ISOLASI DAN IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA MADU

LOKAL SERTA ANALISIS AKTIVITAS PREBIOTIKNYA

DR. IR. SURAYA KAFFI S.M.T.A.

POLITEKNIK NEGERI LAMPUNG

2020
 Latar Belakang
• Madu terbukti memiliki beragam khasiat yang telah
dimanfaatkan selama ribuan tahun
• Oligosakarida: kandungan alami madu, berpotensi
menjadi prebiotik
• Prebiotik: komponen pangan yang tidak tercerna dan
mampu memberikan keuntungan bagi kesehatan
melalui stimulasi pertumbuhan bakteri
menguntungkan
• Produksi madu hutan Indonesia mencapai 115 juta ton
per tahun
• Kandungan dan potensi madu dari lebah hutan lokal
Apis dorsata belum diketahui
 Perumusan Masalah
Kandungan oligosakarida madu lokal dan potensinya
sebagai prebiotik belum diteliti sehingga perlu
dilakukan isolasi dan identifikasi oligosakarida madu
serta pengujian aktivitas prebiotiknya
 Luaran Yang Diharapkan
• Penyusunan artikel yang secara komperhensif
menyajikan metode isolasi dan identifikasi
oligosakarida madu lokal dan pengaruhnya
terhadap aktivitas prebiotik.
 BAHAN & ALAT
• Bahan
Sampel madu dari Pulau Kalimantan Timur dan Pulau Sumbawa.
arang aktif 100 mesh etanol 10%
kertas saring Whatman No.1 lempeng KLT Whatman K6F
asetonitril etil asetat
1-propanol metanol
N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida
standar karbohidrat reagen DNS
reagen fenol sulfat getah pencernaan buatan
kultur L. acidophilus kultur E. coli
MRSB, MRSA TSA, TSB
M9 Minimal Medium inulin komersil
filter 0.45 mikron
 BAHAN & ALAT (lanjutan)
• Alat
Peralatan gelas, oven, neraca analitik, vakum,
hair dryer, chamber KLT, botol semprot,
magnetic stirrer, inkubator, sentrifugasi,
inkubator, penangas, spektrofotometer, KCKT
dengan kolom yang digunakan adalah Aminex
HPX-87H (300mmx7.8mm) dengan guard
column yang mengandung cartridge H+ dan
disimpan pada suhu 65oC.
 Isolasi Oligosakarida (Hernandez et al. 2009)

Desorpsi oligosakarida
•0.5 g madu+3 g arang aktif+etanol dari arang aktif • Rotarievaporator vakum
10%
40oC
•Diaduk 30’
•Disaring dengan kertas saring
• + et-OH 50% • Simpan pada kondisi kering
Whatman No. 1 pada keadaan • Aduk 30’
vakum • Saring pada kondisi vakum
•Arang aktif dibilas dengan 25 mL et-
OH 10%

Ekstraksi
Pengeringan
monosakarida
Deteksi Oligosakarida (Vergara et al.
2010, Ato et al. 1960)
Spot pada KLT dan elusi dengan piridin:buatnol:air
(4:6:3)

Semprot hingga jenuh dengan N*(1-naftil)

etilendiamina dihidroklorida dalam metanol: as. Sulfat
(97:3)

Panaskan 120oC selama 8-10’

Pengujian Aktivitas Oligosakarida
Resistensi terhadap enzim pencernaan
• Asam lambung
• Enzim amilase

Aktivitas fermentasi
• Produksi asam lemak rantai pendek

Stimulasi pertumbuhan bakteri

• Perbandingan antara pertumbuhan bakteri probiotik
L.acidophilus dan bakteri enterik E.coli
 IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA

Hasil KLT dilarutkan dalam air

nanofiltrasi dan disaring dengan
filter 0.22 mikron

KCKT Dionex DX-300, kolom Carbo-

PAC PA 100 dan CarboPAC PA 100
penukar ion, 20uL per injeksi

Maltoriosa dan maltotetraosa sbg

standar karbohidrat, eluen: Na-
asetat, air, NaOH
Resistensi terhadap getah pencernaan

• Inkubasi sampel dengan asam lambung buatan

• Inkubasi sampel dengan enzim amilase air liur

• Pengukuran total karbohidrat awal (0 jam) dengan metode fenol-sulfat

• Pengukuran gula pereduksi metode DNS pada jam ke-0, 0.5, 1, 2, 4, dan
jam
Stimulasi pertumbuhan bakteri
• Inokulasi masing-masing L.acidophilus
dan E.coli pada media yang ditambah
1 prebiotik
• Media dengan glukosa sebagai kontrol

• U kur OD jam ke-0 dan ke-24 pada 600

nm
2  Pp 24  Pp 0   Ep 24  Ep 0 
• P rebiotic activ ity score = Pg 
24  Pg 0   Eg 24  Eg 0 
 Produksi SCFAs

Kultur probiotik usia 24 jam + asam nitrat dan

asam sulfat lalu disaring dengan filter 0.45
mikron dan disentrifugasi pada 5000g 10’

Kandungan SCFAs diukur dengan KCKT kolom

aminex HPX-87H
 Sampel madu lokal berasal dari Hutan
Kampung Bluan Kec. Muara Pahu,
Provinsi Kalimantan Timur dan Bukit
Madu lokal Gunung Tambora, Bima, Pulau
Sumbawa. Sampel madu diambil pada
bulan Februari 2010 dengan bantuan
penduduk setempat. Madu lokal
dihasilkan dari lebah hutan A pis
dorsata. Sumber nektar untuk madu
hutan asal Kalimantan Timur antara lain
bunga pohon rengas, bengkirai, dan
kemiri. Sumber nektar untuk madu asal
Pulau Sumbawa adalah bunga akasia,
samu, loa, luhu, duwet, mangga, jambu,
kemiri, dan pala. Madu lokal Kalimantan
berwarna jingga cerah, sementara itu
madu lokal Pulau Sumbawa memiliki
warna yang lebih gelap.
 Ekstraksi
oligosakarida
• Terhitung Senin, 19 April 2010 telah
dilakukan ekstraksi oligosakarida dari
sampel sebanyak 25 gram untuk
masing-masing madu lokal.
Rendemen ekstrak yang diperoleh
dari proses rotavapor vakum untuk
madu lokal Kalimantan sebanyak
0.5148 gram, sementara untuk madu
lokal Sumbawa menghasilkan
rendemen dengan bobot 0.4488
gram. Rendemen madu lokal
Kalimantan berwarna cokelat
mengilap dengan tekstur seperti
permen, sementara rendemen madu
Sumbawa berwarna hitam dan
mengilap.
 Deteksi
oligosakarida
Rendemen dilarutkan dengan konsentrasi 4% dan volume
akhir 0.5 mL lalu di spot pada plat KLT silika. Standar yang
digunakan adalah glukosa dan fruktosa konsentrasi 1%. Hasil
KLT madu Kalimantan menunjukkan adanya 2 buah spot
dengan Retention factor (RF) masing-masing 0.641 dan 0.385.
Spot dengan RF 0.641 Diidentifikasi sebagai fruktosa sesuai
dengan RF dari fruktosa yakni 0.692. Madu Sumbawa
menghasilkan 2 spot masing-masing dengan Rf 0.666 dan
0.410. Spot pertama diidentifikasi sebagai fruktosa.
Sementara itu standar glukosa memiliki RF 0.769. Metode
ekstraksi oligosakarida dengan arang aktif dan etanol belum
optimum. Hal ini dikarenakan jumlah monosakarida saat KLT
masih signifikan dan jauh lebih besar dibandingkan spot
kedua, masing-masing dengan Rf 0.410 untuk Sumbawa dan
0.385 untuk Kalimantan, yang diduga merupakan
oligosakarida. Selain itu terdapat ekor di antara spot yang
diduga merupakan disakarida dan oligosakarida dalam jumlah
yang sangat kecil.
 Penggantian E luen
(Piridin:butanol:air, 4:6:3)

0.659 Monosakarida
0.659
Resolusi 0.568 0.568 Monosakarida
cukup baik,
hasil 0.5 Di- atau trisakarida
0.5
identifikasi 0.375 Di- atau trisakarida
akan
dipertajam 0.295 0.306 Di- atau trisakarida
dengan
0.18
analisis 0.18 Oligosakarida
KCKT 0.11 dengan DP lebih
0.11 tinggi
 Permasalahan dan penyelesaian
• Teknis
Penyediaan senyawa standar oligosakarida
madu yang diperlukan cukup memakan waktu
(+ 1.5 bulan) dan harganya mahal yaitu sekitar
Rp 500000-3000000
Tahap identifikasi oligosakarida dilakukan di
akhir Standar alternatif yaitu maltotriosa (DP
3) dan maltotetraosa (DP 4)