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Ano 11

| Número 3 | Setembro 2008

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3 Ano 11 | Número 3 | Setembro 2008 Eletroforese de Proteínas 1. Histórico “Ceux qui

Eletroforese de Proteínas

1. Histórico

3 | Setembro 2008 Eletroforese de Proteínas 1. Histórico “Ceux qui veulent opposer le Laboratoire à

“Ceux qui veulent opposer le Laboratoire à la Clinique et la Clinique au Laboratoire n’ont rien compris ni à la Clinique ni au Laboratoire.”

– C. RiChet, Lição inauguRaL na FaCuLdade de MediCina de PaRis

O termo “proteína” foi criado por Mulder, em 1839, referindo-se às substâncias químicas que integra-

vam a matéria viva, tanto animal como vegetal. O nome se originou do grego “proteios”, que significa “primário”, “essencial”, em função da sua significância biológica, já na época apontada pelo autor. Alguns anos mais tarde, em 1851, utilizando uma técnica de precipitação com ácido acético, Panum conseguiu separar uma fração das proteínas, que designou “caseína do soro”, sendo, posteriormente, em 1862, chamada de “globulina” ou “substância fibroplástica”, por Schimidt. Em 1866, Kuhne foi

o primeiro a citar as frações protéicas, obtendo duas partes, uma através da precipitação com anidro carbônico, que denominou de “paraglobulina”, e outra com ácido acético, que denominou de “alca- lialbuminato”, tendo sido posteriormente denominada de “seroglobulina”, por Weil e Hynius.

A comprovação de que as partículas coloidais, no caso concreto as proteínas, podem ser separadas

através das suas características de mobilidade frente a campos elétricos, constituindo o fundamento da eletroforese, teve início com os estudos de Michaelis, em 1909, que idealizou o tubo em “U”. A técnica foi aperfeiçoada por Sverdberg e Scott (1924), Sverdberg e Tiselius (1926) e Theorell (1935).

O desenvolvimento de metodologias para a medição dos componentes protéicos no sangue teve

início no final do século XIX, com a publicação, em 1878, do “Traité pratique et elementaire de chimie médicale” (Tratado prático e elementar de química médica), por Mehu, um químico francês do Hospital Necker de Paris, que propunha um método para a quantificação do que designou de

albumina ou albuminóides. O método que veio a se tornar a base para o sistema atual de eletroforese para a separação de proteínas foi desenvolvido no início dos anos 1930 por Arn Tiselius, ganhador

do prêmio Nobel

2. Conceitos

Eletroforese é um termo bastante amplo, que se refere à migração de solutos e partículas em um meio líquido, sob influência de um campo magnético. As proteínas possuem cargas positivas e negativas, sendo sua mobilidade eletroforética diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio. Existem atualmente dois tipos de metodologia de eletroforese:

2.1 Eletroforese convencional por zona

Existem atualmente dois tipos de metodologia de Eletroforese. Na metodologia convencional, de

eletroforese por zona, as proteínas migram em meio de suporte poroso como acetato de celulose, gel

de

agarose ou poliacrinamida, gerando um eletroferograma por zonas de proteínas.

2.2

Eletroforese capilar

A eletroforese capilar baseia a separação das proteínas pelo seu tamanho e outras propriedades

físico-químicas, através do fluxo em um tubo capilar. O método é semelhante à HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance) , que utiliza colunas similares à agarose, fornecendo resultados com- paráveis à eletroforese em gel de agarose.

Devido à sua alta resolução, a eletroforese capilar permite a separação de bandas pouco visíveis no método convencional, como os picos de Beta1 (transferrina e hemopexina) e Beta2 (complemento C3), resultando em um padrão de seis bandas. Estas características permitem ganho adicional na avaliação de pacientes com gamopatias monoclonais.

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2.3 Vantagens da Eletroforese capilar

Estudos clínicos demonstram uma maior sensi-

bilidade da eletroforese capilar (93 a 95%) para a detecção de gamopatias monoclonais, em relação

à eletroforese por zona em gel de agarose (86 a

91%). A eletroforese capilar é particularmente mais sensível à detecção de componentes monoclonais em pequenas concentrações, especialmente IgA ou cadeias leves, que podem não ser detectadas pela técnica em gel de agarose, devido à co-mi- gração com a transferrina e o C3. Outra vantagem

é a não detecção dos picos de fibrinogênio pela

eletroforese capilar, que é uma constante fonte de resultados falsamente positivos quando se utiliza

a metodologia convencional de eletroforese por

zona. O fibrinogênio, normalmente ausente nas amostras de soro, pode ser detectado em casos de coagulação incompleta do sangue (amostra processada em tempo insuficiente) ou quando o paciente se encontra sob utilização de drogas anticoagulantes.

O aumento da sensibilidade com a eletroforese capilar, permite ainda uma maior detecção dos casos de

bisalbuminemia adquirida, que pode ter relevância em algumas situações clínicas como em casos de fístulas pancreáticas, presença de ascite e uso de antibióticos.

Outra vantagem do método por capilaridade é a possibilidade de automação total do processo, que ga- rante maior qualidade e rapidez de resultados.

Figura 1

F igura 1

ElEtroFErograma por análisE capilar, mostrando as diFErEntEs zonas dE protEínas.

capilar , mostrando as diFErEntEs zonas dE protEínas . F igura 2 z onas dE ElEtroForEs

Figura 2

F igura 2

zonas dE ElEtroForEs com corrElação com as diFErEntEs protEínas.

ElEtroForEs com corrElação com as diFErEntEs protEínas . Nota: Pre A = pré-Albumina Alb = albumina

Nota:

Pre A = pré-Albumina Alb = albumina a1 Ac = alfa 1 -Antiquimiotripsina a1 Ag = alfa 1 -glicoproteína ácida a1 At = alfa 1 -antitripsina a2M = alfa 2 -macroglobulina aLp = alfa-lipoproteína

Pl = plasminogênio Hpx = hemopexina Hpt = haptoglobina AT3 = pré-Albumina b Lp = beta-lipoproteína C1q; C1r, C1s, C3, C4, C5, C1inh = complemento

Cer = ceruloplasmina CRP = proteína C reativa Fibr = fibrinogênio IgA, IgD, IgE, IgG, IgM = imunoglobulinas Tf = transferrina FB = fator B

3. Principais proteínas encontradas nas bandas eletroforéticas

3.1 Albumina

Elevado: Desidratação aguda

Diminuido: analbuminemia, inflamações, doença

hepática, glomerulopatias, lesão tubular, enteropa-

tia perdedora de proteínas, doença inflamatória in-

testinal, desnutrição protéica, linfomas, leucemias, hipertireoidismo e uso de corticóides. Durante a gravidez os níveis diminuem até a oitava semana, retornando ao normal em cerca de oito semanas após o parto. A bisalbuminemia, que é uma anor- malidade caracterizada pela presença de uma dupla banda na zona de albumina, pode ser congênita e

sem significância clínica, ou adquirida, e estar rela- cionada à utilização de antibióticos ou à presença

de

ascite ou de fístula pancreática.

O

aumento da intensidade da interzona albu-

mina/alfa-1 globulina pode acontecer em casos

de alcoolismo crônico e gravidez. A diminuição

está associada à cirrose, hepatites e inflamações.

3.2 Alfa-1 Globulina

Esta banda é composta basicamente pela alfa- 1-antitripisina. O restante (10%) se deve à alfa- 1-glicoproteína ácida, alfa-fetoproteína e certas proteínas carreadoras. As elevações desta zona estão associadas à reação de fase aguda, cirrose, disproteinemia familiar idiopática, Doença de Hodgkin, carcinomatose metastática, úlcera pép- tica, gravidez, enteropatia perdedora de proteína, estresse, colite ulcerativa, uso de estrógenos, cor- ticóides e antiinflamatórios. A diminuição nesta banda pode estar associada a hepatites virais agu- das, má-absorção, enfisema pulmonar, síndrome nefrótica e ao jejum prolongado.

3.3 Alfa-2 Globulina

Composta pela haptoglobina, alfa-2 macroglobu-

lina e ceruloplasmina. Esta zona encontra-se ra- ramente diminuída, uma vez que a diminuição

de um dos componentes é compensada pela el-

evação dos demais. Pode se encontrar elevada nas seguintes situações: Febre reumática, analbu- minemia, senilidade, hipoalbuminemia, glomeru- lonefrite, cirrose, diabetes, disproteinemia familiar idiopática, Doença de Hodgkin, doença aguda, carcinomatose metastática, cirrose hepática, in- farto agudo do miocárdio, mixedema, síndrome nefrótica, osteomielite, úlcera péptica, pneumo- nia, poliarterite nodosa, enteropatia perdedora de proteína, artrite reumatóide, sarcoidose, estresse, colite ulcerativa e uso de corticóides.

A haptoglobina é uma glicoproteína de síntese

hepática, que se liga de forma irreversível à he-

moglobina após a hemólise das hemácias. Valores diminuídos de haptoglobina são marcadores de hemólise. A alfa-2 macroglobulina é o princi-

pal inibidor das proteinases plasmáticas. A ceru- loplasmina contem 95% do cobre sérico. Níveis diminuídos ocorrem na doença de Wilson, des- nutrição, síndrome nefrótica, e enteropatia perde- dora de proteínas. Níveis elevados podem estar associados à reações do tipo “fase aguda”.

3.3 Beta Globulina

A fração beta 1 corresponde a transferrina e he-

mopexina e a fração beta 2 corresponde ao com- plemento C3. A transferrina é a principal proteína responsável pelo transporte de ferro. Em casos de anemia ferropriva, seus níveis se encontram eleva- dos. Níveis elevados podem ser encontrados em ca- sos de reação de fase aguda, neoplasias, desnutrição protéico-calórica e na perda de proteínas (síndrome nefrótica, enteropatia perdedora de proteína).

O complemento C3 é uma proteína de fase aguda

fraca e tardia, podendo também se encontrar ele- vada na obstrução biliar.

3.4 Gama Globulina

A fração gama corresponde à zona de migração das

imunoglobulinas (G, A, M, D, E). A interpretação

de variações nesta zona depende da faixa etária e

também de um mínimo de informações clínicas.

Hipogamaglobulinemia

• Hipogamaglobulinemia fisiológicano recém-nato.

• Imunodeficiência isolada ou total (envolvendo as três classes de imunoglobulinas, G, M, A), em crianças e adultos.

• Hipogamaglobulinemia secundária, devido à utilização de corticóides, terapia imunossupres- sora, quimioterapia ou radioterapia.

• Hipogamaglobulinemia do mieloma de cadeias leves: o diagnóstico será confirmado através da detecção de proteína de Bence-Jones na urina.

Hipergamaglobulinemia

• Hipergamaglobulinemia policlonal (aumento difuso), observado principalmente em infecções hepáticas, AIDS ou doenças auto-imunes.

• Hipergamaglobulinemia monoclonal (pico mo- noclonal homogêneo), podendo estar associada com doença maligna (mielona ou doença de Waldenström), em conjunto com leucemia lin- fática crônica ou linfoma, ou gamopatia be- nigna, vista em pacientes idosos.

• Na presença de pico monoclonal na zona gama, é necessário a eliminação da possibilidade de se tratar de fibrinogênio remanescente (o que não ocorre com a utilização de eletroforese capilar).

• Hipergamaglobulinemia oligoclonal (vários e pequenos picos). Em casos específicos, a hiper- gamaglobulinemia é resultante da elevação de subclasses de imunoglobulinas. Estas bandas são derivadas da síntese de anticorpos contra

richet nouvelles

vários antígenos e só podem ser identificadas quando são utilizadas metodologias de alta resolução, como a eletroforese capilar. Geralmente, estas imunoglobulinas correspondem a:

- Doenças auto-imunes: artrite reumatóide, síndrome de Sjögren, lupus eritrematoso, esclerose sistêmica progressiva.

- Anticorpos contra proteínas virais: HIV, hepatite viral, meningite, infecção por citomegalovirus.

- Resposta auto-imune em pacientes transplantados sob terapia imunossupresora.

- Resposta imune em indivíduos normais: 1 a 5% dos indivíduos normais podem apresentar forma oligoclonal sem significado clínico. Este tipo de elevação monoclonal geralmente está presente em baixas concentrações e de forma transiente.

Conclusões

A eletroforese de proteínas permanece como uma forma fácil e comum de investigação, sendo de utilidade para a confirmação de caos de estados inflamatórios ou infecciosos, com respectivas elevações poli ou monoclonais de gamaglobulinas. A eletroforese capilar torna o teste mais sensível e específico, possibilitando a detecção de alter- ações que não poderiam ser vistas através das técnicas tradicionais.

Referências Bibliográficas

1. Didier Le Carrer, Serum protein Electrophoresis Immunofixation, Edition FM-BIO, Vanves, 2005.

2. J. Villar Caso, Las proteínas Del Plasma, Editorial Científico-Médica-Barcelona, 1950.

3. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry 5th Ed., 2001.

Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry 5th Ed. , 2001. E xpEdiEntE Responsável Técnico e Autor dos

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