófano? La insulina es una hormona polipeptídica que al interaccionar con su receptor
18. ¿Qué importancia tiene la regulación de la expresión genética en estimula una compleja cascada intracelular de eventos dependientes de la fosforilación
procariontes? o defosforilación específica de proteínas y culmina con una variada respuesta celular.
19. ¿Cuáles son las principales diferencias en la regulación genética entre Ocurren cuatro cambios principales por la presencia de la insulina: la activación del
procariontes y eucariontes? receptor, el control del transporte de la glucosa, la estimulación del metabolismo como
20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida la glucólisis y el almacenamiento de lípidos y la regulación de la transcripción de
cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta práctica? genes.
La insulina tiene un papel importante en la regulación de la homeostasis de la glucosa

Referencias
en sangre, debido a que incrementa el transporte y utilización (metabolismo) de
• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation glucosa en ciertos tejidos. La insulina incrementa la toma de la glucosa en las células
of gene expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. de músculo y de tejido adiposo de mamíferos. La principal causa es la movilización del
20-52. Localización QP514.2 transportador de glucosa, GLUT4, desde el interior celular hacia la membrana celular.
• Gardner JE. Garder E. Principios de genética. 1998, 4a edition Ed. El incremento en moléculas de GLUT4 en la membrana plasmática causa un
Limusa, pp. 390-407. Localización QH581.2 M 65 incremento de 10 a 40 veces en la toma de glucosa.
• Genética General. Manual de prácticas de laboratorio. Regulación
genética en el operón lac. Facultad de Química, UNAM. Ciudad El mecanismo que lleva a la translocación de GLUT4 hacia la membrana celular no se
Universitaria. México, 2002. ha descrito totalmente, pero se conoce que una vez que la insulina se une a su
receptor, éste se autofosforila en un residuo de tirosina, lo que desencadena la
• Klug SW, Cummings RM. Conceptos de genética. Ed. Prentice Hall. fosforilación de proteínas como IRS-1 y Shc, las cuales se asocian a proteínas que
Madrid 1999. Pp. 51-71. contienen residuos -SH2 (Cys) como p85, SYP o GRb. La formación del complejo IR-
• Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 1-p85 activa a una cinasa denominada PI3 cinasa, proteína clave involucrada en la
115-125. Localización QH581.2 M 65
79 80
movilización hacia la superficie celular de las vesículas de membrana que contienen al 1 Pinzas de disección
transportador GLUT4 (Figura 6.2). 1 Tijeras
1 Vaso de precipitados
1 Caja Petri
1 Cámara para el sacrificio de las ratas (por grupo)
1 Tanque de CO2 (por grupo)
Baño de agua con agitación (por grupo)
Reactivos
− Solución Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (130mM NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM
KH2PO4, 2mM MgSO4⋅7 H2O, 10 mM Glucosa, 1 mM CaCl2⋅2 H2O, 0.2% BSA y
20 mM HEPES pH 7.0)
− 0.9% NaCl
− Solución de insulina 2000 µU/mL
− 4 µM Wormanina
Se ha dividido está sección en tres partes, la extracción de los tejidos de las ratas, la
inducción de la toma de glucosa por insulina en los tejidos y tercero la cuantificación
de glucosa residual en los tubos en donde se incubó el tejido. Debido a que el
procedimiento es largo, se sugiere realizar el experimento en dos sesiones, sin
embargo lo pueden realizar en una sola sesión.
Aislamiento de tejidos.
Figura 6.2. Vía de transducción de señales por insulina. P, residuos de tyr fosforilados; GSK- Las instrucciones para el manejo de los animales del laboratorio y el sacrificio de las
3, glucógeno sintasa cinasa-3; PP1, proteína fosfatasa tipo 1; GluT, transportador de glucosa; ratas serán proporcionadas por un profesional en el área. En nuestro caso, será el jefe
PI3’-K, fosfatidil inositol 3’-cinasa subunidad catalítica; p85, PI3’-K subunidad regulatoria; PKB, del bioterio de la Facultad de Química. No obstante, a continuación se enlistan algunas
recomendaciones que les pueden ser útiles en el manejo de las ratas.
proteína cinasa B; IRS, substrato del receptor de insulina; MAPK, proteína cinasa activada por
mitógenos. Las vías conocidas se muestran con líneas continuas y las vías que aún no se Manejo y sacrificio de las ratas.
demuestran pero que podrían encontrarse relacionadas a insulina se indican con líneas − Recuerden mantener la calma, los animales perciben el miedo.
discontinuas. Tomado de Bradey y Saltiel, 2001. − Para capturar a las ratas dentro de la jaula, la manera más práctica es tomarla
con una mano de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no
Una de los enfoques experimentales que ha ayudado a encontrar los blancos puede atacar y queda inmovilizada. También es posible sujetar a la rata con
moleculares de la acción de insulina y así describir la vía de transducción de señales una sola mano, rodeando el cuello con el pulgar y el índice, cuidando de no
implicada, es el uso de inhibidores de proteínas cinasas o fosfatasas. Existen ejercer mucha presión.
inhibidores específicos de algunas cinasas como las MAPK, p70S6 cinasas y PI3- − El método de sacrificio será el químico, utilizando una cámara saturada con
cinasas. Un defecto en alguna de las respuestas celulares por el uso del inhibidor, nos CO2 por 5 min.
permite asociar a la proteína inhibida como parte de los intermediarios dentro de la vía − Posteriormente se realiza la dislocación cervical, sujetando la base de la cola
de transducción de señales encendida en este caso por insulina. del animal y jalando firmemente, al hacer presión sobre la región cervical debe
producirse un espacio de 2 a 4 mm entre el cráneo y las primeras vértebras
cervicales.
Material biológico − Una vez realizado lo anterior, colocar al animal en posición decúbito dorsal
Hígado, músculo y tejido adiposo de rata. (boca arriba) sobre la mesa previamente cubierta con un papel. Se sujetan los
miembros con el fin de que el animal se encuentre firme a la manipulación.
Material y equipo Para tener acceso a la cavidad torácica y abdominal se debe sujetar y levantar
7 Tubos falcón 50 mL la piel con unas pinzas de “dientes de ratón” y hacer una incisión a lo largo de
1 Recipiente para hielo la línea media con unas tijeras y posteriormente abrir la piel a cada lado. Una
1 Micropipeta con capacidad de 200-1000µL vez expuestas estas cavidades se puede proceder a la recolección de los
1 Caja de puntas para micropipeta de 1000µL órganos que se requieran utilizando unas pinzas rectas y tijeras (Figura 6.3).
1 Probeta de 50 mL
1 Piceta con agua destilada
81 82
Inducción de toma de glucosa por insulina (Figura 6.4)

Se recomienda que por grupo midan el efecto de insulina sobre la captación de
glucosa en tres tejidos distintos: hígado, músculo y tejido adiposo. A continuación se
describe el protocolo experimental a seguir en un tejido.
Preincubación del tejido con wormanina y posteriormente la incubación con

insulina.
1. Colocar 2 mL de solución Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-Glu) en un tubo
falcón de 50 mL marcado como W. Adicionarle 50 µL wormanina para una
concentración final de 100 nM.
2. Pesar el tubo con el líquido.
3. Añadir un trozo del tejido. Volver a pesar el tubo. Es necesario conocer la
cantidad de tejido que se coloca en el tubo.
4. Incubar por 30 min a 37°C. Este paso es la preincubación del tejido con
wormanina.
5. Al finalizar la incubación añadir 0.5 mL de la solución de insulina 2000 µU/mL y
0.5 mL de NaCl 0.9%.
6. Mezclar e Incubar en baño de agua con agitación moderada a 37°C por 30
Figura 6.3. Localización de algunos órganos de la rata. min. CUIDAR DE QUE LA TEMPERATURA DEL BAÑO NO EXCEDA LA
RECOMENDADA.
Obtención de hígado 7. Añadir 47 mL de agua.
• Antes de cortar el tejido realizar el procedimiento de perfusión. El hígado 8. Filtrar el tejido.
contiene sangre que normalmente era bombeada por el corazón, entonces 9. Si no se determina la concentración de glucosa inmediatamente, entonces
para eliminar la sangre del hígado hay que introducir una aguja de jeringa guardar en un tubo de microfuga 1.2 mL del sobrenadante. Rotular el tubo con
(llena con solución solución salina isotónica o la solución 0.9% NaCl fría) por la una W, el número de equipo y el grupo. Almacenar a –20°C hasta su uso.
vena porta del corazón. Una vez que el hígado tome su color natural, de rosa a 10. Se determinará el contenido de glucosa según se describe en la siguiente fase
rojo, extraerlo. del protocolo.
• Cortar un hígado en 7 fragmentos de aproximadamente el mismo tamaño y
distribuirlos en 7 tubos que contienen concentraciones de insulina similares al Incubación del tejido con insulina.
del tejido adiposo 12. Etiquetar 6 tubos falcón de 50 mL de la siguiente manera:
Obtención de tejido adiposo I. 1000 µU

• Abrir el abdomen ampliamente haciendo una ligera presión en la cavidad II. 500 µU
abdominal para desplazar los testículos, levantar hacia arriba el testículo III. 250 µU
izquierdo y de un solo corte separar el tejido adiposo de tal manera que no IV. 125 µU
lleve sangre, en caso contrario, quitar la sangre con solución de NaCl 0.9% V. 62 µU
• Sujetar el tejido adiposo con pinzas por la parte más angosta procurando VI. 0 µU
manejarlo lo menos posible.
• Hacer lo mismo con el tejido adiposo que cubre el testículo del lado derecho y 13. Añadir a cada tubo 1 mL de NaCl 0.9%.
repetir la operación con cada una de las 2 ratas. 14. Añadir al tubo 1, 1 mL de la disolución de insulina. Agitar bien.
• Cortar rápidamente 7 fragmentos de tejido adiposo por rata, de 15. Tomar 1 mL de la solución de insulina del tubo I y pasarlo al tubo II. Agitar.
aproximadamente el mismo tamaño y depositarlos en cada uno de los 7 tubos 16. Tomar ahora 1 mL del tubo II y pasarlo al tubo III. Agitar y continuar de esa
falcón previamente pesados. manera hasta el tubo V.
17. Tomar 1 mL del tubo V y desecharlo.
. 18. El tubo 6 no deberá contener insulina.
Obtención de músculo 19. Añadir a cada matraz 2 mL de solución de KRH-Glu.
20. Pesar los tubos en balanza analítica y ponerlos en hielo.
• Cortar el músculo de las patas y de la región ventral. Lavar el tejido en solución 21. Sacrificar las ratas una por una y aislar el hígado y el tejido adiposo de las
0.9% NaCl. testículos (ver descripción del procedimiento).
• Cortar en 7 segmentos, pesar y distribuir en los tubos indicados en el protocolo 22. Mantener los tejidos en 0.9% NaCl y a 4°C una vez aislados.
anterior.
83 84
23. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo

tamaño. Para exponer la mayor superficie posible del tejido al medio se
sugiere cortar en pedazos el trozo de tejido seleccionado.
24. Volver a pesar los tubos, pero ahora con los tejidos. Etiquetar tubos
25. Colocar los tubos en un baño de incubación con agitación moderada a 37°C y Añadir a cada tubo 1 mL 0.9% NaCl, excepto al W
se incuba por 30 min.
26. Añadir 47 mL de agua al tubo, mezclar y filtrar cada tubo. Se pesa el tejido que Realizar diluciones seriadas de insulina
queda en el filtro y el sobrenadante se utilizará para determinar la cantidad de (Excepto los tubos VI y W)
glucosa residual.
27. Debido a que sólo se necesita una pequeña fracción del volumen para medir el
contenido de glucosa residual, se puede tomar 1.2 mL de cada uno de los
sobrenadantes y guardarlo en un tubo de microfuga. Rotular los tubos y
almacenar congelado hasta su uso, siempre y cuando no se vaya a utilizar para
la determinación de glucosa en esa sesión.
28. Se determinará la cantidad de glucosa en la siguiente fase experimental.
Añadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa

Añadir a W _________µL de wormanina
Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.
-Distribuir en todos los tubos

-Pesar tejido
Incubar todos los tubos a 37°C/30 min
Tubos I al VI Tubo W
Añadir 0.5 mL Insulina 2000 µU/mL
+ 0.5 mL 0.9% NaCl
Incubar a 37°C/30 min
Tomar el tejido y pesarlo

Ajustar el volumen del sobrenadante añadiendo 47 mL de H2O
Guardar 1.2 a 1.5 mL sobrenadante en tubo de microfuga

Congelar
(Solamente si no se puede hacer en esa sesión la determinación de glucosa)
Determinar contenido de glucosa
85 86
- Solución B para determinación de glucosa. CuSO4 y H2SO4, ver preparación en

Figura 6.3. Protocolo de inducción de la toma de glucosa por insulina y determinación del efecto el apéndice.
Determinación
de wormanina endel
el contenido de glucosadetransportada.
proceso de transducción señales iniciado por insulina. - Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solución A + 1 parte de
Objetivos solución B. Prepararlo justo antes de usarlo.
− Conocer el fundamento de la determinación de glucosa, método de Nelson- - Reactivo de arsenomolibdato ((NH4)6Mo7O24, Na2HAsO4 y H2SO4). Ver
Somogyi. preparación en el apéndice.
− Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.
Introducción 1. Numerar los tubos de ensayo según se indica en la tabla 6.1.
Los carbohidratos son una de las fuentes principales de carbono y de energía en las 2. Descongelar los sobrenadantes y agitar.
células y los podemos encontrar en alimentos y en bebidas, así como también en la 3. Añadir los reactivos en la cantidad y orden señalados.
sangre. Dada la importancia de los carbohidratos, se han desarrollado varios métodos
para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen,
etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio. Tabla 6.1. Cantidades y orden en el que se realiza la cuantificación de carbohidratos
200ug/mL Sobrenadantes H2O RCuM NH4(AsMoO4)2 H2O Abs
ebullición por 10 min (tapar con canicas durante la

Todos los carbohidratos con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican Glucosa (mL) (mL) (mL) 520nm
como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles al calentarlos en
Mezclar bien y colocar los tubos en agua en

(mL)
Tubo
ebullición), enfriar en hielo y mezclar bien.

soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente
en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes. Por lo tanto, los carbohidratos en
solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y 1 - - 2.0 2.0 2.0 4.0
Fe(CN)63-, el carbohidrato oxidado forma mezclas complejas de ácidos. Esta acción 2 0.1 - 1.9 2.0 2.0 4.0
Curva patrón
reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como 3 0.2 - 1.8 2.0 2.0 4.0
cuantitativas. 4 0.3 - 1.7 2.0 2.0 4.0
5 0.4 - 1.6 2.0 2.0 4.0
Técnica de Nelson-Somogyi empleada desde 1952 para la determinación de actividad
6 0.5 - 1.5 2.0 2.0 4.0
de enzimas que degradan polisacáridos, es la que se usará en el protocolo. El método
utiliza como reactivos al Cu2+ y al arsenomolibdato, esté último un complejo formado I - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
cuando se hacen reaccionar al (NH4)6 Mo7O24, con el arsenato de sodio, Na2HAsO7. El II - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
Cu2+ es reducido a C1+ por el carbohidrato y luego el C1+ es reoxidado a Cu2+ en la III - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
reacción con el arsenomolibdato, éste último al reducirse cambia de color de amarillo a IV - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
azul. V - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
Tejido
VI - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
Material biológico W - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
Los sobrenadantes obtenidos anteriormente
Cálculo de la toma de glucosa por el tejido.
Material y equipo
a) Elaborar la curva patrón de la glucosa.
Tubos de microfuga
• Graficar absorbancia vs contenido de glucosa en µg.
1 Mechero
1 tela de alambre • Obtener los valores de ajuste o regresión lineal de la curva.
1 tripié b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recuerda la solución Krebs-Ringer
15 tubos de 16X150 tiene una cantidad inicial de glucosa.
13 Canicas c) Glucosa incorporada en los tejidos.
1 Gradilla para tubos de vidrio • Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes,
1 Propipeta utilizando los valores de regresión lineal obtenidos en el inciso a).
1 Micropipeta de capacidad 200-1000 µL • Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el
Caja de puntas para micropipeta 1000 µL inciso b) y la determinada para cada muestra problema.
6 Celdas de plástico • El resultado se divide entre el peso en gramos del tejido que se coloco en
Vórtex cada matraz correspondiente para obtener lo µg de glucosa transportada
Espectrofotómetro por gramo de tejido.
d) Realizar la gráfica de toma de glucosa (µg de glucosa incorporada/ g tejido) vs
Reactivos concentración de insulina y añadir en la misma gráfica el resultado de insulina
- Solución patrón de glucosa, 200 µg/mL. más wormanina.
- Solución A para determinación de glucosa. Contiene Na2CO3, tartrato de sodio y e) Interpretar los resultados.
potasio, NaHCO3 y Na2SO4, ver apéndice.
87 88
Cuestionario 7. APÉNDICE. PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
1. ¿Cuál es la función de la solución de Krebs-Ringer-Hepes en el experimento? SECCIÓN I. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

2. ¿Por qué el aislamiento del tejido debe ser rápido? Determinación de concentración de proteínas por Lowry y Absorbancia a 280 nm
3. ¿Qué se esta removiendo al lavar el hígado con solución salina?
4. En el sistema experimental que utilizamos, ¿qué componente representa la Solución Método de preparación Comentarios
sangre? Solución de carbonato- Pesar y disolver 10 g de Na2CO3 en un Es estable 2 meses a temperatura
5. ¿Cuáles son los procesos celulares que se están evaluando en el tejido tartrato y cobre (CTC) volumen aproximado de 60 mL, todavía en ambiente.
incubado o no con insulina? agitación añadir 0.1 g de CuSO4 y 0.2 g de
tartrato de Na+ y K+, añadir H2O cuanto baste
6. ¿Cuál es el metabolito que se debe cuantificar para la determinar si la insulina para 100 mL
tiene o no efecto en el transporte? 10% Dodecil sulfato de sodio 10 g de SDS y disolver con H2O Usar cubrebocas para su preparación.
7. ¿Dónde se cuantifica este metabolito? (SDS o también llamado No almacenar en frío ya que se precipita
8. Describa la reacción química que utiliza para cuantificarlo. lauril sulfato de sodio) a temperaturas menores de 17°C, pero
9. ¿Qué efecto produce la wormanina en la toma de glucosa por los tejidos? se redisuelve si la temperatura se eleva.
10. Elabore una gráfica comparativa del efecto de insulina en la captación de 0.8 NaOH 3.2 g NaOH para 1000 mL
glucosa por los diferentes tejidos. Reactivo A Mezclar con partes iguales de CTC, 10% Se prepara antes de usarse
11. Analice la gráfica anterior. SDS, NaOH, 0.8 N y H2O
Reactivo B Dilución del reactivo Folin Ciocalteau.
1 Folin Ciocalteau + 5 H2O
Referencias Solución estándar de Pesar 100 mg y disolver en 100 mL de agua Guardar la solución en alícuotas a –20°C
albúmina de suero bovino destilada.
• Brady MJ, Saltiel AR. 2001. Insulin and glucagon. Encyclopedia of Life Science.
1mg/mL
John Wiley & Sons, Ltd. DOI: 10.1038/npg.els.0000638
SECCIÓN II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.
• Devlin TM. 1997. Textbook of biochemistry with clinical correlations. 4ta. Ed Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.
John Willey & Sons, INC. Biochemistry of hormones I: polypeptide hormones Parte I. Extracción y precipitación por salado
Pp 878-883. Localización QP514.2 Solución Método de preparación Comentarios
• Hashiramoto M, James D. 2000. Characterization of insulin-responsive GLUT4 0.03M KOH Pesar 1.6833 g de KOH para 1L Solución por grupo
storage vesicles isolated from 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular Guardar a 4°C.
biology 20, 416–427.
• Román-Palacios R. 1998. Regulación metabólica. Departamento de Parte II. Desalado y purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad
Bioquímica, Facultad de Química, UNAM. Solución Método de preparación Comentarios
• Svetlana E, 2001. Impaired muscle glycogen synthase in type 2 diabetes is 2.5 % Sephadex-G25 (p/V) Hidratar 10 g Sefadex-G-25 con 160 mL de El sefadex hidratado se puede
agua estéril durante 24 h a 4ºC. Cantidad almacenar a 4°C por al menos un mes.
associated with diminished phosphatidylinositol 3-kinase activation. The Journal
que alcanza como para 50 columnas. Los laboratoristas entregarán una
of Clinical Endocrinology and Metabolism 86, 4307–4314. columna empacada con sefadex/equipo.
• Voet y JG Voet Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ Enpacado de la columna con A una columna de cromatografía se 1. Cada vez que se centrifuga la
specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp785-794. Sephadex G-25 le adicionan 2.0 mL de la columna, es importante revisar que
suspensión de Sephadex-G25. no se hayan producido burbujas y
Centrifugar a 3,000 rpm durante 5 que el flujo del líquido sea
min, o esperar a que el líquido constante.
drene de la columna. Repetir la 2. Las columnas se pueden reusar
operación hasta que la columna varias veces, mantenerlas
llegue a un volumen final de 1 mL. húmedas, tapadas con parafilm y a
4°C. Lavarlas antes de usar.
Amortiguador Tris-β- Para 104 mL disolver 0.126 g Tris en un Se usará para preparar dos soluciones
mercaptoetanol (10 mM de poco menos de 90 mL de agua destilada, distintas ver abajo.
Tris/HCl pH 8.8; 0.5 mM β- ajustar el pH a 8.8 con HCl, después
Mercaptoetanol) adicionar 3.6 µL de β-Mercaptoetanol y
ajustar el volumen a 104 mL con agua
destilada.
400mM PMSF Disolver 0.209 g de PMSF en 3 mL de 1. El PMSF; se añade justo antes de
etanol, mezclar bien y almacenar en usarse.
microtubos de centrífuga a -20°C. 2. Proporcionar por grupo 250 µL de 400
mM PMSF.
Amortiguador Tris-β- 84 mL / grupo Para 13 mL de amortiguador los
mercaptoetanol-PMSF (10 A 4 equipos entregarles alícuotas de 13 mL estudiantes añadirán 32.5 µL de 400 mM
89 90
mM de Tris/HCl pH 8.8; 0.5 de Tris-β-mercaptoetanol a los otros 4 PMSF. Para 8 mL añadir 20 µL de 400 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 Para 200 mL pesar 12.114 g de Tris. Ajustar Almacenar a temperatura ambiente.
mM β-Mercaptoetanol y 1 equipos darles 8 mL a cada uno y además mM PMSF. el pH con HCl.
mM PMSF). proporcionar una solución stock de 10% SDS 1 g de SDS para 10 mL de agua destilada Pesar usando cubrebocas.
PMSF/grupo para añadirle al amortiguador. No colocar en frío.
Macro-Prep High S support Lavar la matriz con 2 a 3 volúmenes del Proporcionar lavada a los estudiantes Amortiguador de muestra 350 µL de 1M Tris base. Almacenar a –20 0C
(BIORAD) amortiguador de equilibrio (de preferencia
250 µL al 20% SDS.
esterilizar antes el amortiguador). Guardar a
160 µL de 1 M ditiotreitol (DTT).
4°C.
150µL al 50% Glicerol.
Amortiguador de equilibrio 8 mL/ equipo Se sugiere hacer los stocks de 1 M 20 µL de azul de bromofenol (20%).
(50 mM de fosfatos pH 7.0) K2HPO4 y 1M NaH2PO4, ya que también 70 µL de H2O.
Mezclar 30.75 mL 1M K2HPO4 y 19.25 mL se utilizará amortiguador de fosfatos en Hacerlo y almacenarlo en tubos de microfuga
de 1M NaH2PO4 y ajustar el volumen a 1 L la parte de cinética enzimática. Se de 1.5 mL.
(solución suficiente para 8 grupos y para almacenan por al menos 1 mes a 4°C. Amortiguador de corrida -Preparar un stock a 5X Almacenar a 40C, el reactivo dura al
lavar la matriz). 1M NaH2PO4ּH2O, para preparar 100 mL 0.25N Tris Base, 1.9M Glicina, 0.5 % SDS menos un año en stock al 5X y en la
pesar 13.79 g (30.285 g Tris; 142.62 g Glicina, 5 g SDS solución de trabajo (1X) se puede
1M K2HPO4 pesar 17.41 y ajustar a 100 para 1L) reutilizar hasta que la solución cambie a
mL -Tomar 200mL del amortiguador 5X y llevarlo un color amarillo.
Matriz Cibacrón-blue agarosa Lavar la matriz con 2 a 3 volúmenes del Guardar a 4°C. a 1L.
presentación en suspensión amortiguador Tris-β-mercaptoetanol (de Entregar en un frasco al profesor 16-20 Solución teñidora 0.125% (p/v) azul de Coomasie Blue R250. Solución reutilizable
(SIGMA C1535) preferencia esterilizar antes el amortiguador). mL de matriz ya lavada. 50% (v/v) metanol.
Amortiguador de elución I 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y Almacenar a 4°C. 10% (v/v) ácido acético
1 M de NaCl. Solución desteñidora 45% Metanol.
Mezclar 7.7 mL 1M K2HPO4 y 3.85 mL de 10% ácido acético
1M NaH2PO4 en un volumen menor 200 mL, SECCIÓN III. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
añadir 11.7 g de NaCl, disolver y ajustar el
volumen a 200 mL. Parte I: Curvas temporales de actividad enzimática de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de
Amortiguador de elución II 50 mM de amortiguador de fosfatos ajustado bovino.
con H3PO4 a pH 3.0 Solución Método de preparación Comentarios
Amortiguador de NAD+ 20mL/ 4 equipos (solución que se entrega Disolver el NAD+ justo antes de 1 M Amortiguador de fosfatos Mezclar 30.75 mL de K2HPO4 1M y 19.25 mL Guardar a 4°C.
(10 mM de Tris-HCl pH 8.8, por grupo) usarse. pH 7.0 de NaH2PO4 1M y aforar a 500 mL. Solución
0.5 mM de β-mercaptoetanol Repartir 20 mL de Tris-β-mercaptoetanol y suficiente para todo un semestre.
y 5 mM de NAD+). proporcionar 0.0018 g de NAD+ 10 mM Piruvato de sodio Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0022g de Reactivo que debe ser preparado justo
piruvato de sodio. antes de usarlo.
Parte III. Determinación de concentración de proteínas y separación por electroforesis en gel de poliacrilamida-
SDS 4 mM NADH. Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0054g de Reactivo que debe de disolverse justo
NADH. antes de usarlo.
Solución Método de preparación Comentarios
Reactivo de Bradford Reactivo preparado (SIGMA) Guardar a 4°C.
SECCIÓN V: ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Solución estándar de pesar 0.1g de BSA en un tubo microfuga, y Guardar a –20°C
albúmina de suero bovino disolverla en 1 mL de H2O bidestilada. Tomar Transferencia de material genético I: Conjugación
(BSA) 0.1mg/mL. 100 µL de la solución de BSA 100 mg/mL Solución Método de preparación Comentarios
colocarla en un tubo para microfuga y Cultivo de E. coli JM1452StrR Cultivada por una noche en caldo Luria a Proporcionada por el cepario.
añadirle 900 µL de H2O bidestilada, la (cepa receptora) 37ºC. Se solicitan al inicio del semestre. Se
solución quedo 10 mg/mL. Volver ha hacer intercambian tubos por los tubos por
una dilución 1:10 para obtener una solución cultivo de bacterias.
de 1 mg/mL de BSA. Por último volver ha Cultivo de E. coli Cultivada por una noche en caldo Luria a Proporcionada por el cepario.
hacer una dilución 1:10 para obtener una W3110/F´KmTn3 37ºC. Se solicitan al inicio del semestre. Se
solución de 0.1 mg/mL de BSA. Esta es la (cepa donadora) intercambian tubos por los tubos por
solución de referencia. cultivo de bacterias.
Luria líquido Medio Luria líquido en tubos para realizar Almacenar a 4°C.
Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS conjugación
Solución Método de preparación Comentarios 5 cajas Petri con medio Una vez esterilizado el medio líquido o en Almacenar a 4°C.
Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% Precaución. La acrilamida es un Luria-agar-2% estreptomicina agar en autoclave a 121°C, dejar enfriar a
N’N’metilen-bisacrilamida, disuelto en agua. neurotóxico y es absorbido por la piel. (25 µg/ml) 50-55°C antes de adicionar el antibiótico par
Usar guantes al manipularlo. evitar que sea inactivado por el calor.
2 M Tris /HCl pH 8.8 Para 200 mL pesar 48.45 g de Tris. Ajustar el Almacenar a temperatura ambiente. Preparar una solución de 20 mg/mL de
pH con HCl. sulfato de estreptomicina en agua. Esterilizar
por filtración y guardar en alícuotas a –20°C.
Adicionar al medio estéril enfriado a 50-55°C
91 92
para tener una concentración final de 25

µg/mL 3 M Acetato de potasio Para una solución 3M de acetato de potasio; Mantener a -20°C
2 cajas Petri con medio Una vez esterilizado el medio líquido o en Almacenar a 4°C. pH 4.8 A 60 mL de acetato de potasio adicionar 11.5
Luria-agar-2% sulfato de agar en autoclave a 121°C, dejar enfriar a mL de ácido acético y 28.5 mL de H2O
kanamicina (30 µg/ml) 50-55°C antes de adicionar el antibiótico par 70% Etanol Para 100mL de solución de etanol al 70%, se Mantener a -20°C
evitar que sea inactivado por el calor. mezclan 70 mL de etanol y 30 mL de agua
Preparar una solución de 25 mg/mL de 10 N NaOH Para 10 mL de solución NaOH 10 N, se
sulfato de kanamicina en agua. Esterilizar por pesan 0.4 g de NaOH.
filtración y guardar en alícuotas a –20°C. 10% SDS Disolver 10 g de SDS en 100 mL de agua Utilizar cubre bocas para su preparación.
Adicionar al medio estéril enfriado a 50-55°C destilada No almacenar en frío
para tener una concentración final de 30
Solución de lisis (0.2 N Tomar 10 µL de 10 N NaOH y 50 µL 10% Los alumnos la preparan justo antes de
µg/mL NaOH y 1% SDS p/v) usarla.
SDS, aforar con agua destilada.
500 µL
Transferencia de material genético II: Transformación
Células competentes de E. Se describe la técnica para preparar 200 µL Los laboratoristas entregaran los tubos Transferencia de material genético II: Ensayos de restricción de plásmido.
coli de las células competentes: de microfuga con las células Solución Método de preparación Comentarios
− Inocular 3 mL de medio Luria con competentes congeladas. NdeI 100U/µL Marca Fermenta. Viene Guardar a –20°C.
E. coli BL21 y se deja crecer en acompañada la enzima con un vial que Será proporcionada por el laboratorio
agitación toda la noche a 37°C. contiene el amortiguador TANGO.
− Tomar 0.2 mL del precultivo y BamH1 10U/µL Marca Fermenta Guardar a –20°C.
agregárselo a 10 mL de medio Será proporcionada por el laboratorio
Luria. Las bacterias se dejan crecer
TAE 1X Preparación para TAE 50X, pesar 242 g Tris Almacenar a temperatura ambiente.
hasta llegar a una absorbencia de
base, 57.1 mL ácido acético glaciar y 100 mL Diluir y proporcionar a los alumnos el
0.6 a 0.8 (lectura a 600 nm).
de 0.5 M de EDTA (pH 8). Aforar a 1L TAE 1X.
− Centrifugar la suspensión de
Bromuro de etidio 10 mg/mL Marca Gibco BRL. Ya viene preparado a la concentración
células a 5000 rpm durante 5 min a
sugerida.
4°C. Descartar sobrenadante Manejar con mucho cuidado, reactivo
− Resuspender el paquete celular mutagénico
muy bien en 3 mL de NaCl 10 mm
isotónico frío. Transferencia de material genético II: Inducción de proteína recombinante.
− Centrifugar a 5000 rpm durante 5 Solución Método de preparación Comentarios
min a 4°C. Descartar el IPTG Para 1 mL de solución 100 mM de IPTG, se Almacenar a –20°C
sobrenadante y resuspender el pesan 0.0238 g de IPTG.
precipitado en 5 mL de CaCl2 30 SECCIÓN VI: REGULACIÓN DEL METABOLISMO
mm frío. Parte I: Operón de la lactosa
− Dejar incubando en hielo por 20
min con agitación ocasional suave Solución Método de preparación Comentarios
y centrifugar a 2500 rpm por 7 min. Cultivo de E. coli W3110 en Proporcionado por el cepario.
El precipitado debe ser de forma medio M9-glicerol. Se solicitan al inicio del semestre. Se
anular. intercambian tubos limpios por los tubos
− Resuspender el precipitado en con cultivo de bacterias.
0.5mL de CaCl2 30 mM frío. Tomar 4 mL medio M9-glicerol Preparación de Sales M9 10X 60g Cada una de las soluciones deberá
0.2 mL y pasarlo a un tubo estéril Na2HPO4 30 g esterilizarse por separado por filtración.
microfuga. KH2PO4 5 g La mezcla deberá hacerse en
Plásmido PET-TEM-1 Se prepara de acuerdo al protocolo que se Se entregará la preparación de plásmido NaCl 5 g condiciones de esterilidad.
encuentra en la sección V, Parte II: aislada de un cultivo reciente. NH4Cl 10 g
Obtención del plásmido. Entregar en alícuotas en tubos de H2O cuanto baste para 1L, esterilizar la
Microfuga solución en autoclave a 121°C, dejar enfria a
Medio LB/Kanamicina Para 200 mL de medio líquido se adicionan Guardar el stock de Kanamicina a –20°C 50-55°C antes de adicionar el resto de
(30 µg/mL) el volumen necesario de un stock 25 mg/mL
soluciones.
Kanamicina
Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. Guardar a 4°C Sales M9 10X 100 mL
Glicerol 20% 10 mL
MgSO4 0.1M 10 mL
Transferencia de material genético II: Aislamiento de plásmidos CaCl2 0.01M 10 mL
Solución Método de preparación Comentarios H2O estéril c.b.p. 1L.
Solución GTE 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y Mantener a 4°C Solución de glucosa al 2% Preparar las soluciones y luego filtrar
EDTA 10 mM pH 8.0. estéril para esterilizar.
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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010
No esterilizar en autoclave.
Solución de lactosa al 2% Preparar las soluciones y luego filtrar
estéril para esterilizar.
Solución de glucosa 2% + Preparar las soluciones y luego filtrar
lactosa 2% estéril para esterilizar.
Amortiguador Z (Na2HPO4- Na2HPO4-7H2O 16.1g, NaH2PO4-H2O 5.5 g,
7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O KCl 0.75 g, MgSO4-7H2O 0.264 g, β-
40 mM, KCl 10 mM, MgSO4- mercaptoetanol 2.7 mL, disolver en menos de
7H2O 1mM, β- 1 L de agua, ajustar el pH 7.0 y aforar a 1 L.
mercaptoetanol 50 mM, pH
7.0)
Reactivo ONPG (0.1% de o- Disolver 0.2 g en 50 ml de solución
nitrofenil-β-galactósido) amortiguadora Z
SDS al 0.1% Disolver 0.1 g en 100 mL de agua destilado Usar cubrebocas al preparar el reactivo.
Almacenar a temperatura ambiente.
Na2CO3 1M
Parte II: Regulación hormonal del metabolismo de la glucosa

Solución Krebs-Ringer- Para 250 mL disolver 1.89 g NaCl, 0.093g Almacenar a 4°C
Glucosa-Hepes (130mM KCl, 0.040g KH2PO4, 0.122g MgSO4 . 7 H2O,
NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM 0.45 g glucosa, 0.036g CaCl2 . 2 H2O, 0.5 g
KH2PO4, 2mM MgSO4 . 7 de BSA y 10 mL de HEPES de un stock de
H2O, 10 mM Glucosa, 1 mM 500 mM ( o bien calcular el peso para 20 mM
CaCl2. 2 H2O, 0.2% BSA y 20 y disolver) ajustar a pH 7.0
mM HEPES).
Solución de insulina 2000 Dependiendo de la presentación habrá que Depende de la presentación, se
µU/mL calcular la dilución. almacena a 4°C o –20°C.
Solución patrón de glucosa, Pesar 0.02 g de glucosa y disolverlo en 100 Almacenar a –20°C.
200 µg/mL. mL de agua destilada, guardar en alícuotas.
Solución A para 12.5 g carbonato de sodio anhidro + 12.5 g Proporcionado en alícuotas por el
determinación de glucosa tartrato de sodio y potasio +10 g bicarbonato laboratorio.
de sodio +100 g sulfato de sodio anhidro y se
lleva a 500 mL con agua destilada
Solución B para 7.5 g sulfato de cobre en 50 mL de agua Proporcionado en alícuotas por el
determinación de glucosa destilada + 50 µL H2SO4 concentrado laboratorio.
el Reactivo de cobre 24 partes de solución A + 1 parte de solución Los estudiantes lo prepararan en el
mezclado (RCuM): B. momento
Reactivo de arsenomolibdato • Disolver 25 g de (NH4)6Mo7O24 en La solución debe presentar una
450 mL de agua destilada añadir coloración amarilla, de lo contrario
21 mL de ácido H2SO4 desechar.
concentrado. Repartir por equipo 28 mL
• Disolver por separado 3 g de
Na2HAsO4·7H2O en 25 mL de agua
destilada.
Mezclar ambos reactivos y colocar en un
frasco ámbar, incubar a 37°C durante 24 h,
no agitar.
4 µM Wormanina Se recomienda disolver el contenido total de Almacenar a –20°C.
un vial que contiene 0.25 mg en 1 mL de
DMSO. Después de esa solución que queda
a 583.8 µM tomar 34 µL y añadírselos a 5
mL DMSO, así la solución final queda a 4
µM. Por grupo usaran 450 µL de 4 µM
wormanina
95

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0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010 0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010

CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)

La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende

Aλ= aλbc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)

Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por

450 µL ⎯ ⎯ 500 µL 250 µL

1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la

Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de iones, fenómeno

Distribuir en tubos de centrífuga

Añadir ________g (NH4)2SO4 (75% saturación)

Distribuir en tubos de centrífuga

PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO

Purificación por cromatografía de afinidad

NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 mL de agua estéril y se guarda la

C. Purificación por cromatografía de afinidad.

Sitios recomendados para Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico.

Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. 1 Recipiente para hielo

Adición de muestras y corrida

Figura 2.6 Aplicación de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.

Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un método para identificar y monitorear

Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa.

3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversión.

6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la práctica

Sitios recomendados para 4. GENÉTICA

Enfermedades genéticas y la herencia mendeliana

La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia de material genético, en el que la

Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN

Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque

Desarrollo experimental (Figura 5.5)

Adicionar sol. de acetato de potasio fría

Adicionar isopropanol (v/v)

Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.

Añadir etanol al 70%, agitar en vórtex

Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril.

61 62 plasmídico a partir de las células

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:

EcoRI HindIII HaeIII

Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

La producción de la proteína recombinante en una organismo no relacionado, como se mencionó

1. ¿Qué es una proteína recombinante?

Figura 5.8. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli.

pegue al operador. La subsecuente unión de la RNA polimerasa al promotor ocasiona

Objetivos La presencia o ausencia de la lactosa no es el único factor que influye sobre la

Desarrollo de la práctica (Figura 6.1)

Resuspender el paquete celular en 250 µL amortiguador

Añadir 25 µL de CHCl3 + 12.5 µL SDS 0.1%

Añadir 50 µL de reactivo ONPG

Añadir 125 µL Na2CO3 1 M

Observar la intensidad de color amarillo o leer la Abs 420 nm

Figura 6.1. Protocolo de inducción de expresión de los genes involucrados en la utilización de

• Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.868-873.

La insulina tiene un papel importante en la regulación de la homeostasis de la glucosa

Inducción de toma de glucosa por insulina (Figura 6.4)

Preincubación del tejido con wormanina y posteriormente la incubación con

Obtención de tejido adiposo I. 1000 µU

23. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo

Añadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa

Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.

-Distribuir en todos los tubos

Incubar todos los tubos a 37°C/30 min

Incubar a 37°C/30 min