1. Capaian Pembelajaran
Setelah menyelesaikan proses pembelajaran 6.2 pada modul ini, mahasiswa
diharapkan memiliki kemampuan :
a. Menjelaskan tentang prinsip dasar kromatografi penukar ion.
b. Memahami prinsip dasar kromatografi filtrasi gel
Untuk membantu Anda dalam mencapai tujuan-tujuan tersebut, dalam modul
ini akan disajikan uraian, latihan (pengayaan) dan rambu-rambu jawaban serta soal
evaluasi. Agar anda dapat belajar dengan baik dalam mempelajari modul ini, lakukanlah
hal-hal berikut :
a. Pelajarilah dengan cermat semua uraian yang tercantum dalam masing-masing proses
pembelajaran.
b. Kerjakanlah soal-soal latihan (pengayaan) yang terdapat dalam setiap proses
pembelajaran dengan berusaha tanpa melihat dahulu rambu-rambu jawabannya. Setelah
Anda selesai mengerjakan soal-soal tersebut, cocokkanlah pekerjaan anda dengan
rambu-rambu jawaban yang tersedia. Bila pekerjaan Anda masih jauh menyimpang dari
rambu-rambu jawaban, hendaknya Anda tidak berputus asa untuk mempelajarinya
kembali.
c. Dalam setiap proses pembelajaran diakhiri dengan intisari (rangkuman) yang merupakan
sari pati dari uraian yang telah disajikan. Bacalah dengan seksama isi rangkuman
tersebut sehingga pengalaman belajar Anda benar-benar mantap.
d. Evaluasi (tes formatif) yang disusun setelah rangkuman merupakan tes yang diberikan
untuk mengukur penguasaan Anda dalam pokok bahasan yang telah dipaparkan dalam
proses pembelajaran. Hasil anda dalam tes formatif tersebut digunakan sebagai dasar
penentuan apakah Anda sudah dapat melanjutkan ke proses pembelajaran berikutnya
ataukah masih perlu mengulang. Seberapa jauh tingkat penguasaan Anda, dapat Anda
hitung sendiri dengan rumus sederhana yang dicantumkan pada setiap akhir tes
formatif.
Beberapa tipe struktur resin yang dipakai seperti yang terlihat pada Gb.III.10,
yaitu microreticular, macroreticular, pellicular, dan superficially porous. Karena ukuran
pori yang kecil, resin mikroporous (a) mempunyai kelemahan dapat menghambat transport
molekul yang besar kedalam matriks dan juga ke gugus fungsional, oleh karena itu bentuk
makroporous (b) yang selain memiliki pori yang kecil juga mempunyai pori yang besar
dan berbagai kanal, dapat mengatasi kelamahannya.
Untuk mempercepat proses difusi dalam partikel telah dibuat juga bentuk
pellicular (c) dan superficially porous (d) dengan penyangga glass bead. Keuntungan
digunakan tipe ini ialah dapat dihindari terjadinya pembengkakan dan terjadinya
perbedaan tekanan dalam kolom (pressure drop) selama operasi. Kelemahannya ialah
karena kapasitasnya jauh lebih kecil. Misalnya tipe polisterin mempunyai kapasitas 1000-
5000 Eq/g, pelliculer dan silica bead, hanya mempunyai kapasitas 1-60 dan 1-500 Eq/g.
Gambar : Beberapa tipe struktur resin. Microreticular (a), macroreticular (b), pellicular (c),
superficially porous (d). (Kraak, 1982)
Penukar ion dapat berfungsi bila berada dalam bentuk ion/bermuatan. Jumlah
fraksi gugus fungsional yang ada dalam bentuk ion / bermuatan tersebut dapat dipengaruhi
oleh pH dari fase mobil. Seperti yang ditunjukkan pada GB.III.11, bahwa jumlah fraksi
yang mengion / bermuatan dari sulfonat dan amin kuaterner tidak terpengaruh pada kisaran
pH yang luas. Sebaliknya penukar kation dan anion yang lemah, jumlah fraksi gugus
fungsional yang bermuatan secara nyata antara pH 4 dan 8.
Perhatian dalam Preparasi Kolom
Pemilihan dan preparasi resin
Sifat – sifat yang perliu diperhatikan dalam membeli resin dalam perdagangan
ialah ukuran partikel (mesh), tingkat ikatan silang, dan kulitasnya (Analytical Grade: AG ).
Resin AG umumnya telah mengalami perlakuan pendahuluan secara teliti seperti
penyeragaman ukur dan penyucian untuk menghilangkan zat-zat oganik/anorganik asing.
Regenerasi dapat dilakukan dengan mengubah bentuk H (R -H+) menjadi bentuk
Na (R-Na+) dengan pencucian memakai NaCl sampai air cucian netral. Berat resin perlu
diketahui untuk menetukan kapasitasnya. Keringkan resin sebelumnya sampai kadar air
tertentu. Sebelum dipakai harus diseimbangkan dengan air dengan cara pencelupan pada
waktu yang cukup. Setelah resin mengendap, partikel-partikel yang mengambang dibuang.
Pembengkakan (swelling)
Bila penukar ion, misalnya resin yang tersulfonasi diberi air, gugus –SO3- dan H+
seolah-olah terlarut dalam konsentrasi yang tinggi dalam matriks. Karenanya air bertendensi
untuk mendifusi kedalam matriks. Hal ini dapat menyebabkan terjadinya pembengkakan.
Bila pembengkakan terjadi dalam kolom kaca yang telah diisi dengan padat, bahaya pecah
dapat terjadi karena pembengkakan. Sebelum sampel dimasukkan kolom, biasanya penukar
ion (kation) diubah dalam bentuk asam (R-H+) dengan pencucian menggunakan HCl.
Sifat-sifat penting dari penukar ion dapat disingkatkan sebagai berikut:
a. Besar partikel dapat mempengaruhi kecepatan dan pertukaran permiabilitas kolom.
b. Derajat ikatan silang dapat mempengaruhi porositas, kekekaran (rigidity), dan
pembengkakan.
c. Kekuatan gugus fungsional dapat memprngaruhi koefisien distribusi.
d. Banyak gugus fungsional dapat menentukan kapasitas resin.
Kapasitas kolom
Kapasitas penukar ion akan memepengaruhi banyaknya samoel maksimumyang
dapat dianalisis dan dipakai untuk mengetahui stabilitas resin. Cara mengukur kapasitas
penukar kation ialah denag mengubah menjadi bentu H, kemudian dicuci dengan NaCl
sampai netral. Jumalah asam yang tercuci yang dapat diketahui dengan titrasi, akan
merupakan kapasitas kolom. Resin umumnya mempunyai kapasitas 1-5 meq/mL.
Cara deteksi
Kesukaran mendeteksi terutama bila sampelnya sangat kecil. Pencatatan
(recording) secara kontinyu jarang dipakai, meskipun demikian untuk hal-hal yang khusus
digunakan: absorpsi sinar, ideks refraksi, pH, radioaktivitas dan pengukuran polarografik.
Penggunaan Kromatografi Penukar Ion
1. Untuk menghilangkan ion
Cara ini umum digunakan untuk menghilangkan kesadahan air untuk rumah
tanggadan berbagai keperluan yang lain. Ion-ion Ca, Mg, Fe,dan yang mempunyai valensi
lebih besar dari satu dapat digantikan dengan ion Na. Air yang kesadahannya sudah
hilang dengan demikian hanya mengandung ion Na yang tidak mengganggu untuk
keperluan rumah tangga. Resinnya dapat diregenerasi agar dapat aktif kembali.
Untuk menghilangkan ion-ion keseluruhannya, air tersebut dapat dialirkan melalui
penukar katio, kemudian dialirkan meleluin penukar anion, yang akan menghilangkan
semua anion dan diganti dengan ion hidroksida.
Bila kedua resin tersebut (anion dan kation) dijadikan satu, penghilangan kedua jenis ion
tersebut sekaligus dapat dikerjakan. Selain itu dapat menghindari menjadinya terlalu asam
dan basis dengan perlakuan yang terpisah. Kelemahan deionisasi ialah karena cara ini
tidak dapat menghilangkan senyawa-senyawa asing yang nonelektrolit. Karenanya airny
masih tidak murni.
Cara penukaran ion ini juga perlu untuk memurnikan atau menghilangkan garam-garam
yang terdapat dalam zat-zat organik atau campuran senyawa-senyawa biokimia.
2. Mengkonsentrasikan komponen berkadar kecil
Ion-ion yang jumlahnya kecil (trace element) dapat dikonsentrasikan denagn penukar ion.
Setelah ion solut terikat dalam kolom, kemudian dielusi dangan jumlah eluen yang kecil.
3. Pemisah asam-asam amino
Manfaat penukar ion yang paling penting ialah untuk pemisahan asam-asam
amino. Asam-asam amino mempunyai sifat amfotir sehingga dapar diubah muatannya
atau dihilangkan sama sekali, sehingga pemisahan dengan penukar ion dimungkinkan.
Pada suatu pH, asam-asam amino dapat dipisahkan menjadi tiga golongan berdasarkan
titik isoelektrisnya. Dengan demikian campuran asam-asam amino dapat dipisahkan
dalam suatu aliran fase mobil dengan secara gradual dengan merubah pH untuk elusi
(gradient elusion). Perubahan pH ini sering dikombinasikan dengan perubahan suhu.
Ada beberapa contoh yaitu :
1. Pemisahan ion logam
Selain dapat berfungsi sebagai pembersih ion-ion yang ada dalam air sadah,
penukar ion dapat juga dipakai untuk memisahkan campuran ion dan menetukan
kandungan masing-masing komponennya, misalnya kandungan kation yang ada dalam air.
Gambar di bawah ini menunjukkan kromatogram ion Cd, Li, Na, dan K. Pemisahan
tersebut dikerjakan dalam kolom 37cm x 2,4cm dengan isian Dowex 50. Maing-masing
kation tersebut mempunyai konsentrasi 0,2 mM. Elusi dikerjakan dengan larutan 0,2 M
HCl dengan kecepatan 0,55 cm/menit.
Gambar : pemisahan campuran ion Cd, Li, Na, dan K dengan dowex 50. Ion Mg keluar
setelah 650 mL eluen.
Pada gambar di atas terlihat, bahwa pemisahan mempunyai resolusi yang baik,
konsentrasi HCl 0,7 M dapat dianggap merupakan konsentrasi yang tepat, dengan
memberikan ion H+ yang cukup untuk berkompetisi dengan campuran kation yang ada.
2. Mengukur kadar ion
Penukar ion dapat dipakai untuk mengukur kadar suatu ion atau zat yang mencampuri
gula pasir, misalnya dengan kalium nitrat. Untuk menentukan kadar kalium nitrat dalam
gula tersebut dapat dikerjakan sebagai berikut :
Tiga ratus gram sampel gula yang mengandung KNO3 tersebutdilarutkan dalam air 100
mL. Larutan tersebut kemudian dialirkan emlalui penukar kation yang ada dalam bnetuk
H. Eluen yang keluar untuk mengetahui ion K dapat dititrasi dengan misalnya 0,01 N
NaOH, misalnya membutuhkan 5,3 mL. Kandungan KNO3 dapat dihitung berdasarkan
reaksi :
H-+K+ → K-+H+
H++OH- → H2O
NaOH → Na++OH-
0,01 NaOH 5,3 mL = 0,053 meq
KNO3 = 0,053 meq
= (3,91 + 14 + 48)(0,053)mg
= 5,36bmg
Jadi kandungan KNO3 = 1,75 mg / 100 g gula.
b. Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi ini dipakai untuk pemisahan campuran senyawa berdasarkan baerat
molekulnya, terutama senyawa-senyawa yang mempunyai berat molekul yang besar.
Pemisahannya berdasarkan besarnya molekul, karena melalui kolom yang berisi bahan isian
yang bersifat ayakan atau filtrasi. Oleh karena itu, cara ini dinamakan Kromatografi Filtrasi
Gel (Gel filtration Chromatography), oleh ahli-ahli kimia polimer. Proses adsorbsi dapat juga
mempunyai muatan pada pemukaannya.
Gel merupakan struktur jaringan tiga dimensi yang terbentuk karena adanya ikatan
silang yang terjadi dalam proses polimerisasi. Tergantung derajad atau banyaknya ikatan
silang dalam struktur gel, gel tersebut secara selektif dapat mengeksklusikan molekul-melekul
yang besar dari lubang-lubang yang dimilikinya. Jadi molakul yang lebih besar dari ukuran
pori akan mengalami eksklusi, sedang yang lebih kecil akan masuk melalui pori di dalam
struktur gel tersebut.
Beberapa tipe gel
1. Sephadex
Tipe gel ini banyak dipakai untuk pemisahan protein dan senyawa-senyawa yang berberat
molekul besar. Sephadex dibuat dari polisakarida dextran. Karena setiap residu glukosa
mempunyai tiga gugus OH, maka dextran merupakan molekul yang polar. Pembentukan iktan
silang dengan mereaksikan dengan epiklorhidrin : H2C-CH CH2 Cl.
Jumlah ikata silang dapat diatur, sehingga besarnya pori dapat juga ditentukan. Gel
sephadex tidak larut dalam air, tahan yang lemah. Tetapi bila diekspose pada waktu yang
lama akan pecah. Penggunaan pada suhu di atas 120 oC juga harus dihindari. Berbagai jenis
sephadex beserta sifat-sifatnya dapat dilihat pada tabel III.2 di bawah ini.
Tabel III.2: Berbagai jenis sephadex dan batas eksklusinya
Jenis Air yang dapat terikat, Batas eksklusi Variasi Fraksinasi
g/g kering (BM) (BM)
G-10 1,0 700 Sampai 700
G-25 2,5 5.000 100-500
G-50 5,0 10.000 500-10.000
G-75 7,5 50.000 1.000-100.000
G-100 10,0 100.000 5.000-100.000
G-200 20,0 200.000 5.000-200.000
2. Bio Gel
Jenis ini merupakan gel yang lebih inert, dinamakan Bio-Gel P dan dibuat dari
kopolimerisasi venil-amid dan N,N – metilen biakrilamid. Polimer ini tidak larut dalam air
dan zat pelarut organik, dan dapat digunakan pada pH antara 2 – 11. pH yang lebih tinggi
akan menghidrolisis gugus amidnya. Matriks poliakrilamid mengurangi kemungkinan
terjadinya berbagai jenis Bio-Gel P dengan batas eksklusi antara 1800-400.000.
3. Agarose
Gel ini dipakai untuk pemisahan senyawa dengan berat molekul (BM) di atas 500.000.
Agarose diberi nama juga Sepharose dan Bio-Gel A. Gel ini dibuat dari poligalaktopiranose
dalam bentuk bead yang agak lunak yang tidak tahan terhadap tekanan yang tinggi.
4. Porous Glass
Jenis ini baik untuk digunakan dengan tekanan yang tinggi. Dalam perdagangan diberi
nama Porosil atau Bio-Glass, dengan ukuran pori yang akurat.
5. Styragel
Jenis ini untuk pemisahan yang sama sekali tidak menggunakan air, dan merupakan gel
yang dapat membengkak dengan zat pelarut organik. Styragel merupakan polistiren gel yang
mempunyai iktan silang yang kuat, dengan porositas yang bermacam-macam sesuai dengan
keperluan. Gel ini dapat digunakan pada suhu sampai 150 oC dengan berbagai pelarut seperti
tetrahidrfuron, benzen, triklorobenzen, perklooroetilen, kresol, kloroform, dan
karbontetraklorida; tetapi tidak dapat digunakan air, aseton, alkohol,. Batas eksklusi berkisar
antara 1.600 sampai 40.000.000.
Dasar teori
Dalam keadaan ideal, zat pelarut yang ada dalam kolom yang berisi gel dapat dibagi
dua, yaitu (a) yang ada dalam gel, yang volumenya ditandai dengan o. Molekul besar tidak
dapat masuk pori dalam gel/bead, karenanya jumlah volume pelarut yang diperlukan untuk
mengelusi molekul tersebut (e) hanyalah sejumlah volume yang diperlukan melalui luar dari
gel (o), atau:
e=o
Untuk molekul yang kecil volume elusi yang diperluakan:
e = o + Ki
i = volume dalam gel
o = volume di luar gel
K = koefisien distribusi, yaitu rasio konsentrasi rata-rata solut di dalam dan di luar gel, atau
merupakan bagian dari volume di dalam gel yang ditempati solut. Nilai K bervariasi antara O
sampai 1. Bagi molekul yang lebih besar dari ukuran pori gel, maka nilai K= 1.
K = (e – o) / i
i = a Wr
di mana, a = berat gel kering
Wr = water regain value, banyaknya air yang dapat diserap oleh gel.
Aplikasi
1. Menghilangkan kandungan garam (deslting)
Masalah yang umum dihadapi dalam biokimia ialah memisahkan garm-garam dan
molekul-molekul kecil dari makromolekul. Perbedaan yang besar antara koefisien distribusi
(nilai K) dari makro dan mikro molekul memungkinkan digunakannya kolom sederhana
dengan kecepatan aliran yang tinggi.
Contoh : dengan menggunakan Sephadex G-25, maka solut yang mempunyai BM > 5000
dapat dielusikan dengan volume pelarut Vo. Solut dengan BM < 1000 akan dielusikan setelah
makromolekul, demikian seterusnya. Keuntungan cara ini ialah makromolekul dielusikan
dalam konsentrasi yang tidak berubah.
2. Konsentrasi (pemekatan)
Larutan encer dari zat yang BM nya tinggi (makromolekul) dapat dipekatkan
konsentrasinya dangan menggunakan sifat gel kering yang higroskopik. Sephadex G-200
dapat menyerap air 20 kali berat gel tersebut dalam keadaan kering.
3. Fraksinasi
Khususnya pemisahan campuran senyawa dengan perbedaan nilai K yang dapat
dipisahkan dengan kolom yang panjang, aliran yang lambat sehingga waktunya panjang.
3. Inti Sari
Bahan untuk matriks penukar ion yang banyak dipakai ialah resin sintetik, seperti
matriks (croos linked)polistiren, polidekstran, selulosa dan silika.
Jenis penukar ion ditentukan oleh gugus fungsional yang diikatkan pada resin. Untuk
menghasilkan penukar kation, umunya digunakan gugus fungsional sulfonat (-SO3-), fosfat (-
PO32-), atau karboksilat (-COO-). Adapun untuk menghasilkan penukar anion dapat digunakan
gugus fungsional amin quaterner (-N3+), amin tertiair (-N2) dan amin sekundair (-N).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam Preparasi Kolom adalah Pemilihan dan
preparasi resin, Pembengkakan (swelling), Kapasitas kolom, dan Cara deteksi.
Kromatografi pertukaran ion adalah proses pemisahan senyawa yang didasarkan pada
pertukaran (penyerapan) ion antara fase gerak dengan ion pada fasa diam. Prinsip dasar
pemisahan dengan kromatografi kolom penukar ion adalah perbedaan kecepatan migrasi ion-
iondi dalam kolom penukar ion. Proses pertukaran ion dikerjakan dengan cara pembebanan
ion-ion pada kolom penukar ion.
Kromatografi FILTRASI GEL dipakai untuk pemisahan campuran senyawa
berdasarkan baerat molekulnya, terutama senyawa-senyawa yang mempunyai berat molekul
yang besar. Pemisahannya berdasarkan besarnya molekul, karena melalui kolom yang berisi
bahan isian yang bersifat ayakan atau filtrasi. Oleh karena itu, cara ini dinamakan
Kromatografi Filtrasi Gel (Gel filtration Chromatography), oleh ahli-ahli kimia polimer.
Proses adsorbsi dapat juga mempunyai muatan pada pemukaannya.
4. Latihan
Tentukan kadar KNO3 dalam gula, jika Tiga ratus gram sampel gula yang
mengandung KNO3 tersebut dilarutkan dalam air 100 mL. Larutan tersebut kemudian
dialirkan melalui penukar kation yang ada dalam bentuk H. Eluen yang keluar dititrasi
dengan 0,01 N NaOH 5,3 mL.
5. Evaluasi
1. Pada kromatografi penukar ion, bila matriks padatnya mempunyai gugus fungsional
yang bermuatan negative seperti gugus sulfonat, maka akan dapat berfungsi sebagai :
a. Penukar anion
b. Penukar kation
c. Penukar ion
d. Penukar atom
e. Penukar molekul
2. Berikut merupakan hal-hal yang benar mengenai kromatografi penukar ion dan
kromatografi filtrasi gel, kecuali :
a. Bila matriks mempunyai gugus amin kuarterner {- N- (CH3)3 +} maka akan dapat
berfungsi sebagai penukar anion.
b. Bahan matriks penukar ion yang banyak dipakai adalah resin sintetik seperti
polidekstran, selulosa dan silica.
c. Kromatografi penukar ion juga dapat digunakan untuk pemisahan lemak dan asam
amino.
d. Kromatografi filtrasi gel dipakai untuk pemisahan campuran senyawa berdasarkan
berat molekulnya.
e. Kromatografi penukar ion umum digunakan untuk menghilangkan kesadahan air
rumah tangga.
4. Yang bukan merupakan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam Preparasi Kolom pada
kromatografi penukar ion adalah
a. Pemilihan dan preparasi resin,
b. Pembengkakan (swelling),
c. Kapasitas kolom,
d. Cara deteksi.
e. Suhu kolom