MAKALAH BIOLOGI MOLEKULER

PCR ( Polimerase Chain Reaction )

Oleh:

KELOPOK 5

POLITEKNIK BHAKTI SETYA INDONESIA

PROGRAM STUDI RPL DIII TEKNOLOGI TRANSFUSI DARAH

YOGYAKARTA

2020
 Pengantar

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena nikmat dan kesempatan
yang diberikannya sehingga makalah ini dapat terselesaikan sesuai dengan waktu
yang telah ditentukan. Makalah ini berisi tugas mata kuliah Genetika

Makalah ini terselesaikan tidak lepas dari bantuan banyak pihak. Ucapan terima
kasih penulis ucapkan kepada Bapak Seno Johari selaku dosen pengampu mata
kuliah Genetika yang telah membimbing dan mengarahkan jalannya pembuatan
makalah ini.

Penulis memohon maaf apabila terdapat banyak kesalahan dan kekurangan dalam
penulisan makalah ini. Kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan
dari semua pihak demi perbaikan makalah ini dimasa yang akan datang.

Yogyakarta,     Februari 2020

 
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan

(hereditas) serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga
ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut
pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi
kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya atau yang
menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual.
Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk
diwariskan (bahan genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan
ekspresi genetic dan bagaimana informasi tersebut dipindahkan dari individu
satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk
mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua
target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi
sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya.

1.2. Tujuan dan Manfaat

Tujuan dan manfaat dari mempelajari materi ini yaitu dapat mengetahui
kegunaan dari PCR, komponan-komponan PCR dan proses PCR.

 
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1.      Pengertian PCR (Polimerase Chain Reaction)

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR

(polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode
perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu
relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia
memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut.
Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi
molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang
kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase
adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens
tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA
yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
 

2.2.      Komponen

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA

polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

a.      Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida
pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan
rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR
 mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya
kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada
daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan
teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki
sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar
menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

b.      dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata ’ penyusun DNA yang
baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA,
yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

c.       Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk
mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim
DNA polymerase.

  d.      Ion Logam

 Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi

enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak
dapat bekerja.
 Ion logam monovalen, kalsium (K+).
 

2.3.      Prinsip Kerja

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20 –30 kali
siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR
dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini

(berlangsung pada suhu tinggi, 94–96  °C) ikatan hidrogen DNA
terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya
pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit)
untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini
 menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ( “patokan ”)
bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian
DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada
suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang
tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer
menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1 –2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung
dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase,
proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini
biasanya 1 menit.

Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat

denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi
templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya
dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah
karena penambahan terjadi secara ksponensial

Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu

sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-
masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer
yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya,
kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer
mundur(reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer
mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’
DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5 ’ ke 3 ’ atau
berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya) . Dengan demikian, pada akhir
putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA
templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir
putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu
seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh
fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang
 dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara
kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan
urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).
Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran
saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak
220 – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi
bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya,
hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika
DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal
dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan
digunakan sebagai fragmen pelacak.
 

2.4.      Perancangan Primer

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer.

Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan
dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya
pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya
harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi
dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu.
Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target.
Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua
primer yang akan digunakan.

Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai

kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan
serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah
diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer
yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada
isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen
lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan
sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
 Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut
kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan
homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah
lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari
inilah yang akan menjadi urutan basa primer.
Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran
urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian
diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat
mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam
amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian,
urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa
kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini
dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui
penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena
urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya
memperlihatkan homologi sempurna (100%).
Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis
menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan
terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri(self-homology) atau homologi
silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan
terjadinya salah tempel(mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens
target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-
masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus
mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.
 

2.5.      Aplikasi teknik PCR

Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada

tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai
macam kebutuhan, diantaranya:

a.      Isolasi Gen
 Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat
besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di
dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana kita tahu bahwa
fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai
panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip
menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan
rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome,
bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya
tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA ’, DNA ‘sampah ’
yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan
isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk
diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung
dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes,
proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping
karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan
insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat
mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu
menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat
memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan
yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal
diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah
ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan ’ sapi atau
babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal
dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama
dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik
PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

b.      DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA
Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode
Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi
menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah
reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya
menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan
 adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena
warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu
DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

c.       Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku
maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit
dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi
dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat
diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR
untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut
fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap
orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang
memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika
memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas
orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu yang
memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua
‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

d.      Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi
sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi.
Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan
akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat
ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat.
Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang
merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh
virus atau makhluk lainnya.

 
 

BAB III
KESIMPULAN

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR

(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)
merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Secara
prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara dua puluh sampai
tiga puluh kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu Tahap
peleburan (melting) atau denaturasi, Tahap penempelan atau annealing dan
Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap ketika, siklus diulang
kembali mulai tahap satu. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas
baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat
berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA
yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.
 

 
 DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,

David, J. C, Jannet L.,Comparison of Vitek® 32 and Microlog® ML3 System for

Identification of Select Biological Warfare Agents, Armed Force Institute  of
Pathology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 2001de Nogueira L.,
Bittrich, V.P.C., Shepherd, G. J., Lopes A. V., and Marsaioli, A. J. 2001.
 

Marlina, Radu, S., Kqueen, C. Y., Napis, S., Zakaria, Z., Mutalib, S. A. and
Nishibuchi, M. Occurrence of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolated
from Corbicula moltkiana Prime in West Sumatera, Indonesia. Southeast Asian
Journal of Tropical Medical Public Health Vol.38 No. 2 March 2007.
 

Marlina, Zulqifli, Anamerta, L., Revadiana, I., Radu, S., Kqueen, C. Y. and
Nishibuchi, M. Identification of Vibrio parahaemolyticus from clinical samples in West
Sumatera Using Polymerase Chain Reaction Methods. Acta
Pharmaceutica Indonesia 31 (2): 2007, 96-99.
 

Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk

diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB