MAKALAH

KROMATOGRAFI KOLOM
PEMISAHAN CAMPURAN SAMPEL RIBOFLAVIN Dan RIVANOL

Oleh:

Kelompok 3

1.Antonia Bella Julita (1919751)

2.Desi Ramadani (1919756)

3.Renda Nopita Sari (1919770)

4.Anthony Yohanes (1919750)

5.Elnis Safera (1818726)

Dosen pembimbing: Fita Selonni.,M,farm Apt

AKADEMI FARMASI PRAYOGA PADANG

PENGERTIAN

Kromatografi kolom merupakan salah satu jenis metode pemisahan kimia secara kromatografi.
Metode ini secara luas digunakan dalam kimia terutama dengan skala laboratorium atau skala
kecil untuk memisahkan senyawa secara individu dari suatu campuran.

Kromatografi kolom banyak digunakan dalam aplikasinya sebagai metode isolasi suatu senyawa
dari bahan atau sampel tertentu sehingga didapatkan satu jenis senyawa murni yang diinginkan.

Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dan pemurnian dari suatu campuran baik itu dalam
fasa cair maupun padat untuk menghasilkan senyawa yang diinginkan secara individu.
Pemisahan dalam kromatografi kolom didasarkan pada perbedaan interaksi setiap senyawa yang
ingin dipisahkan dengan media kromatografi kolom yang digunakan.

Sama seperti pada kromatografi lain, pada kromatografi kolom juga digunakan media berupa
fasa diam dan fasa gerak. Pada umumnya, fasa diam dan fasa gerak dibuat berdasarkan
kepolarannya dimana keduanya dibuat berlawanan seperti fasa diam yang bersifat polar dan fasa
gerak yang cenderung lebih non polar.

Kromatografi kolom menggunakan alat berupa kolom yang terbuat dari gelas atau kaca yang
ditempatkan secara vertikal sehingga zat dapat turun secara perlahan dengan bantuan gravitasi.
Pada kolom tersebut juga dilengkapi dengan keran yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak
atau eluen sehingga dapat ditampung menggunakan wadah seperti flakon.

Kelemahan dari kromatografi kolom itu sendiri yaitu membutuhkan waktu yang cukup lama
pada prosesnya karena kita perlu melakukan elusi secara bertahap sehingga semua fasa gerak
yang digunakan habis dan ditampung dalam wadah yang berbeda.

PRINSIP KROMATOGRAFI KOLOM

Prinsip kerja dari kromatografi kolom yaitu memisahkan komponen campuran berdasarkan
perbedaan interaksinya dalam fasa diam dan fasa gerak. Jika suatu campuran terdiri dari
beberapa komponen, maka setiap komponen tersebut memiliki struktur masing masing dengan
sifat yang khas untuk setiap senyawanya. Salah satu sifat yang berpengaruh dalam kromatografi
kolom adalah kepolaran senyawa serta berat dan ukuran molekul.

Ketika suatu komponen atau senyawa memiliki kepolaran yang tinggi, maka ketika dilakukan
kromatografi kolom dengan fasa diam berupa zat yang bersifat polar akan terjadi interaksi yang
cukup besar antara komponen dengan fasa diam. Akibatnya komponen akan tertahan pada fasa
diam lebih lama ketika proses elusi, sedangkan komponen lain yang bersifat lebih non polar akan
lebih cepat melewati fasa diam.

Sifat lain yang berpengaruh yaitu ukuran dan berat komponen yang dipisahkan. Jika kita
menggunakan suatu resin sebagai fasa diam, maka resin tersebut juga dapat menjadi media
pemisah berdasarkan ukuran molekul.

Ketika ukuran molekul dari komponen yang akan dipisah relatif besar, maka komponen tersebut
akan susah bergerak sehingga lebih lama tertahan pada fasa diam. Sebaliknya untuk molekul
yang berukuran kecil akan lebih mudah bergerak sehingga akan lebih cepat dalam melewati fasa
diam ketika proses elusi.

TAHAP KROMATOGRAFI KOLOM

Dalam melakukan pemisahan dengan kromatografi kolom, terdapat beberapa tahapan yang harus
dilakukan. Berikut ini adalah prosedur dalam melakukan kromatografi kolom.

1. Pemilihan fasa gerak dan fasa diam

Hal pertama yang harus dipersiapkan dalam kromatografi kolom adalah pemilihan fasa gerak dan
fasa diam. Tahap ini akan sangat menentukan hasil akhir dari kromatografi kolom karena
pemilihan fasa diam dan fasa gerak sangat berpengaruh terhadap pemisahan komponen.

Pemilihan didasarkan pada kepolaran zat yang akan dipisah. Pada umumnya fasa diam yang
digunakan bersifat polar seperti pasir silika gel, sedangkan fasa gerak atau eluen biasanya
dilakukan variasi kepolaran untuk menghasilkan pemisahan paling optimum.

Dalam kromatografi kolom yang baik, dilakukan gradasi eluen dari yang bersifat polar ke non
polar ataupun sebaliknya.

2. Packing kolom
Packing kolom merupakan tahap preparasi dalam kromatografi kolom dimana pada tahap ini
digunakan untuk mempersiapkan kolom dengan fasa diamnya. Packing kolom terbagi menjadi 2
cara yaitu cara kering dan cara basah.

Packing kolom dengan cara kering dilakukan dengan memasukkan fasa diam seperti pasir silika
gel ke dalam kolom secara langsung hingga penuh lalu diikuti dengan memasukkan eluen hingga
menutupi fasa diam. Sedangkan untuk cara basah, pasir silika atau fasa diam dicampurkan
terlebih dahulu dengan eluen pada wadah terpisah lalu campuran tersebut dimasukkan ke dalam
kolom secara bersamaan.

3. Elusi
Dalam kromatografi kolom dikenal proses elusi dimana proses ini merupakan cara mengalirkan
campuran melalui fasa diam pada kolom menggunakan fasa gerak atau eluen. Pada proses elusi
ini akan terjadi pemisahan komponen campuran pada fasa diam.

Pemisahan komponen tersebut didasarkan pada sifat kepolaran, ukuran, dan berat molekul yang
dipisahkan. Hasil pemisahan dari elusi ini akan ditampung pada wadah terpisah untuk setiap
fraksi. Pemisahan fraksi tersebut dapat dilihat melalui perbedaan warna yang dihasilkan untuk
setiap komponen.

Misalnya ketika komponen A terpisah menghasilkan warna hijau, lalu pada komponen B
menghasilkan warna merah.

MANFAAT DAN CONTOH APLIKASIK KROMATOGRAFI KOLOM

Karena menjadi metode kromatografi sebagai pemisahan dasar dalam kimia, kromatografi kolom
memiliki manfaat dan kegunaan yang sangat luas terutama pada bidang kimia organik.
Kromatogarfi kolom juga dapat diaplikasikan dalam berbagai kegunaan. Berikut ini beberapa
contoh manfaat dan aplikasi kromatografi kolom.

1. Pemurnian dari hasil reaksi sintesis kimia

Dalam kimia organik kita mengenal reaksi sintesis dimana reaksi tersebut memungkinkan
pembentukan produk dari reaktan tertentu. Pada reaksi sintesis, tidak selalu menghasilkan
produk yang murni atau hanya satu jenis produk melainkan juga kadang terdapat produk lain
yang disebut dengan produk samping hasil reaksi.

Untuk memisahkannya dengan produk utama maka harus dilakukan pemurnian, cara yang paling
mudah adalah dengan menggunakan kromatografi kolom. Melalui kromatografi kolom dengan
didasarkan pada perbedaan sifat kepolaran senyawa yang dipisahkan maka dapat dihasilkan
senyawa hasil reaksi yang murni.

2. Isolasi senyawa aktif dalam bahan alam

Masih berkaitan dengan kimia organik, kita sering menggunakan senyawa aktif dari bahan alam
tertentu karena memiliki aktivitas farmakologis seperti antibakteri, antijamur, antioksidan, dan
lain lain. Untuk mengisolasi senyawa tersebut secara murni dari suatu bahan alam seperti daun
daunan, diperlukan metode pemisahan seperti dengan menggunakan kromatografi kolom.

Dengan metode ini, sampel bahan alam akan dibuat ekstrak lalu dilakukan pemisahan melalui
elusi. Hasilnya didapatkan senyawa aktif yang diinginkan dan dapat dikarakterisasi lebih lanjut
menggunakan alat yang lebih kompleks seperti menggunakan FTIR atau NMR.

3. Analisis limbah lingkungan

Kromatografi kolom juga berperan penting dalam kimia analisis dimana metode ini digunakan
dalam analisis limbah lingkungan.

Untuk dapat mengetahui tingkat pencemaran seperti misalnya dalam limbah cair maka
diperlukan pemurnian dari kandungan limbah tersebut secara individu sehingga dapat ditentukan
zat apa saja yang terkandung pada limbah tersebut.

Kromatografi kolom menjadi cara yang paling murah untuk melakukan analisis ini karena
dengan cara ini kita hanya perlu melakukan elusi pada sampel sehingga didapatkan fraksi
pemisahan, selanjutnya dari fraksi tersebut akan dilakukan karakterisasi lebih lanjut untuk
memastikan zat apa yang ada di dalamnya.

Meskipun begitu metode ini sudah jarang digunakan karena saat ini terdapat metode yang relatif
lebih mudah seperti menggunakan HPLC dan GC.

Metode kromatografi kolom menjadi metode konvensional yang masih digunakan hingga saat ini
meskipun telah dikembangkan berbagai metode kromatografi lain yang lebih canggih.
Kromatografi kolom tetap menjadi pilihan karena metode yang sederhana dan tentunya murah
untuk penggunaan tertentu.
Dalam kromatografi kolom, hal paling penting yang harus diperhatikan yaitu pada proses elusi
dimana kita harus secara tepat menentukan fraksi hasil pemisahan dan memisahkannya untuk
setiap fraksi. Ketika bekerja di laboratorium terutama untuk bidang kimia organik, maka kita
harus menguasai metode kromatografi kolom.

Demikianlah artikel yang dapat kami tuliskan kepada segenap pembaca terkait dengan
pengertian kromatografi kolom, prinsip kerja, manfaat, dan contohnya dalam kimia organik.
Semoga melalui bahasan ini bisa dijadikan referensi. Terimakasih

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KROMATOGRAFI KOLOM

kelebihan

1. Proses kromatografi kolom termasuk proses yang sederhana

2. Tidak membutuhkan alat-alat yang kompleks dalam melakukan metode kromatografi
kolom
3. Biaya yang dikeluarkan untuk metode kromatografi kolom cukup murah jika
dibandingkan dengan metode kromatografi lainnya

Kekurangan

1. Membutuhkan waktu yang lama untuk menyelesaikan prosesnya

2. Perlu dilakukan elusi secara bertahap agar semua fasa gerak yang digunakan akan habis
dan di tampung pada wadah yang berbeda

PEMISAHAN CAMPURAN RIBOFLAVIN DAN RIVANOL

Prinsip kerja

Memisahkan campuran zat menggunakan fase diam yang dimasukkan kedalam bahan pendukung
lupa kolom dan fase gerak berupa cairan .

Fase diam yang digunakan yaitu Silica gel 60 dan fase gerak yang digunakan yaitu campuran
perbandingan antara diklorometana demgan metanol dengan perbandingan 99:1

ALAT DAN BAHAN:

1.Statif 4.Silica gel 60 (fase diam)

2.Klem 5.Pengaduk kaca

3.Kolom 7.Pipet tetes

8.Beaker gelas 14.Pipa kapiler

9.Cawan porselen 15.Chamber

10.Kapas 16.Plat kromatografi

11.Rivanol 17.Erlenmeyer

12.Riboflavin 18.Vial

13.Fase gerak (perbandingan antara

Diklorometana :matanol (99:1)

CARA KERJA:

1.Masukkan sedikit kapas ,dorong kapas dengan bantuan alat hingga sampai ujung kolom lalu
padatkan dan rapikan kapas

2.Lalu masukan campuran fase diam dan fase gerak kedalam kolom kromatografi

3.Bersihkan silica gel yang terdapat pada beaker gelas dengan fase gerak kemudian masukkan
kedalam kolom lakukan hal tersebut terus-menerus hingga beaker gelas bersih.

4.Masukan fase gerak hingga sedikit melebihi batas fase diam yang terdapat didalam kolom

5.Masukkan cairan sampel kedalam kolom (sampel yang digunakan adalah campuran Riboflavin
dan Rivanol

6.Cairan dimasukan sedikit demi sedikit menggunakan pipet tetes melalui dinding kolom

7.Turunkan cairan melalui bagian bawah kolom hingga batas sampel yang dimasukkan

8.Tambahkan fase gerak dengann bantuan corong lakukan sedikit demi sedikit melalui dinding
kolom

19.Cairan dikeluarkan melalui bagian bawah kolom dan ditampung dalam erlenmeyer

10.bila cairan sampel telah sampai dibagian bawah kolom kromatografi hal tersebut merupakan
tanda berakhirnya penampungan cairan.

11.dari hasil penampungan dihasilkan 3 erlenmeyer dengan warna cairan berbeda

12.pindahkan masing" cairan kedalam vial kosong

13.Lakukan penotolan pada plot kromatografi yang sebelumnya telah ditandai dan diberi jarak
masing" 1 cm

14.Lakukan penotolan sebanyak 3x sambil menunggu penotolan pertama kering

15.Masukan plot kromatografi kedalam chamber yang telah diisi fase gerak dan dijenuhkan
terlebih dahulu

16.Tunggu hingga eluen naik sampai garis batas

17.Ambil plat kromatografi dengan pinset ,angin " hingga kering lalu masukkan kedalam kotak
UV

18.Sinari plat dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm

19.Amati hasil