Spektrofotometer

S
pektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur
absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang
tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari
cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya
yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu

sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan gabungan dari
alat optik dan elektronika serta sifat-sifat kimia fisiknya dimana detektor yang
digunakan secara langsung dapat mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It)
dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia), jadi tergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk.

Jenis-jenis

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu

spektrofotometer single-beam dan
spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua
jenis spektrofotometer tersebut hanya pada
pemberian cahaya, dimana pada single-beam,
cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai
yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari larutan
yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam,
pada spektrofotometer double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan
dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya adalah
dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua, dimana salah satu
melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati larutan
(disebut juga sample beam). Dari kedua jenis spektrofotometer tersebut,
spektrofotometer double-beam memiliki keunggulan lebih dibanding single-beam,
karena nilai absorbansi larutannya telah mengalami pengurangan terhadap nilai
absorbansi blanko. Selain itu, pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan
seperti perubahan intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase.

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
di transmisikan atau yang di absorpsi.

Filter Sinar

1
λ (nm) <400 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620 620-750 >750

warna UV Violet Biru Hijau Kuning Jingga Merah Infra Merah

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak o/ molekul, melalui 3 proses yaitu :

 Penyerapan o/ transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.

 Penyerapan o/ transisi electron d dan f dari molekul kompleks
 Penyerapan o/ perpindahan muatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :

E = hv

Dimana , E = energy (joule/second)

h = tetapan plank

v = frekuensi foton

Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pd sejumlah gugus fungsional/gugus

kromofor (gugus dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi
dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma,
phi dan non bonding electron. Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo,
nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang
gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan.
Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil,
metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan
mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih
besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik).

Komponen dari suatu spektrofotometer berkas tunggal :

1
1. Suatu sumber energy cahaya yang berkesinambungan yang meliputi daerah spectrum
dimana instrument itu dirancang untuk beroperasi.

2. Suatu monokromator, yakni suatu piranti untuk mengecilkan pita sempit panjang-
panjang gelombang dari spectrum lebar yang dipancarkan oleh sumber cahaya.

3. Suatu wadah sampel (kuvet)

4. Suatu detector, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu
isyarat listrik.

5. Suatu pengganda (amplifier), dan rangkaian yang berkaitan membuat isyarat listrik
itu memadai untuk di baca.

6. Suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik,
menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Adsorbansi (A).

Skema spektrofotometer ;

Sumber Cahaya..Monokromator….Sampel…Detektor….Amplifier..Piranti
Pembaca/Penunjuk

Beberapa jenis spektrofotometer :

1. Spektrofotometer UV-Vis

2. Spektrofotometer Infra merah

3. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)

4. Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR)

5. Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor)

6. Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya ( nefelometer, turbidimeter

dan spektrofotometer Raman)

Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak.:

1
Panjang gelombang warna yang diserap warna komplementer

400-435 nm ungu (lembayung) hijau kekuningan

450-480 nm biru kuning

480-490 nm biru kehijauan orange

490-500 nm hijau kebiruan merah

500-560 nm hijau merah anggur

560-580 nm hijau kekuningan ungu (lembayung)

580-595 nm kuning biru

595-610 nm orange biru kekuningan

610-750 nm merah hijau kebiruan

Pergeseran-pergeseran :

1. Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energy

yang lebih rendah.

2. Hypsokromik(pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih

pendek.

3. Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.

4. Hypokromik, reduksi absortivitas molar.

Penerapan spektrofotometrik

1
Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan
konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.

Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen

dalam lapisan-lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik
yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan
semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan
yang melewati medium.

Gabungan Hukum Bouguer-Beer, sering di tuliskan sebagai

A = abc atau A = εbc

Dengan A = absorbans

ε = absorpsivitas molar (jika konsentrasi dalam molar) dengan satuan M-1cm-1

a = absorpsivitas (jika konsentrasi dalam %b/v) dituliskan E1%1cm

b = panjang jalan/kuvet

c = konsentrasi ( dalam molar atau %b/v)

Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi)

Maka, A = – log (%T)

A = log (Po/P), Po adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan
melewati sampel.

Hukum Fotometri (Lambert-Beer)

1
 Metode analisa kuantitatip didasarkan pada absorpsi radiasi oleh suatu unsur
yang mengabsorpsi dan melibatkan pengukuran intensitas cahaya atau kekuatan
radiasi.Kita sekarang mempertimbangkan faktor yang mempengaruhi kekuatan radiasi
dari cahaya yang dipancarkan melalui media absorsi.

Anggap ketebalan sel absorpsi b dan konsentrasi c. Suatu berkas cahaya dari
radiasi monokromatik (yaitu panjang gelombang yang tunggal) dari kekuatan radiant I0
dalam larutan, dan suatu berkas cahaya yang muncul dari kekuatan radiasi I
dipancarkan oleh larutan.

Gambar 15.5. Absorbsi oleh larutan pada konsentrasi c

Kenaikan berurutan pada jumlah molekul absorbing yang identik di alur berkas cahaya
dari radiasi monokromatic menyerap pecahan energi radiasi yang sama.

Gambar 15.6. Penurunan intensitas radiasi dengan bertambahnya ketebalan larutan

Jika penambahanketebalan dari alur adalah db dan penurunan kekuatan radiasi yang
melewati ketebalan adalah dI maka :

d I a I db

1
yaitu dI = -kIdb

Integrasi dari total ketebalan b

yaitu ln I = -kb + w
sekarang jika : b = 0 , I = I 0
? w = ln I0
? ln I = – kb + ln I0

yaitu

Hukum ini dikenal sebagai Hukum Lambert dan menghubungkan ketebalan dari
sel sampel (kuvet) pada perbandingan kekuatan radiasi berkas cahaya yang masuk dan
berkas cahaya yang keluar, dan menyatakan :

“Ketika radiasi monokromatik lewat melalui suatu medium yang transparan yang
berisi suatu unsur absorbing, tingkat penurunan kekuatan radiasi dengan
ketebalan dari medium adalah setara dengan kekuatan radian dari suatu radiasi“

Dengan alasan yang sama, untuk perubahan penambahan konsentrasidari unsur

absorbing, dc ,

Hukum ini disebut Hukum Lambert-Beer, dan berlaku untuk unsur yang menyerap
cahaya dengan menghubungkan konsentrasi dari jenis absorbing pada perbandingan
kekuatan radiant berkas cahaya yang masuk dan yang keluar :

1
“Ketika radiasi monokromatk lewat melalui suatu medium yang transparan yang
berisi suatu unsur absorbing, tingkat penurunan kekuatan radian dengan
konsentrasi jenis unsur absorbing adalah sebanding dengan kekuatan radian dari
suatu radiasi “

Hukum Lambert dan Hukum Lambert-Beer biasanya dikombinasikan dalam suatu

hubungan tunggal sebagai dasar untuk semua penentuan kuantitatif.

Ini disebut Hukum Lambert-Beer. Hukum ini hanya berlaku untuk radiasi
monokromatik.

Karena jumlah kekuatan radiant I0 dan I merupakan sebuah perbandingan, ada beberapa
unit yang mungkin digunakan. Jika ketebalan, yang disebut panjang sampel dalam
bentuk centimeter dan konsentrasi, c dalam gram unsur absorbing per satu liter larutan,
kemudian konstanta a disebut absorptivitas (kadang disebut koefisien ekstensi)

Biasanya, c ditetapkan dalam konsentrasi molar, dengan b dalam sentimeter. Dalam hal
ini Hukum Lambert-Beer ditulis sebagai

dimana ? disebut absorptivitas molar (atau disebut koefisien ekstensi molar).

Absorptivitas molar memiliki satuan L. mol-1.cm-1

Jumlah log (I0/I) didefinisikan sebagai absorbansi dan diberi simbol A, sehingga
Hukum Lambert-Beer umumnya ditulis sebagai :

1
 A= εbc
Spektrofotometer modern dikalibrasi secara langsung dalam satuan absorbansi. Dalam
beberapa buku lama log I0/I disebut densitas optik dan I digunakan sebagai ganti simbol
P)

Perbandingan I/I0 disebut transmitans (T) dan beberapa instrumen disajikan dalam %
transmitans, ( I/I0 ) x 100. Sehingga hubungan absorbansi dan transmitans dapat ditulis
sebagai :

A = – log T

Dengan menggunakan beberapa instrumen, hasil pengukuran tercatat sebagai

transmitans dan absorbansi dihitung dengan menggunakan rumus tersebut.

Dari pembahasan di atas dapat dikatakan bahwa konsentrasi dari suatu unsur berwarna
harus sebanding dengan intensitas warna larutan. Ini adalah dasar pengukuran yang
menggunakan pembanding visual di mana intensitas warna dari suatu larutan dari suatu
unsur yang konsentrasinya tidak diketahui dibandingkan dengan intensitas warna dari
sejumlah larutan yang diketahui konsentrasinya.

Beberapa Istilah Dalam Spektrofotometri

Absorbans (A) , A = log (Po/P)

Absorptivitas (a), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan

dalam %b/v dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per gram per sentimeter.

Absorptivitas molar (ε), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi

dinyatakan dalam molar dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per mol per
sentimeter.

Transmitan (T), fraksi dari daya radiasi yang diteruskan oleh suatu sampel T = P/Po.
Sering dinyatakan sebagai suatu persentase : %T = (P/Po) x 100%.

Pengukuran Absorbansi beberapa Senyawa

Asam askorbat merupakan salah satu pereduksi yang dapat menghasilkan

senyawa kompleks berwarna. Dalam metode asam askorbat, ammonium molibdat
bereaksi dalam medium asam dengan fosfor membentuk kompleks fosfomolibdat

1
berwarna kuning yang akan direduksi menjadi kompleks biru-molibdem (molybdenum
blue) oleh asam askorbat yang mempunyai panjang gelombang absorbansi maksimum
880 nm.

Serapan vitamin larut air pada panjang gelombang 270, 275, dan 280 nm

No Vitamin Serapan pada Panjang

Gelombang

270 275 280

1 Asam askorbat 0,3542 0,2624 0,1755

2 Menadion natrium bisulfit 0,3540 0,2335 0,1245

3 Nikotinamida 0,2863 0,1097 0,0207

4 Asam folat 0,2346 0,2466 0,2437

5 Piridoksin hidroklorida 0,2272 0,3413 0,4666

6 Sianokobalamin 0,1191 0,1231 0,1180

7 Riboflavin 0,3376 0,2562 0,1839

8 Tiamin hidroklorida 0,2751 0,2009 0,1253

Bentuk kombinasi obat yang beredar di pasaran seringkali menimbulkan permasalahan

dalam kontrol kualitasnya terutama dalam hal validitas analisis kuantitatifnya. Salah
satu bentuk kombinasi tersebut adalah kombinasi asam askorbat dan α – tokoferol
asetat dalam suplemen antioksidan. Untuk mengatasi permasalahan diatas maka
penelitian terhadap campuran tersebut dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-
Vis Cara simultan. Pada penetapan kadar campuran zat secara simultan, tahap pertama
menentukan panjang gelombang terpilih masing – masing komponen, kemudian
menentukan serapan jenis masing – masing komponen.Dari tahap ini didapatkan
panjang gelombang terpilih pada 245 nm untuk asam askorbat dan 265 nm α –
tokoferol asetat.

Penelitian ini menguji tingkat validitas penerapan metode spektrofotometri UV-Vis

cara simultan dalam penentuan kadar campuran asam askorbat dan α – tokoferol asetat
baik tanpa bahan tambahan maupun dengan bahan tambahan Pada pembuatan
campuran asam askorbat danα – tokoferol asetat baik tanpa bahan tambahan maupun
dengan bahan tambahan dalam berbagai perbandingan, perlu ditambahkan larutan
standar a – tokoferol asetat sebanyak 50 ppm agar dapat masuk rentang pembacaan.

1
Hasil analisis data untuk linieritas, didapatkan koefisien relasi (r) hitung asam askorbat
pada panjang gelombang 245 nm adalah 0,9999 dan pada 265 nm adalah 0,9996 lebih
besar dari r tabel (0,878). Serta Vxo 0,62 % (245 nm) dan 1,17 % (265 nm). Sedangkan
untuk α – tokoferol asetat pada panjang gelombang 245 nm adalah 0,9996 dan pada 265
nm adalah 0,9999 lebih besar dari r tabel (0,878), serta Vxo 1,70 % (245 nm) dan 0,09
% (265 nm) Dari data tersebut dapat disimpulkan ada hubungan yang Tinier antara
kadar campuran asam askorbat dan a – tokoferol asetat dengan absorban.

Nilai serapan jenis yan& didapat untuk asam askorbat pada panjang gelombang 245 nm
sebesar 4,9275.10" dan pada 265 nm sebesar 1,4597.10"2. Sedangkan serapan jenis
untuk α – tokoferol asetat pada panjang gelombang 245 nm sebesar 1,5238. 10-3 dan
pada 265 nm sebesar 1,4828.10"3.

Sumber :
 http://id.wikipedia.org/wiki/Spektrofotometer

 http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/spektrum_serapan_ultraviolet-
tampak__uv-vis_/kesalahan-dalam-analisis-spektrometri-kuantitatif/

1
 http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/spektrum_serapan_ultr
aviolet-tampak__uv-vis_/analisis-kuanitatif/

 http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/spektrum_serapan_ultr
aviolet-tampak__uv-vis_/penyimpangan-hukum-beer/

 http://rgmaisyah.wordpress.com/2008/11/25/spektrofotometer/

 http://catatankimia.com/catatan/kaliberasi-spektrofotometer-
uv-vis.html

 http://210.57.222.58/go.php?id=gdlhub-gdl-s1-2008-pratokodwi-
9085&node=642&start=6&PHPSESSID=fb688e772e96670b5ed82380bb2f43e
8