Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE

ANALISIS EKSPRESI ER, (HER-2/neu), DAN PR


MENGGUNAKAN METODE Immunohistochemistry (IHC)

OLEH:
ANDRI SETIAWAN

NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK


FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Imunohistokimia merupakan suatu teknik untuk menentukan keberadaan


suatu antigen atau protein target dalam jaringan atau sel dengan menggunakan
reaksi antigen-antibodi. Teknik ini diawali dengan prosedur histoteknik, yaitu
suatu prosedur pembuatan irisan jaringan yang kemudian diamati di bawah
mikroskop. Setelah terbentuk suatu irisan jaringan, selanjutnya dapat dilakukan
prosedur imunohistokimia (Fatchiyah, 2006).
Interaksi antara antigen dan antibodi merupakan suatu reaksi kimia yang
tidak kasat mata, sehingga diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan
melabel antibodi yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom. Enzim yang
digunakan untuk melabel selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen,
yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut, yang
dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Pengecatan imunohistokimia yang
menggunakan fluorokrom untuk melabel antibodi, dapat langsung diamati tanpa
harus direaksikan dengan bahan-bahan yang menghasilkan warna di bawah
mikroskop fluorescence (Fatchiyah, 2006). Terdapat dua metode dasar dalam
melakukan identifikasi antigen pada suatu jaringan melalui pemeriksaan
imunohistokimia, yaitu (CCRC, 2009): Metode langsung (direct method), Metode
tidak langsung (indirect method)
Metode langsung merupakan metode pengecatan satu langkah, oleh karena
hanya melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang berlabel. Salah satu
contoh antibodi berlabel adalah antiserum terkonjugasi Fluorescein isothiocyanate
(FITC) dan rodhamin.
Metode tidak langsung menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi
primer yang tidak berlabel dan antibodi sekunder yang berlabel. Antibodi primer
berperan dalam mengenali antigen yang diidentifikasi pada jaringan (first layer)
sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second
layer). Antibodi kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi
sekunder diikuti dengan penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen
merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa
berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu. Penggunaan kromogen
fluorescent dye seperti FITC, rodhamin dan texas-red disebut metode
immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti
peroksidase, alkali fosfatase atau glukosa oksidase disebut metode
immunoenzyme.
Antibodi agar dapat terjamin dapat mengikat antigen, maka sel harus
difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen
menjadi immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkan sel pada slide
mikroskop, coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Secara umum,
terdapat dua macam metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-
linking. Pelarut organik seperti alkohol dan aseton akan memindahkan lipid,
mendehidrasi sel dan mengendapkan protein. Reagen cross-linking seperti
paraformaldehid membentuk jembatan intermolekuler melalui gugus amino bebas
(CCRC, 2009).
Pemeriksaan imunohistokimia dapat mendeteksi jenis reseptor hormone
sel kanker, yaitu reseptor estrogen (ER) dan reseptor progesteron (PR), serta
ekspresi dari human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2). Tampilan
ekspresi dari ER, PR, dan HER-2 pada pemeriksaan imunohistokimia merupakan
dasar klasifikasi molekuler kanker payudara. Berdasarkan klasifikasi ini, kanker
payudara dibagi menjadi beberapa subtipe yaitu luminal A, luminal B, HER-2
positif dan basal-like/triple negative. Setiap tipe memiliki karakteristik yang
berbeda baik dari segi terapi yang diberikan maupun prognosisnya (Wahid, 2008).

Berdasarkan uraian diatas, praktikum analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan


PR menggunakan Immunohistochemistry (IHC) sangat penting untuk dilakukan.

1.2 Tujuan Praktikum


Tujuan dari praktikum analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan PR
menggunakan Immunohistochemistry (IHC) ini adalah sebagai berikut:
1. Mampu memahami prinsip kerja dari metode Immunohistochemistry
(IHC).
2. Mampu melakukan prosedur pewarnaan Immunohistochemistry (IHC)
pada jaringan Ca mamae (Human Breast Tumor)
3. Mampu melakukan analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan PR menggunakan
Immunohistochemistry (IHC).

BAB II
METODE PRAKTIKUM

2.1 Waktu dan Tempat


Praktikum Analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan PR menggunakan
Immunohistochemistry (IHC) ini dilaksanakan pada Rabu, 7 Maret 2018, dan
bertempat di Labroratorium Sentral Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya.

2.2 Alat dan Bahan


A. Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum Analisis Ekspresi ER,
HR-2/neu, dan PR menggunakan Immunohistochemistry (IHC) ini
adalah sebagai berikut:
1. Inkubator
2. Toples
3. Waterbath
4. Mikropipet & tip
5. Vortex
6. Chamber
7. Mikroskop Komputer

B. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum Analisis Ekspresi
ER, HR-2/neu, dan PR menggunakan Immunohistochemistry (IHC) ini
adalah sebagai berikut:
1. Slide Preparat CA Mamae (Human Breast Tumor)
2. Xilol
3. Ethanol Bertingkat (Absolute, 90%, 80%, 70%)
4. Akuades Steril
5. Antigen Retrieval (Buffer Sitrat PH 6,0)
6. PBS (Phosphate Buffer Saline)
7. Blocking Endogen Peroksidase (3% H2O2 dalam methanol)
8. Blocking Buffer
9. Antibody Primer (ER, HR-2/ neu, dan PR)
10. Antibody Sekunder (Biotin Conjugate),
11. SA-HRP (Strep Avidin Horseradish Peroxidase)
12. Chromogen DAB (Diaminobenzidine)
13. Counterstain Mayer’s Hematoxilien
14. Entelan

2.3 Prosedur Kerja


Langkah kerja dalam praktikum Analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan PR
menggunakan Immunohistochemistry (IHC) adalah sebagai berikut:
A. Deparafinasi
Slide dipanaskan pada suhu 60°C selama 60 menit. Kemudian direndam
dalam larutan-larutan di bawah ini secara berurutan;
1. Xilol (2 X 10 menit)
2. Ethanol absolut (2 X 10 menit)
3. Ethanol 90 % (1 X 5 menit)
4. Ethanol 80 % (1 X 5 menit)
5. Ethanol 70 % (1 X 5 menit)
6. Aquades steril (3 X 5 menit)

B. Antigen Retrieval
1. Rendam slide dalam chamber yang berisi buffer sitrat PH 6,0,
kemudian kemudian dipanaskan dalam waterbath suhu 95°C selama
20 menit.
2. Keluarkan slide dari waterbath, tunggu sampai suhu ruang ± 20 menit.
3. Cuci slide dengan PBS (3 X 5 menit).

C. Imunohistokimia
Hari ke-1
1. Blocking Endogen Peroksidase
a) Diteteskan 3% H2O2 (dalam methanol) inkubasi 20 menit pada suhu
ruang.
b) Dicuci PBS 3 X 5 menit.
2. Blocking Unspesifik protein.
a) Diteteskan Blocking Buffer (Backgroud Sniper), inkubasi 60 menit
pada suhu ruang.
b) Dicuci PBS 3 X 5 menit.
3. Inkubasi Antibody Primer
a) Diteteskan antibody primer yang dilarutkan dalam Blocking
Buffer. (1:100)
b) Inkubasi over night pada 4°C.
c) Esok harinya dikeluarkan dari 4°C, ditunggu sampai suhu ruang,
kemudian dicuci PBS 3 X 5 menit.

Hari ke-2
1. Inkubasi Antibody sekunder
a) Diteteskan antibody sekunder (Biotin Conjugate), inkubasi 60
menit pada suhu ruang.
b) Dicuci PBS 3 X 5 menit.
2. Inkubasi SA-HRP (Strep Avidin Horseradish Peroxidase)
a) Diteteskan SA-HRP, inkubasi 40 menit pada suhu ruang.
b) Dicuci dengan PBS 3 X 5 menit.
c) Bilas dengan aquades.
3. Aplikasi Chromogen DAB (Diaminobenzidine)
a) Diteteskan DAB (DAB Chromogen ; DAB Buffer = 1;40),
inkubasi 1-10 menit pada suhu ruang.
b) Dicuci aquades 3 X 5 menit.
4. Counterstain Mayer’s Hematoxilien
a) Diteteskan Mayer’s Hematoxilien (Mayer’s Hematoxilien ;
aquades = 1;3), inkubasi 1-10 menit pada suhu ruang.
b) Dibilas dengan aquades
5. Mounting Entelan
6. Diamati dibawah Mikroskop

D. Resep Larutan
1. PBS (Phosphate Buffer Saline)
NaCl 8 gr
Na2HPO4 1,44 gr
KH2HPO4 0,24 gr
KCl 0,2 gr
Aquades 1L
PH 7,4
2. Sodium Buffer Sitrat
Na3C6H5O7 2,94 gr
Dilarutkan dalam aquades 1L, di ukur pH 6,0 kemudian ditambahkan 0,5
ml Tween 20.

3. Blocking Buffer
3% FBS + 0,25 Triton X-100 (dalam PBS).

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

A. Estrogen Receptors (ER)

Pewarnaan Imunihistokimia Human Pewarnaan Imunihistokimia Human


Breast Tumor (100x). Ekspresi Breast Tumor (400x). Ekspresi
Estrogen Receptors (ER) terdapat di Estrogen Receptors (ER) terdapat di
Nukleus (Coklat Pekat). Nukleus (Coklat Pekat).

B. Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu)


Pewarnaan Imunihistokimia Human Pewarnaan Imunihistokimia Human
Breast Tumor (100x). Ekspresi Human Breast Tumor (400x). Ekspresi Human
Epidermal Growth Factor Receptor-2 Epidermal Growth Factor Receptor-2
(HER-2/neu) terdapat di Sitoplasma (HER-2/neu) terdapat di Sitoplasma
(Coklat Pekat). (Coklat Pekat).

C. Progesterone Receptors (PR)

Pewarnaan Imunihistokimia Human Pewarnaan Imunihistokimia Human


Breast Tumor (100x). Ekspresi Breast Tumor (400x). Ekspresi
Progesterone Receptors (PR) terdapat di Progesterone Receptors (PR) terdapat di
Nukleus (Coklat Pekat). Nukleus (Coklat Pekat).

3.2 Pembahasan

Prinsip Imunohistokimia adalah bahwa antibodi akan berikatan secara spesifik


dengan antigen. Antibodi akan “mencari“ lokasi antigen, dan berikatan dengan
antigen. Tempat antigen dapat ditentukan bila kita dapat mengetahui dimana
ikatan antibodi-antigen Antibodi terbentuk akibat masuknya bahan kimia spesifik
dari spesies lain ke dalam system imun. Sistem imun mempunyai kemampuan
innate untuk mengenali setiap asam amino, karbohidrat, atau lipid dan bereaksi
terhadap bahan-bahan kimia ini melalui molekul reseptor spesifik. Pengenalan ini
tergantung pada banyak faktor, salah satu di antaranya adalah besar (size) bahan
kimia tersebut; diperlukan molekul yang besarnya beberapa ratus Dalton untuk
memulai pengenalan oleh reseptor dan timbulnya respons imun. Molekul-molekul
ini disebut antigen. Beberapa protein cukup besar untuk menimbulkan respons
imun, sehingga protein ini dapat besifat antigen.

Metode analisis Imunohistokimia pada praktikum ini ada 3, yaitu:


Deparafinisasi, Antigen Retrieval, dan proses pengecatan (imunohistokimia).
Proses antigen retrieval diperlukan setelah dilakukan deparafinisasi karena proses
tersebut akan membuat epitop dari jaringan tersebut lebih terlihat atau lebih
dominan dibandingkan dengan tidak dilakukan antigen retrieval sehingga
nantinya antibodi primer yang diberikan akan dapat mengenali epitopnya dengan
baik. Selanjutnya dilakukan bloking unspesifik protein, hal ini bertujuan untuk
menutupi sisi protein lain, sehingga antibodi tidak mengenali protein lain yang
tidak dimaksud. Hal ini dapat mengurangi bias.

Pada proses selanjutnya adalah sampel labeling yang terdiri dari imunodeteksi
menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan
counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi primer yang
digunakan adalah antibody polyclonal Estrogen Receptors (ER), Human
Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu), Progesterone Receptors
(PR). Setelah diberikan antibodi primer, preparat dicuci, sehingga antibodi primer
yang tidak berikatan akan terbuang. Berikutnya diberikan antibodi sekunder yang
spesifik terhadap antibodi primer, sehingga antibodi sekunder (biotin conjugate)
ini akan berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder ini dimodifikasi
sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Pada praktikum ini,
molekul indikator yang digunakan adalah SA-HRP yang berikatan dengan H2O2.
Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder yang
memiliki SAHRP. Selanjutnya diberikan kromagen diaminobenzidine (DAB).
DAB ini akan bereaksi dengan H2O2 yang terdapat pada SA-HARP antibodi
sekunder dan akan dihasilkan produk reaksi berwarna coklat yang dapat kita lihat.
Proses terakhir adalah counterstaining, yaitu memberikan warna lain pada
jaringan yang tidak terwarnai oleh proses Imunohistokimia. Pada praktikum ini
menggunakan mayer hematoxilen sebagai counterstaining yang nantinya akan
memberikan warna kebiruan pada jaringan lainnya. Counterstaining bertujuan
untuk memberikan warna kontras terhadap hasil Imunohistikimia, sehingga
jaringan berwarna coklat dapat terlihat jelas dibandingkan dengan jaringan
sekitarnya. Hasil Imunohistokimia dari praktikum ini terlihat slide Human Breast
Tumor adanya ekspresi Estrogen Receptors (ER) pada nukleus, Human
Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu) pada sitoplasma, dan
Progesterone Receptors (PR) pada nucleus.

Pewarnaan imunohistokimia pada slide jaringan CA Mamae (Human Breast


Tumor) ini menggunakan antibodi Estrogen Receptors (ER) dimana sel yang
positif mengekspresikan Estrogen Receptors (ER) akan memiliki nucleus (inti sel)
yang berwarna cokelat. Hal ini disebabkan karena lokalisasi Estrogen Receptors
(ER) adalah di nucleus (inti sel)

Pewarnaan imunohistokimia pada slide jaringan CA Mamae (Human Breast


Tumor) ini menggunakan antibodi Human Epidermal Growth Factor Receptor-2
(HER-2/neu) dimana sel yang positif mengekspresikan Human Epidermal Growth
Factor Receptor-2 (HER-2/neu) akan memiliki sitoplasma yang berwarna cokelat.
Hal ini disebabkan karena lokalisasi Human Epidermal Growth Factor Receptor-
2 (HER-2/neu) adalah di sitoplasma.

Pewarnaan imunohistokimia pada slide jaringan CA Mamae (Human Breast


Tumor) ini menggunakan antibodi Progesterone Receptors (PR) dimana sel yang
positif mengekspresikan Progesterone Receptors (PR) akan memiliki nucleus (inti
sel) yang berwarna cokelat. Hal ini disebabkan karena lokalisasi Progesterone
Receptors (PR) adalah di nucleus (inti sel).
BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum Analisis Ekspresi ER, HR-2/neu, dan PR
menggunakan Immunohistochemistry (IHC) ini adalah sebagai berikut:
1. Prinsip dasar dari setiap prosedur IHC adalah bahwa antibodi secara khusus
akan mengikat dengan antigen untuk menghasilkan kompleks antibodi-
antigen eksklusif yang dikombinasikan dengan penanda divisualisasikan.
2. Prosedur pewarnaan Immunohistochemistry (IHC) pada jaringan Ca mamae
(Human Breast Tumor) sebagai berikut: Deparaffinization dan
Rehydration, Antigen Retrieval, Block Endogenous Peroxidase, Protein
Block, Primary Antibody, Biotinylated Secondary Antibody, Streptavidin
HRP, DAB Chromogen serta Hematoxylin Counterstain.
3. Lokalisasi Ekspresi Estrogen Receptors (ER) terdapat di nucleus (inti sel).
Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2/neu) terdapat di
sitoplasma. Progesterone Receptors (PR) terdapat di nucleus (inti sel).
DAFTAR PUSTAKA

Cell Signaling Technology. 2007. Immunohistochemistry Protocol (Paraffin)


Catalogue Number: 9662 Page 4. Cell Signaling Technology, Inc.

Fatchiyah. 2006. Panduan Praktikum TABM: Brawijaya Press.

Wahid S, Miskad UA, Djimahit T. 2008. HER2/neu expression in breast cancer:a


significant correlation with histological grade. Department of Anatomical
Pathology Medical Faculty Hasanuddin University.