MODUL 6

UJI BIOKIMIA DAN IDENTIFIKASI

MIKROBA
PENDAHULUAN

Biokimia merupakan ilmu mengenai dasar molekuler kehidupan yang bertujuan untuk mencari
jawaban tentang bagaimana benda mati yang menyusun organisme hidup berinteraksi satu dengan
yang lain untuk mempertahankan dan melangsungkan keadaan hidupnya. Uji fisiologis biasanya
identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri
atau mikroorganisme yaitu antara lain uji koagulase, uji katalase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji
hidrogen sulfida (H2S) dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat
penting di dalam dunia mikrobiologi.

Penggunaan zat hara tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba. Metabolisme seringkali
menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme.
Pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari kemampuan
mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti karbohidrat,
lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu dilakukan pula pengamatan pada molekul-molekul
sederhana seperti asam amino dan monosakarida. Dan hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk
perincian dan identifikasi mikroorganisme.

TUJUAN

1. Praktikan mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme

berdasarkan hasil pengujian yang meliputi: hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis kasein,
hidrolisis gelatin, hisrolisis indol, Uji H2S dan motilitas, reaksi susu litmus, fermentasi
karbohidrat, penggunaan TSI, uji MR-VP, Uji penggunaan sitrat, uji katakase, uji nitrit, dan
uji urea.
2. Praktikan dapat menentukan morfologis bakteri dan fungi yang akan diidentifikasi
3. Praktikan dapat melakukan identifikasi genus dan spesies bakteri berdasarkan hasil
pengamatan morfologi dan uji biokimia
4. Praktikan dapat melakukan identifikasi genus dan spesies jamur berdasarkan pengamatan
morfologi

ALAT DAN BAHAN

1. Alat: Erlenmeyer, bunsen, gelas ukur, pipet ukur, neraca analitik, batang pengaduk, tabung
reaksi, rak tabung, autoklaf, jarum inokulator
2. Bahan: Akuades, NA, lemak, reagen CuSO4, kasein, gelatin, kaldu tripton 1%, larutan kovac,
kaldu susu litmus, kaldu sukrosa, glukosa, laktosa, Agar TSI, MRVP, methyl red, KOH, α-
naphtol, agar sitrat simon, nitrat, dan urea.

22
6.1 UJI BIOKIMIA
Secara umum, uji biokimia bertujuan untuk mengetahui tentang senyawa-senyawa yang ada dalam
sistem hidup, penyusunan senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-sel dan interaksi kimia yang
terjadi. Sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari biomolekul. Untuk dapat mempertahankan hidup,
sel-sel mengalami metabolisme (reaksi pada sel). Isolasi dan determinasi mikroba dikakukan untuk
tujuan tertentu, seperti: menentukan keberadaan sifat patogen, mencari jenis mikroba yang berguna
pada proses industri, penentuan jenis dalam tatanan taksonomi dan lain-lain. Karakterisasi dan
klasifikasi sebagian besar mikrobia seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun
biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu
yang dideteksi dengan interaksi mikrobia dengan perubahan warna reagen, dan reaksi-reaksi dalam
sel dapat diketahui. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya,
misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis
lemak yang digunakan untuk menguraikan hidogen peroksida (H2O2).

HIDROLISIS PATI
Hidrolisis pati terjadi karena adanya enzim amilase yang dapat dihasilkan oleh mikroorganisme
tertentu. Sifat ini digunakan sebagai salah satu penentu jenis mikroorganisme dalam taksonomi.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan bakteri sampel pada medium pati menggunakan metode gores secara aseptis
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium pati padat pada suhu ruang selama 24 -48 jam
3. Metode pengujian: Tetesi 3-4 tetes reagen Iodin di sekitar koloni bakteri yang tumbuh,
biarkan selama 30 detik
4. lakukan pengamatan keberadaan warna biru kehitaman atau sama seperti medium
awal berwarna bening sebagai hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

HIDROLISIS LEMAK
Hidrolisis lemak mengguraikan molekul lemak menjadi gliserol dan asam lemak. Asam lemak
kemudian dibentuk menjadi bagian lemak bakteri atau komponen sel lainnya, atau dioksidasi untuk
menghasilkan energi. Hasil dekomposisi lemak ini akan menghasilkan bau tengik dan perubahan pH
substrat menjadi rendah akibat terbentuknya asam lemak.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan bakteri sampel pada medium agar lemak dengan menggunakan metode
gores secara aseptis
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium agar lemak pada suhu ruang selama 24 -48 jam
3. Metode pengujian: Tetesi 3-4 tetes reagen CuSO4 disekitar koloni bakteri yang tumbuh,
biarkan 5-10 menit
4. lakukan pengamatan keberadaan butiran asam lemak berwarna biru kehijauan sebagai hasil
positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

HIDROLISIS KASEIN
Kasein merupakan protein pokok susu yang berupa suspensi koloid, sehingga menyebabkan warna
susu terlihat putih mengkilat.

23
PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan bakteri sampel pada medium agar susu dengan menggunakan metode
gores secara aseptis
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium agar susu pada suhu ruang selama 24 -48 jam
3. lakukan pengamatan keberadaan zona bening yang terihat di sekitar koloni bakteri yang
tumbuh sebagai hasil positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

HIDROLISIS GELATIN
Gelatin dapat digunakan sebagai substrat yang baik untuk menguji keberadaan enzim proteolitik
yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Larutan gelatin yang digunakan pada percobaan ini
merupakan medium yang bersifat cair pada suhu ruang dan padat pada suhu rendah dengan kisaran
0
0-4 C.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium agar gelatin nutrisi

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium agar gelatin nutrisi dengan metode tusuk pada
suhu ruang selama 48-72 jam
3. Metode pengujian: inkubasikan medium agar gelatin nutrisi yang telah dinokulasikan oleh
0
bakteri sampel dan diinkubasi pada inkubator es (suhu 0-4 C) selama 15-30 menit
4. lakukan pengamatan perubahan medium menjadi padat sebagai hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

PRODUKSI INDOL
Indol adalah senyawa N yang terbentuk dari degradasi triptofan oleh bakteri. Keistimewaan dari
proses ini adalah hanya beberapa bakteri yang dapat menghasilkan indol dan dengan mudah dapat
dideteksi. Kultur yang ditanam pada medium yang mengandung protein dan karbohidrat mungkin
tidak dapat menghasilkan indol karena karbohidrat akan diubah menjadi asam dengan cepat dan
mengganggu aktivitas enzim pemecah protein.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium kaldu tripton 1%

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu tripton 1% pada suhu ruang selama 48-72
jam
3. Metode pengujian: teteskan 5-7 tetes larutan kovac hingga terlihat lingkaran seperti cincin
4. lakukan pengamatan pembentukan cincin merah pada permukaan medium sebagai
hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI H2S DAN MOTILITAS

Aktivitas kimiawi bakteri terhadap asam amino yang mengandung sulfur akan menghasilkan gas H 2S.
Reaksi ini mudah untuk dideteksi karena bau gas H2S yang seperti telur busuk atau terjadinya
penghitaman blackning.

24
PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium SIM agar dengan menggunakan metode
tusuk atau stab
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium SIM agar pada suhu ruang selama 48 jam
3. lakukan pengamatan motilitas dan pembentukan warna hitam pada medium sebagai hasil
positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

REAKSI SUSU LITMUS

Substansi utama susu seperti laktosa, casein, laktosa albumin dan laktoglobulin mampu melakukan
transformasi. Perubahan-perubahan yang terjadi sebagai hasil dari aktivitas metabolisme dapat
diketahui dengan menambahkan indikator pH atau redoks Litmus. Susu Litmus dapat menunjukkan
berbagai keadaan yang berbeda sebagai hasil reaksi enzimatis dari mikroorganisme yang diinokulasi
ke dalamnya, yakni : fermentasi laktosa, produksi gas, reduksi Litmus, pembentukan curd atau dadih,
proteolisis dan reaksi alkalis.

a) Fermentasi laktosa dan produksi gas

Proses ini dilakukan oleh mikroorganisme yang mampu menggunakan laktosa sebagai
sumber karbon untuk menghasilkan energi. Enzim yang terlibat adalah enzim-enzim beta-
galaktosidase
Litmus ungu menjadi merah:
Laktosa ----Enzim ---- glukosa ---- glikolisis --- asam laktat + CO2
Asam laktat yang terbentuk menurunkan pH medium sehingga indikator warna pH
dalam medium Litmus berubah dari ungu menjadi merah. Gas CO2 dan H2 yang juga
terbentuk menyebabkan ‘crud’ (dadih) pada susu terpecah-pecah.

b) Reduksi Litmus
Fermentasi laktosa merupakan reaksi anaerob yang tidak membutuhkan oksigen sebagai
akseptor elektron. H2 yang tidak terikat oksigen kemudian diikat oleh komponen akseptor
elektron dalam medium susu Litmus sehingga medium tersebut tereduksi dan warnanya
berubah dari ungu menjadi putih susu.

c) Pembentukan ‘curd’ (dadih)

Aktivitas biokimia oleh mikroorganisme yang berbeda terhadap susu Litmus dapat
menghasilkan ‘curd’ atau clot, dapat berupa dadih susu atau keju (‘curd’ dan ‘rennet’).
Curd asam (acid curd) terjadi bila kasein mengendap oleh adanya asam laktat atau asam
organik lainnya sebagai Ca-caseinat. Endapan ini (clot) sukar larut dan menempel pada
dinding tabung sehingga mudah diamati, sebab bila tabung dibalikkan akan tetap
menempel, tak terlepas dari dinding. Curd keju (‘rennet’) dihasilkan dari perubahan kasein
menjadi parakasein yang kemudian bereaksi dengan Ca+ menjadi endapan sukar larut (clot)
Ca-parakaseinat. Endapan ini lunak dan semisolid, sehingga akan terlepas dan tumpah bila
tabung dibalikkan.

25
 d) Proteolisis (peptonisasi)
Mikroorganisme yang tidak dapat menggunakan laktosa sebagai sumber energi akan
menggunakan protein sebagai sumber energinya. Enzim proteolitik akan menghidrolisis
kasein menjadi asam amino dan amoniak yang mengubah pH medium menjadi basa (alkali).
Litmus akan mengumpul di permukaan berwarna ungu tua, sedangkan medium susu akan
terlihat sebagai cairan kecoklatan dan bening, karena telah menjadi larutan asam amino.

e) Reaksi alkali
Reaksi yang terjadi adalah degenerasi parsial dan kasein menjadi polipeptida dengan rantai
pendek. Secara keseluruhan reaksi ini merupakan reaksi alkali, yang tidak mengubah warna
Litmus yang ungu. Keadaan medium Litmus sebelum dan setelah reaksi berlangsung tampak
tidak berubah.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium kaldu susu litmus

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu susu litmus pada suhu ruang selama 24-48
jam
3. lakukan pengamatan perubahan warna dan tekstur dari medium
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

FERMENTASI KARBOHIDRAT
Dalam uji fermentasi, medium yang mengandung senyawa karbohidrat sederhana (gula) dipecahkan
oleh enzim mikroba menjadi produk akhir berupa senyawa asam organik yang dapat menurunkan
pH serta kemungkinan dihasilkannya gas CO2. Keistimewaan pada pengujian ini adalah setiap
mikroba memiliki kemampuan fermentasi gula yang berbeda-beda, mulai dari gula sederhana hingga
gula kompleks.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada masing-masing medium kaldu sukrosa, glukosa,
dan laktosa
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu sukrosa, glukosa, dan laktosa pada suhu
ruang selama 24-48 jam
3. lakukan pengamatan perubahan warna medium menjadi kuning dan keberadaan gas pada
tabung durham sebagai hasil positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

PENGGUNAAN TRIPLE SUPER IRON (TSI)

Pengujian ini dilakukan untuk membedakan kelompok bakteri Enterobacteriaceae yang memiliki
berbentuk basil, gram negatif, dan menghasilkan hasil fermentasi glukosa positif dengan
pembentukan asam terhadap bakteri Enterobacteriaceae lain. Pembedaan dapat dilakukan berbasis
pola reaksi fermentasi terhadap karbohidrat dengan produk yang mengandung hidrogen sulfida.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan bakteri sampel pada medium Agar TSI miring dengan menggunakan metode
stab yang dilanjutkan dengan metode gores
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium Agar TSI miring pada suhu ruang selama 24-48 jam

26
 3. lakukan pengamatan perubahan warna medium hasil positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI METHYL RED DAN VOGES PROSKAUER

Uji MRVP dirancang untuk membedakan antara kelompok bakteri Enterobacteriaceae berdasarkan
prinsip hasil reaksi berupa senyawa asam organik yang stabil dan tidak stabil. Uji ini menggunakan
medium yang mengandung glukosa dan hasil fermentasi direaksikan dengan indikator pH Methyl
Red dan reagen α-naftol plus KOH 40%.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada masing-masing medium kaldu MRVP

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu MRVP pada suhu ruang selama 24-48 jam
3. Metode pengujian : MR  teteskan 3-5 tetes methyl red pada medium dan diamkan
beberapa menit sambil homogenesiasi dengan menggunakan tangan,
VP  tambahkan 10 tetes KOH, lalu 5 tetes reagen α-naphtol
4. lakukan pengamatan perubahan warna medium menjadi pink hingga merah pada kedua uji
sebagai hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI PENGGUNAAN SITRAT

Mikroba dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dengan menggunakan citrate permease
untuk mebawanya ke dalam sel lalu memecahnya dengan citrase menjadi piruvat dan CO2. Na2CO3
yang basa dideteksi oleh bromthymol blue sebagai indikator pada medium sebgai perubahan warna
dari hijau menjadi biru.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan bakteri sampel pada agar sitrat simon miring dengan menggunakan metode
gesek
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium agar sitrat simon miring pada suhu ruang selama
24-48 jam
3. lakukan pengamatan perubahan warna medium biru sebagai hasil positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI KATALASE
Bakteri aerobik menghasilkan senyawa senyawa radikal bebas berupa hydrogen peroxide atau
bahkan senyawa super oksida yang lebih toksik. Keberadaan enzim katalase yang dapat
memecahkan senyawa peroksiada menjadi air dan oksigen memungkinkan bakteri selamat dari
ancaman keracunan. Kehadiran enzim katalase dapat dideteksi dengan memberikan larutan H2O2 ke
permukaan kultur bakteri yang sedang tumbuh dalam medium agar. Terbentuknya gelembung udara
sebagai indikasi terbentuknya gas oksigen hasil pemecahan H2O2 membuktikan keberadaan enzim
ini.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada NA miring dengan menggunakan metode gesek
2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium NA miring pada suhu ruang selama 24-48 jam
3. Metode pengujian: Teteskan 5-10 tetes reagen H2O2 3%

27
 4. lakukan pengamatan pembentukan gelembung udara, dan kuantitasnya banyak atau sedikit
sebagai hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI NITRAT
Reaksi reduksi nitrat dilakukan oleh mikroba aerob/anaerob fakultatif unutk memperoleh oksigen.
- + -
Reaksi yang berlangsung dikatalis oleh nitrate reductase sehingga NO3 + 2H + 2e  NO2 + H2O.
Lalu akan ada kemungkinan pemrosesan lebih lanjut yakni pembentukan amonia atau pembentukan
gas hidrogen.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium kaldu nitrat

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu nitrat pada suhu ruang selama 24-48 jam
3. Metode pengujian: teteskan 5-7 tetes reagen asam sulfanilat, lalu 5-7 tetes α-naphthylamine
4. lakukan pengamatan perubahan warna medium menjadi merah sebagai hasil positif
5. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

UJI UREA
Urease merupakan enzim hidrolitik yang menyerang ikatan nitrogen dan karbon pada senyawa
amida seperti urea dan membentuk produk akhir yaitu ammonia yang bersifat basa.

PROSEDUR KERJA

1. Inokulasikan 1 ose bakteri sampel pada medium kaldu urea

2. Inkubasikan kultur bakteri pada medium kaldu urea pada suhu ruang selama 24-48 jam
3. lakukan pengamatan perubahan warna medium menjadi merah menyala sebagai hasil positif
4. catat hasil yang diamati dari masing-masing bakteri

28
6.2 PENGAMATAN MORFOLOGIS MIKROBA
Pengamatan morfologis suatu mikroba dapat dilakukan pada mikroba dalam keadaan hidup maupun
mati. Pengamatan morfologi bertujuan untuk mengenal suatu mikroba melalui pengenalan sifat
fisiologisnya yang kebanyakan merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesies. Bagian-
bagian sel dapat dilihat dengan terlebih dahulu memberi zat pewarna yang akan memberikan warna
untuk mempermudah identifikasi. Pengamatan morfologis mikroba sangat penting dilakukan untuk
memudahkan dan memastikan tahapan identifikasi mikroba yang dilakukan.

PEWARNAAN DAN PENGAMATAN BENTUK SEL BAKTERI

Pewarnaan dan pengamatan bentuk sel bakteri dilakukan untuk membantu dalam tahap identifikasi.
Hal ini disebabkan karena kelompok bakteri dipisahkan secara sederhana menjadi dua kelompok
besar yaitu berdasarkan hasil pewarnaan gram. Selain itu, bentuk dan susunan sel juga akan
membantu pada proses identifikasi lanjutan. Penentuan genus juga dapat dilakukan dengan melihat
keberadaan endospora, kapsula, atau alat gerak.

PROSEDUR KERJA

1. lakukan pewarnaan gram dan endospora seperti yang telah dipelajari pada praktikum
terdahulu
2. lakukan pengamatan hasil pewarnaan gram, keberadaan spora, bentuk, dan susuban
sel pada perbesaran 1000 kali dengan bantuan minyak imersi

PENGAMATAN MIKROSKOPIS MORFOLOGI JAMUR

Pada Jamur pengamatan morfologis sangat penting, karena setiap genus jamur memiliki bentuk
selular yang berbeda, mulai dari bentuk spora dan bagian sel vegetatif lainnya, seperti: keberadaan
septa, warna, dan struktur reproduksi.

PROSEDUR KERJA

1. potong (dengan agar) bagian paling pinggir dari koloni jamur yang tumbuh pada cawan petri
2. letakkan pada kaca objek yang telah ditetesi air, teteskan 3-5 tetes alkohol 70%
3. tutup dengan kaca penutup, dengan hati-hati tekan sampai bagian agar tertekan rata
4. dengan kertas tissue serap kelebihan air
5. amati bagian vegetatif, seperti: hifa bersepta/tidak, warna transparan atau gelap,struktur
reproduksi (penghasil spora dan bentuk spora) pada preparat jamur
6. apabila pengamatan kurang jelas pewarnaan dapat dilakukan dengan menambahkan 1-2
tetes lactophenol cutton blue setelah ditetesi alkohol

29
30