In G. A. R. Melo & I.

Alves-dos-Santos, Apoidea Neotropica: Homenagem

mtDNA aos 90 Anos de Jesus Santiago Moure. Editora UNESC, Criciúma, 2003.
em meliponíneos 305

O DNA mitocondrial em estudos populacionais e

evolutivos de meliponíneos
Maria Cristina Arias
Flávio de Oliveira Francisco
Daniela Silvestre

ABSTRACT. The present work briefly reports some of our data concerning the application of different mtDNA analysis in
population and evolutionary studies of stingless bees. The utility of the data obtained from this small genome is
illustrated by the characterization of populations of Plebeia remota, by phylogenetic analysis among species belonging
to the genera Plebeia, Melipona and Schwarziana, and by the characterization of Melipona bicolor mitochondrial
genome showing tRNA genes translocation.

RESUMO. Esse trabalho relata, de maneira sucinta, os resultados obtidos em alguns estudos realizados pelo nosso
grupo de pesquisa. O objetivo é ressaltar a importância do genoma mitocondrial, e as diferentes análises a ele
aplicadas, para resolver questões de caráter populacional e evolutivo em abelhas sem ferrão. Os exemplos apresentados
abordam a análise populacional de Plebeia remota, análise filogenética entre espécies do gênero Plebeia, Melipona
e Schwarziana, e caracterização do genoma mitocondrial de Melipona bicolor por seqüenciamento evidenciando
translocações de genes para RNA transportador.

KEYWORDS. mtDNA; stingless bees; molecular markers.

INTRODUÇÃO raramente possui seqüências espaçadoras,

Desde as décadas de 70-80, do século passado, a
molécula do DNA mitocondrial (mtDNA) passou a fazer
parte de muitos, senão da maioria dos estudos envolvendo
estrutura populacional, relações filogenéticas e o
entendimento de vários aspectos biológicos e evolutivos
de uma grande variedade de organismos (WILSON et al.
1985; AVISE et al. 1987; MORITZ et al. 1987; AVISE 1993). O
que atraiu e ainda tem atraído os pesquisadores em utilizar
esse genoma em tais estudos, vem de suas caracte-
rísticas genéticas e estruturais extremamente peculiares
e únicas. Dentre essas características podemos citar:
1. É um genoma pequeno (com aproximadamente 16 kb
nos animais) e circular, com raras exceções.
2. Apresenta herança materna e ausência de recom-
binação, embora exceções também sejam descritas.
3. Possui poucos genes, 37 no total (13 genes
codificadores de proteínas, 22 para RNA transpor-
tadores e 2 para as subunidades ribossômicas). Esse
número de genes codifica para apenas 5% dos produtos
necessários para o funcionamento da mitocôndria.
4. Possui uma região não codificadora, conhecida como
D-loop (em vertebrados e equinodermas) ou região rica
em A+T (invertebrados), que parece exercer o controle
da replicação e transcrição do mtDNA.
5. É considerado como um genoma compacto, pois
seqüências repetitivas, pseudogenes e introns.
6. O conteúdo gênico é bastante conservado, e a ordem
em que esses genes se encontram organizados no
genoma costuma ser também conservada.
7. A taxa evolutiva, ou seja, de substituições de base é
muito alta, quando comparada a do genoma nuclear.
O emprego do mtDNA em estudos populacionais e
evolutivos se vale principalmente do fato dele possuir uma
alta taxa de substituições de base, apresentar alterações
no tamanho total da molécula devido a inserções e
deleções, principalmente na região rica em A+T, e mais
recentemente, do fato de que translocações de genes
codificadores de tRNA parecem ser mais freqüentes do
que se imaginava, acarretando assim em alterações na
ordem gênica entre organismos filogeneticamente
relacionados.
Várias metodologias têm sido aplicadas com o intuito
de se caracterizar esse genoma e/ou encontrar
variabilidade genética entre populações ou espécies.
Dentre os métodos de análise, os principais são: análise
com enzimas de restrição (RFLP-“Restriction Fragment
Length Polymorphism”); construção de mapa de restrição
para todo o genoma; amplificação via PCR seguido de
digestão com endonucleases; clonagem; e seqüencia-
mento.
Dentre os Hymenoptera, somente o genoma
306 Arias et al.
mitocondrial de Apis mellifera está completamente
seqüenciado (CROZIER & CROZIER 1993) e, em termos
moleculares esse genoma é rico em bases adenina e
timina, como também observado em outros insetos.
Estudos populacionais e evolutivos em abelhas têm
utilizado RFLP e seqüenciamento desse genoma, os
resultados têm sido muito efetivos na caracterização de
populações, subespécies e espécies, no entanto, esses
estudos se restringem quase que na totalidade às abelhas
do gênero Apis (MORITZ et al. 1986; SMITH 1988; ARIAS et
al. 1990; GARNERY et al. 1991; SHEPPARD et al. 1991;
GARNERY et al. 1992; OLDROYD et al. 1992; ARIAS &
SHEPPARD 1996; ARIAS et al. 1996; MEIXNER et al. 2000;
SMITH et al. 2000).
Em meliponíneos os estudos empregando o mtDNA
como marcador molecular em estudos populacionais e
evolutivos e em estudos de caracterização desse genoma
ainda são recentes. Temos trabalhado um pouco nesse
sentido, e a seguir descrevemos alguns exemplos de como
esse genoma pode acrescentar novas informações e
funcionar efetivamente como uma excelente ferramenta
no entendimento da biologia e evolução desse grupo de
abelhas.
CARACTERIZAÇÃO DE POPULAÇÕES
Freqüentemente, estudos populacionais utilizando o
mtDNA como marcador envolvem a caracterização desse
genoma por enzimas de restrição. A análise do número
de sítios gerados por enzima e a posição relativa destes
no mapa de restrição, são os parâmetros utilizados para
a determinação do que chamamos de haplótipos
mitocondriais. Em meliponíneos, foi realizado um estudo
(FRANCISCO 2002) envolvendo quatro populações de Plebeia
remota provenientes dos estados de São Paulo (Cunha),
Paraná (Curitiba e Prudentópolis) e Santa Catarina
(Blumenau e vizinhança), totalizando 70 ninhos. Para cada
um dos ninhos, haplótipos mitocondriais foram
determinados utilizando-se 15 enzimas de restrição. A
técnica de Southern Blot foi empregada para a detecção
dos fragmentos de DNA clivados. Foram encontrados 15
haplótipos diferentes: 4 em São Paulo, 4 em Prudentópolis,
5 em Curitiba e 2 em Santa Catarina, podendo-se
considerar esses haplótipos como local-específicos, dada
à exclusividade dos mesmos por região. No entanto, dois
haplótipos presentes em São Paulo também foram
encontrados em Curitiba. Embora a amostragem dessa
última localidade (5 ninhos) seja pequena, podemos inferir
que esse resultado seja um reflexo de um isolamento
recente entre essas duas populações, onde esses dois
haplótipos compartilhados fossem os mais freqüentes ou
ainda podemos interpretar esse resultado como decorrente
da ação humana, através do transporte de ninhos entre
essas regiões. Apesar do compartilhamento de dois
haplótipos entre São Paulo e Curitiba, as análises
estatísticas mostraram que as quatro populações
encontram-se isoladas, ou seja, estruturadas. As análises
de distância genética mostraram que a população de
Prudentópolis é a que mais se distancia das outras,
principalmente da de São Paulo (Fig. 1). Os mesmos
resultados, em termos de estruturação populacional e
distância genética, também foram obtidos em análises
com outro marcador molecular, agora de origem nuclear,
os microssatélites. Em geral, as evidências populacionais
e evolutivas obtidas nesse estudo vieram corroborar os
dados de comportamento e estrutura de ninho, observados
por pesquisadores do Laboratório de Abelhas do IB-USP,
indicando diferenças marcantes entre ninhos coletados
em Cunha e Prudentópolis (Imperatriz-Fonseca,
comunicação pessoal). As evidências moleculares e
comportamentais, sugerem que as abelhas P. remota
provenientes de Prudentópolis e Cunha possam constituir
duas unidades evolutivas independentes, e que
possivelmente estejam passando por um processo de
especiação.
O potencial informativo do RFLP do mtDNA para a
verificação de estruturação populacional em abelhas da
espécie P. remota abriu-nos a perspectiva de estudar
outras espécies de abelhas. Atualmente estão sendo
caracterizadas populações de Partamona mulata,
Partamona helleri e Melipona quadrifasciata.
CARACTERIZAÇÃO DE ESPÉCIES E FILOGENIA
A construção de mapas de restrição nos fornece uma
primeira caracterização do genoma mitocondrial, como
por exemplo, o tamanho completo do genoma, número
de sítios de restrição por enzima, posição relativa desses
sítios, e em comparação com outras espécies, a
determinação de regiões mais ou menos conservadas
desse genoma. A posição de sítios de restrição nesse
mapa serve como um marcador que pode auxiliar na
definição de espécies e na determinação das relações
filogenéticas entre espécies próximas.
Em meliponíneos temos trabalhado com 13 espécies,
sendo 5 do gênero Plebeia, 7 de Melipona e Schwarziana
quadripunctata. Os mapas de restrição para todas essas
espécies foram determinados, utilizando-se 17 enzimas
de restrição e a técnica de Southern Blot para a
identificação dos fragmentos. Para um melhor
posicionamento dos sítios de restrição, utilizamos também
a técnica de PCR+RFLP, o que permitiu também localizar
os sítios de restrição com relação aos genes presentes
no fragmento amplificado. O conhecimento do conteúdo
gênico dos fragmentos amplificados é possível, pois sabe-
se em Apis mellifera a posição dos primers utilizados
nos nossos estudos e, em conseqüência, o conteúdo
desses trechos. O tamanho total do genoma mitocondrial
dos meliponíneos estudados é de aproximadamente 18.500
pares de bases (pb), cerca de 2000 pb maior que o de
Apis mellifera. Tal diferença de tamanho parece residir na
região rica em A+T.
 mtDNA em meliponíneos
PRc PRc
SC
SP SP SC
0,0005 0,05
A PRp B PRp
Fig. 1. Fenogramas obtidos pelo método de Evolução Mínima
relacionando as quatro populações de P. remota: SP (São Paulo),
PRp (Prudentópolis, PR), PRc (Curitiba, PR) e SC (Santa Catarina). A.
Fenograma obtido a partir dos valores de δ. B. Fenograma obtido a
partir dos valores de FST.
Os dados obtidos para as 5 espécies de Plebeia
(FRANCISCO et al. 2001), mostraram a existência de sítios
de restrição espécie específicos e outros conservados
entre essas espécies e também em relação à Apis
mellifera, como o sítio Pst I localizado no gene da
subunidade ribossômica 16S. Foram mapeados no total
28 sítios de restrição, porém o número de sítios por espécie
variou de 16 a 23.
O mesmo tipo de estudo foi realizado para as espécies
de Melipona (WEINLICH et al. no prelo) e do mesmo modo
foram verificados sítios espécie específicos e outros
conservados entre essas espécies e Apis mellifera, como
também o sítio Pst I no gene 16S. Foram mapeados no
total 27 sítios de restrição, variando de 12 a 19 entre as
espécies.
Os dados obtidos de presença ou ausência de sítio de
restrição em determinada posição do mapa, nos
permitiram construir uma matriz e submetê-la a programas
computacionais de análise filogenética. Os dados do mapa
de restrição para a espécie Schwarziana quadripunctata
foram incluídos, embora o mapa de restrição ainda não
esteja publicado. A Fig. 2 contém a árvore obtida com os
dados de RFLP do mtDNA para as 13 espécies de
meliponíneos.
A resolução das relações filogenética obtida nesse
exemplo mostra que subespécies como Melipona
quadrifasciata quadrifasciata e M. q. anthidioides
apresentam distância genética menor do que a observada
entre as espécies do gênero, conforme esperado. Tal
resultado é um forte indicativo de que a metodologia de
análise de sítios de restrição pode fornecer dados
consistentes para esses estudos. É interessante notar
que a distância genética entre as duas amostras de
Plebeia remota é maior do que a verificada entre todas as
outras 4 espécies desse gênero. Vale ressaltar que P.
remota 1 é originária de São Paulo e P. remota 2 é de
307
Prudentópolis. Esse resultado corrobora os obtidos nas
análises populacionais de P. remota, novamente indicando
que as abelhas dessas duas regiões encontram-se
isoladas e muito possivelmente passando por um processo
de especiação.
EVOLUÇÃO DO GENOMA MITOCONDRIAL
Uma das características mais intrigantes do genoma
mitocondrial diz respeito à sua origem. Embora ainda
controversa, a teoria do endossimbionte tem sido a mais
aceita para a explicação da origem da mitocôndria e do
seu genoma. Essa teoria baseia-se em que uma célula
eucariótica teria fagocitado uma α-protobactéria e esta
se diferenciado em mitocôndria; durante esse processo,
parte do genoma da α-protobactéria teria sido transferido
para o núcleo celular e o inverso também teria ocorrido
(GRAY et al. 2001).
A origem da mitocôndria parece ter ocorrido uma única
vez na história evolutiva dos organismos; tal evidência é
apoiada pelo fato de que o conteúdo gênico mitocondrial
é altamente conservado entre os mais diversos
organismos. Essa conservação de conteúdo em uma
ampla gama de organismos dificilmente seria explicada
por convergência evolutiva.
Uma outra característica importante do genoma
mitocondrial é a ordem em que os genes estão arranjados
nesse genoma. Essa ordem é muito conservada,
principalmente em se tratando dos genes codificadores
de proteínas e das subunidades ribossômicas. Alterações
na ordem desses genes maiores só são verificadas entre
organismos filogeneticamente distantes, como por
exemplo entre insetos e mamíferos.
O genoma mitocondrial completo de Apis mellifera foi
obtido em 1993 (CROZIER & CROZIER 1993) e a ordem dos
principais genes (genes codificadores de proteínas) é
extremamente conservada quando comparada com
Drosophila. No entanto, 8 translocações de genes de tRNA
são verificadas. Dentre os genes mitocondriais, sabe-se
na literatura que estes últimos são os mais passíveis de
sofrerem rearranjos (CUROLE & KOCHER 1999).
A necessidade de conhecermos a seqüência de um
genoma mitocondrial de uma abelha nativa brasileira para
servir como referência para o desenho de primers, e
evidências indiretas de diferenças de tamanho de produtos
de PCR em relação ao esperado em Apis mellifera, nos
levaram a desenvolver o projeto de seqüenciamento do
genoma mitocondrial de Melipona bicolor (SILVESTRE 2002).
O tamanho total desse genoma já havia sido estimado,
por RFLP, em 18.500 pb. Desse total, aproximadamente
15.000 pb foram seqüenciados e anotados. Características
como propriedades físico-químicas das proteínas
codificadas, uso de códons, conteúdo de A+T, tamanho
dos genes, estrutura secundária dos tRNAs, regiões
intergênicas, e ordem gênica foram analisadas.
Assim como o genoma de Apis mellifera, o de Melipona
308
P. droryana
P. emerina
P. saiqui
Plebeia sp.
P. remota
1 rearranjos já foram descritos (CANTATORE et al. 1987;
2
P. remota
M. bicolor
M. compressipes
M. quadrifasciata anthidioides
M. quadrifasciata quadrifasciata
M. subnitida
M. melanoventer
M. rufiventris
Schwarziana quadripunctata
Apis mellifera
Fig. 2. Árvore filogenética obtida a partir de matriz gerada pela
presença/ausência de sítios de restrição, usando o método de Neighbor
joining (vide texto para detalhes adicionais).
bicolor, apresentou alto conteúdo de bases adenina e
timina (84,3% e 86,6%, respectivamente). A região
intergênica presente em Apis mellifera entre os genes
COI e COII e que parece desempenhar a função de uma
segunda origem de replicação e transcrição desse genoma
nessa espécie (CORNUET et al. 1991), está ausente em
Melipona bicolor. Evidências indiretas, obtidas por
amplificação in vitro (PCR) dessa região do genoma em
outras espécies de meliponíneos (15 espécies, totalizando
5 gêneros), também indicaram a ausência da região
intergênica. Se a presença ou ausência dessa região, e
seu possível papel funcional, estão relacionados com o
comportamento ou outros aspectos da biologia dessas
espécies, ainda é motivo de especulação.
A ordem dos genes codificadores de proteínas é
idêntica entre essas duas abelhas, no entanto pelo menos
nove translocações de genes de tRNA foram verificadas
(Fig. 3). Esse número de translocações é maior do que o
verificado dentre os insetos da ordem Diptera até o
momento seqüenciados.
O fato desses eventos de translocações serem
considerados raros entre organismos filogeneticamente
próximos faz dessa marca molecular uma forte ferramenta
em estudos de caráter evolutivo dentro da família Apidae,
pois essas nove translocações foram verificadas entre
espécies pertencentes a duas tribos diferentes. Mais
interessante ainda é o fato de que essas duas tribos são
as únicas nessa família a apresentarem somente espécies
com alto nível de eussocialidade. O estudo da ordem dos
genes mitocondriais em outras espécies de abelhas,
pertencentes a outras tribos, poderá acrescentar novas
informações a respeito da origem e evolução do
comportamento social nas abelhas corbiculadas.
De um modo geral parece que o genoma mitocondrial
dos Hymenoptera apresenta maior plasticidade em termos
de acúmulo desse tipo de rearranjo gênico. DOWTON &
AUSTIN (1999) verificaram alterações na ordem de genes
de tRNA entre vespas de uma mesma família, estudando
Arias et al.
uma única região do genoma, que parece ser um “ponto
quente”, do inglês hot spot, para esse tipo de alteração.
Os mecanismos moleculares que poderiam levar a esses
LEVINSON & GUTMAN 1987; MACEY et al. 1997; DOWTON &
AUSTIN 1999), porém o fato deles ocorrerem com maior
freqüência em abelhas e vespas é ainda um campo aberto
para pesquisas.
CONCLUSÃO
Os exemplos descritos acima ilustram o potencial
desse pequeno genoma em acrescentar informações
relevantes a respeito da biologia e evolução dessas
espécies, assim como sobre a própria evolução do genoma
mitocondrial em abelhas. Estudos complementares, com
a utilização de outros marcadores moleculares, como
microssatélites, e comparações multidisciplinares,
certamente contribuirão para a construção de um cenário
mais significativo a respeito da biologia das nossas
abelhas sem ferrão.
Agradecimentos. Dedicamos este trabalho ao Padre Moure por
todo o seu incentivo e interesse nos estudos moleculares e pelas
ricas discussões sempre repletas de muitas novas idéias.
Gostaríamos de agradecer à Susy Coelho pelo serviço técnico;
ao Ricardo Weinlich e à Daniela Rimoldi Cunha pelo desenvolvimento
experimental de alguns desses trabalhos; e à Dra Vera Lúcia
Imperatriz-Fonseca pelo fornecimento de amostras e pelo grande
apoio e incentivo. À FAPESP e CNPq pelos auxílios financeiros.
A. mellifera
E S M OA I CYW K T
S, O, C?
IAKM WY E T
M. bicolor
Fig. 3. Representação esquemática da ordem gênica mitocondrial de
A. mellifera e M. bicolor. Somente estão representados os genes
para tRNA que apresentaram posições diferentes no genoma das
duas espécies. As setas finas indicam as translocações e as setas
grossas circulares indicam inversões do sentido de transcrição dos
genes. As letras são as abreviações padrão para os aminoácidos
transportados por cada um dos tRNA, conforme a legenda: E: ácido
glutâmico; S: serina; M: metionina; O: glutamina; A: alanina; I: isoleucina;
C: cisteína; Y: tirosina; W: triptofano; K: lisina; T: treonina. Em M.
bicolor, a região assinalada “S, O, C?” não foi seqüenciada, mas
esses genes devem ocupar essa posição, não necessariamente
nessa ordem.
 mtDNA em meliponíneos 309

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