Mutasi, DNA Repair dan Rekombinasi DNA

Mutasi
- Mutasi adalah perubahan materi genetik (gen atau kromosom) suatu sel yang
diwariskan kepada keturunannya
- Tujuan mutasi adalah menghadapi perubahan alam yang sewaktu-sewaktu akan
timbul
Penyebab Mutasi
- Bahan-bahan yang menyebabkan terjadinya mutasi (mutagen) dibagi menjadi 3
- Mutagen bahan kimia, e.g. kolkisin dan zat digitonin
- Mutagen kimiawi dapat dipilah menjadi 3 kelompok, yaitu analog
basa, agen pengubah basa, agen penyela
- Mutagen bahan fisika, e.g. sinar ultraviolet, sinar radioaktif, dan sinar gamma
- Mutagen bahan biologi, e.g. virus dan bakteri diperkirakan dapat
menyebabkan mutasi

Mutasi Gen
- Mutasi gen pada dasarnya merupakan mutasi titik (point mutation)
- Terjadi perubahan kimiawi pada satu atau beberapa pasangan basa dalam satu gen
tunggal
- Perubahan urutan-urutan DNA atau mutasi titik merupakan perubahan pada basa N
dari DNA atau RNA
Jenis-jenis mutasi
1. Berdasarkan kejadiannya
a. Spontan (Spontaneous Mutation)
- Mutasi yang terjadi akibat adanya sesuatu pengaruh yang tidak jelas,
baik dari lingkungan luar maupun dari internal organisme tersebut
b. Induksi (Induced Mutation)
- Mutasi yang terjadi akibat paparan dari sesuatu yang jelas
2. Berdasarkan jenis sel yang bermutasi
a. Mutasi somatik
- Mutasi yang terjadi pada sel-sel somatik
b. Mutasi gametik germinal
- Mutasi yang terjadi pada sel gamet

Mutasi gen = mutasi yang terjadi dalam lingkup gen

a. Mutasi salah arti (missense mutation)
- Perubahan suatu kode genetik (umumnya pada posisi 1 dan 2 pada kodon)
yang menyebabkan asam amino yang terkait pada rantai polipeptida berubah.
Jenis mutasi ini disebabkan oleh peristiwa transisi dan transversi
b. Mutasi diam (silent mutation)
- Perubahan suatu pasangan basa dalam gen (pada posisi 3 kodon) yang
menimbulkan perubahan satu kode genetik tetapi tidak mengakibatkan
perubahan atau pergantian asam amino yang dikode.
Dapat juga disebabkan oleh transisi dan transversi
c. Mutasi tanpa arti (nonsense mutation)
- Perubahan kodon asam amino tertentu menjadi kodon stop
d. Mutasi pergeseran kerangka / perubahan rangka baca (frameshift mutation)
- Mutasi yang terjadi karena delesi atau insersi satu atau lebih pasang basa
dalam satu gen sehingga ribosom membaca kodon tidak lengkap.
Dapat terjadi akibat peristiwa transversi, transisi, insersi, dan delesi

Mutasi Gen - Transisi dan Transversi

 -
Mutasi Gen - Substitusi

-
Mutasi Gen - Insersi dan Delesi
 -

-
Mutasi Gen - Frameshift

Mutasi gen pada manusia yang mengakibatkan kelainan sickle-cell anemia (contoh)
1. Molekul DNA mengalami mutasi berupa penggantian basa timin dengan adenin pada
rantai nukleotida
 a.
2. mRNA menghasilkan triplet kodon GUA

a.
3. Asam amino yang dihasilkan berupa valin

a.

Sickle-cell anemia
 -

Mutasi kromosom
- Mutasi biasanya digunakan untuk perubahan gen, sedangkan untuk perubahan
kromosom yang dapat diamati dikenal sebagai variasi kromosom/aberasi
- Mutasi kromosom yaitu mutasi yang disebabkan karena perubahan struktur
kromosom atau perubahan jumlah
- Mutasi kromosom akibat perubahan jumlah kromosom
- Mutasi kromosom akibat perubahan struktur kromosom
 -

Perubahan jumlah kromosom

- Euploid : variasi dalam sejumlah set dasar kromosom (genom)
- Autopoliploid : kelipatan jumlah kromosom yang berasal dari genom spesies yang
sama
- Alopoliploid : kelipatan jumlah kromosom yang berasal dari genom spesies yang
berbeda
- Aneuploid : variasi jumlah kromosom yang diakibatkan adanya pengurangan atau
penambahan satu atau sejumlah kecil kromosom akibat gagal berpisah

Aneuploid
Gagal berpisah pada Meiosis I Gagal berpisah saat Meiosis II
Kelainan - kelainan pada manusia yang disebabkan oleh perubahan kromosom
- Sindrom down : trisomi 21 sehingga memiliki 47 kromosom
- Sindrom Klinefelter : tambahan kromosom X pada anak laki-laki menghasilkan XXY
- Sindrom Turner : Monosomi X pada anak perempuan menghasilkan XO
- Kromosom ekstra Y (XYY)
- Trisomi X (XXX)
- Sindrom Cri du chat : Delesi kromosom nomor 5
-

DNA repair
- DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami
kerusakan/kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal,
radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam replikasi DNA
- DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal agent maupun
secara spontan

-
 - Pada fase G1 (Gap 1) terdapat check point yaitu suatu tempat dimana susunan DNA
akan dikoreksi dengan seteliti-telitinya. Apabila ada kesalahan/kerusakan DNA
- Maka sel mempunyai dua pilihan, yaitu:
- Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair
- Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, DNA akan dimatikan supaya tidak
memberi pengaruh buruk lingkungan sekelilingnya. Kemudian sel dengan
DNA yang normal akan meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang
tersisa yaitu S (sintesis) G2 (Gap 2) dan M (Mitosis)

Mekanisme DNA Repair

A. Single Strand
1. Base excision
2. Nucleotide excision
3. Mismatch repair

B. Double Strand
1. Non homologous end joining
2. Homologous recombination

Komponen yang terlibat dalam DNA repair

Base Excision Repair (pemotongan basa)

● Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deaminasi atau alkilasi
● Tempat kerusakan basa tsb disebut “abasic site” atau “AP site”
 ● Enzim DNA glycoylase dapat mengenal AP site dan membuang basa dengan
memisahkan ikatan glikosidik antara basa dan gula
● Kemudian AP endonuclease membuang AP site dan nucleotide sekitarnya, celah
diperbesar oleh fosfodiesterase
● Dengan bantuan DNA polymerase strand ditutup dan dilekatkan olleh DNA ligase

Nucleotide excision repair

- Adalah memotong pada bagian strand DNA yang mengalami “bulky lesion” pada
nukleotida / pirimidin dimer
- Proses dimulai oleh enzim endonuclease, dengan membuat incise pada backbone
strand di dua sisi lesi
- Oligonukleotida yang rusak ditahan dalam dupleks dengan ikatan hidrogen pada basa
dari strand lain
- Selama replikasi, DNA dipisahkan oleh DNA helicase
- Setelah dipotong dan dibuang, maka celah diisi oleh DNA polymerasi dan strand yang
di repair dilekatkan oleh DNA ligase
 -

Pirimidin dimer
Nucleotida excision repair (pemotongan nukleotida)
- Pada E. coli terdapat enzim endonuklease (UVrA, UVrB, UVrC) yang terlibat dalam
proses pembuangan atau pemotongan DNA tersebut
- Nukleotida yang rusak tersebut dihilangkan sehingga terjadi kekosongan pada segmen
untaian nukleotida tersebut
- DNA polymerase I mensintesis nukleotida yang baru dan DNA ligase berperan dalam
penyambungan segmen DNA tersebut

Mismatch Repair (perbaikan yang tidak berpasangan)

 ● Pada tahap ini dilakukan perbaikan kesalahan-kesalahan yang terjadi ketika DNA
disalin
● Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap cetakannya begitu nukleotida
ditambahkan pada untaian
● Dalam rangka mencari nukleotida yang pasangannya tidak benar, polymerase
memindahkan nukleotida tersebut melanjutkan kembali sintesis
● Pasangan basa mismatch menyebabkan distorsi dalam bentuk double helix yang
timbul pada kesalahan replikasi
● Pada E.coli, basa mismatch direpair oleh enzim:
a. Mut S, mengenali lesi dan mengawali penyususna kompleks repair
b. Mut L, memotong pada sekuens GATC pada rantai unmethylated
c. Mut H, memindahkan bagian DNA yang mengandung GATC site/mismatch
● Celah pada rantai tunggal diisi oleh DNA polymerase III

Double strand break repair

- Kerusakan pada untai ganda ini terjadi ketika dua untai ini putus, berbahaya karena
dapat menyebabkan penyusunan ulang genom
- Irreparable
- Mekanisme : non homologous end joining, Homologous recombination
 -

Penyakit akibat defek pada DNA repair

Rekombinan DNA
Pendahuluan
- Teknologi rekombinan DNA merupakan teknik atau metode yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen dalam tabung reaksi, gen berasal dari sumber yang
berbeda
- Teknologi rekombinan DNA meliputi :
● Teknik pemotongan DNA (donor dan vektor)
● Teknik pembentukan DNA rekombinan
● Teknik kloning DNA rekombinan
● Teknik penapisan hasil kloning DNA
- Dalam bioteknologi, manusia berusaha memanipulasi atau memodifikasi organisme
atau komponen organisme supaya menghasilkan produk yang diinginkan / bermanfaat
- Salah satu bentuk manipulasi tersebut terjadi melalui perubahan informasi genetik
(DNA) suatu organisme melalui rekayasa genetik
● Rekayasa genetik menggunakan teknologi DNA rekombinan

Tahap teknologi DNA rekombinan

Materi penting yang digunakan dalam rekombinan DNA :

- DNA
- Enzim restriksi
- Vektor

Pemotongan DNA
- Pemotongan DNA (sumber dan vektor) dilakukan dengan bantuan enzim restriksi
endonuklease
- Enzim restriksi
 - Berperan sebagai gunting molekuler yang memotong pada titik tertentu (situs
pengenalan/recognition site):
- Berupa 4-8 pb dan bersifat palindom (urutan basa yang identik ketika
dibaca dari arah 5-3 dan 3-5)
- Memutuskan ikatan fosfodiester melalui hidrolisis
Urutan Basa Palindrom

-
Aktivitas enzim restriksi

-
- Penamaan enzim restriksi
- EcoRI

-
- Enzim restriksi akan menghasilkan dua pola potongan
- Ujung tumpul (blunt)
 - Ujung lengket (overhang atau sticky)
- Enzim restriksi yang berbeda akan menghasilkan pola potongan yang berbeda
pula
Enzim Restriksi
- Enzim restriksi: memotong DNA pada daerah spesifik
- Memotong daerah/urutan palindrome sequences, yaitu daerah yang memiliki two-fold
symmetry
- Krusial pada penelitian DNA, untuk sekuensing, hibridisasi
- Companies purify and market restriction enzymes

5’ OVERHANGS
● 5’ overhangs: The enzyme cuts asymmetrically within the recognition site such that a
short single-stranded segment extends from the 5’ ends.
● Misal: BamHI

3’ OVERHANGS
● 3’ overhangs: asymmetrical cutting within the recognition site, but ther result is a
single-stranded overhang from the two 3’ ends
● Contoh: Kpnl
BLUNT ENDS
● Blunt: Enzymes that cut at pricisely opposite sites in the two strands of DNA generate
blunt ends without overhangs
● Contoh: Smal

Enzim Restriksi
Jenis - jenis enzim restriksi

- Vektor
● Merupakan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA
ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel
tersebut
● Memiliki situs pengenalan bagi enzim restriksi; dapat bereplikasi /
memperbanyak diri pada sel inang; dapat memuat gen yang akan dimasukkan;
mengandung penanda selektif (selectable marker)
● Berupa :
- Plasmid (umum)
- Bakteriofage
- Kosmid
- BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
- YACs (Yeast Artificial Chromosome)

Teknik Pembentukan DNA Rekombinan

● DNA donor maupun vektor yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama
akan saling berhibridisasi (perpasangan basa-basa komplementer) melalui
pembentukan ikatan-H pada ujung-ujungnya (sticky ends)
● Enzim ligase membentuk ikatan fosfodiester antar DNA donor dan vektor
- Terbentuk DNA rekombinan

Hibridasi dan ligasi DNA Rekombinan

Teknik pembentukan DNA Rekombinan

Teknik Kloning DNA Rekombinan

● DNA rekombinan yang telah terbentuk selanjutnya diintroduksikan kedalam sel inang
melalui proses transformasi
● Sel inang yang digunakan umumnya berupa sel bakteri (E.coli):
● Informasi genetiknya sudah sangat dipahami
● Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan
● Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi

Teknik Penapisan Hasil Cloning DNA

- Penapisan dilakukan dengan menumbuhkan bakteri inang pada media selektif
- Mengandung antibiotik
- Mengandung senyawa tertentu: X-gal
- Bakteri inang yang membawa plasmid rekombinan akan resisten terhadap antibiotik
dan tidak mampu mengubah memecah X-gal (koloni berwarna putih)
 -

Seleksi Gen yang dikloning

- Bakteri inang yang membawa plasmid rekombinan (berisi gen yang diinginkan
maupun potongan gen yang tidak diinginkan) harus diseleksi
- Dilakukan dengan cara hibridisasi asam nukleat dengan menggunakan suatu penanda
(probe)
● Probe asam nukleat diberi label radio isotop sehingga pada saat penelusuran
dapat dilihat DNA klon yang komplementer dengan DNA probe yang
berikatan hidrogen secara spesifik

Aplikasi Teknologi Rekombinan DNA

● Manfaat teknologi DNA rekombia
- Dalam Bidang Kedokteran
- Produksi Insulin
 - Dalam Bidang Hukum
- Analisis sidik jari DNA

Produksi Insulin
Sidik jari atau forensik DNA
- Dilakukan dengan menganalisis Variable Number Tandem Repeats (VNTRs), yaitu
intron (daerah bukan pengkode) yang tersusun atas utasan berulan 20-100 bp pada
DNA
● Pola ulangan yang bersifat unik antar individu sehingga dapat menjadi “sidik
jari”
● Memanfaatkan teknik elektroforesis gel dan southern blotting of DNA
fragments
● VNTRs seseorang berasal dari informasi genetik yang diwariskan oleh kedua
orang tuanya (ibu dan/atau ayah)

Gel Elektroforesis
Southern Blotting of DNA Fragments
Aplikasi:
Researchers can detect specific nucleotide sequences within a DNA sample
with this method. In particular; Southern blotting is useful for comparing the restriction
fragments produced from different samples of genomic DNA.
Teknik:
In this example, we compare genomic DNA samples from three individuals: a
homozygote for the normal ▢-globin allele (I), a homozygote for the mutant sickle-cell
allelle (II) and a heterozygote (III)

Sidik jari atau forensik DNA

Aplikasi :
- Penentuan ke-bapak-an dan ke-ibu-an (Paternity and Maternity)
● Karena seorang mewarisi VNTRs dari orangtuanya, maka pola VNTRs
dapat digunakan untuk menentukan paternity dan maternity
- Identifikasi penjahat dan forensik
 ● DNA yang diisolasi dari darah, air mani (semen), rambut, sel-sel kulit,
atau barang bukti genetik lainnya yang ditemukan di tempat kejadi
perkara dibandingkan (melalui pola VNTR) dengan DNA dari
tersangka pelaku kejahatan, untuk menentukan bersalah atau tidaknya
si tersangka tersebut
● Pola VNTR juga berguna dalam menetapkan identitas dari korban
pembunuhan, juga dari DNA yang ditemukan sebagai barang bukti
atau dari mayat itu sendiri
- Paternity and maternity test