Bahan Ajar Rekayasa Genetika

Kuliah I: Pendahuluan
Copyright Statement:
Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)
bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum
disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.
Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran
sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus
mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran
dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana
berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
Rekayasa Genetika
• Nomor Kode/Beban SKS : PAE 412/ 3 (2-1)-

• Smester VII diusulkan menjadi semester VI
• Prasyarat : Lulus minimal nilai “C” mata kuliah
Pengantar Bioteknologi Pertanian (PAE311) dan
Biologi Molekuler (AEP 312)
• Pengasuh: 1. Prof. Dr. Sc. Agr. Ir. Jamsari, MP
• 2. Dr. Yusniwati, SP. MP.
• 3. Lily Syukriani, SP. MP.
Deskripsi Singkat
• Mata kuliah ini memberikan pembekalan tentang
pengertian rekayasa genetika dan prinsip-prinsip serta
metode yang dipergunakan dalam menghasilkan
organisme transgenik. Lebih detail mata kuliah ini
memberikan informasi tentang metode isolasi gen
target dan proses penyelipannya serta prinsip analisis
integrasi gen tersebut kedalam organisme target.
Disamping itu, juga diuraikan penggunaan beberapa
teknologi analisis molekuler yang dapat dipergunakan
untuk keperluan analisis genom. Pad bagian akhir juga
diuraikan tentang potensi resiko dan upaya-upaya yang
dilakukan untuk memperkecil potensi resiko yang
selama ini menjadi kekuatiran masyarakat.
Tujuan Instruksional Umum
• Setelah lulus mengikuti perkuliahan rekayasa

genetika ini mahasiswa diharapkan mampu
menjelaskan pengertian dan potensi
manfaatnya dalam perbaikan dan peningkatan
kesejahteraan masyarakat. Lebih jauh
mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan
prinsip isolasi gen target, penyelipan dan
prosedur analisisnya. Mahasiswa juga mampi
menjelaskan kemungkinan potensi resikonya
serta kemungkinan upaya-upaya yang dapat
dipergunakan untuk menghindari resiko yang
mungkin terjadi.
Strategi Perkuliahan
• SCL : Student centerred learning
• Ceramah, diskusi, pemecahan masalah, tugas
terstruktur, pemberian hand out, praktikum,
dan ujian
Materi Kuliah
Minggu Materi
I Pengertian dan Kontribusi Rekayasa genetika dalam berbagai kehidupan manusia
II Vektor kloning untuk transformasi genetik: plasmid, Phagemid.
III Vektor kloning berkapasitas besar : BAC, YAC, Cosmid
IV Transformasi genetik : heat shock, elektrophorasi, Agrobacterium mediated, Biolistik.
V Analisis Transforman : berbasis PCR, restriksi, hibridisasi.
VI Isolasi gen target I: berbasis fungsi dan Penyusunan Peta Genetik.
VII Isolasi Gen target II: Penyusunan Peta Fisik dan kloning berbasis PCR
VIII Analisis fungsional transforman
UTS
IX Pustaka cDNA dan EST (Expressed Sequence Tagged)
X Genome, Chromosome, Primer Walking untuk isolasi Gen.
XI Rekayasa Genetik untuk Peningkatan produksi dan perbaikan kwalitas Hasil Pertanian
XII Rekayasa Genetik untuk Produksi Ternak dan perbaikan kwalitas Ternak
XIII Sistem penanda molekuler untuk analisis genom I.-RAPD, isozym, RFLP, AFLP.
XIV Sistem penanda molekuler untuk analisis genom II.STS, CAPS, Mini/Mikrosatellit, SNP.
XV Stabilitas ekspresi genetik transgenik.
XVI Keamanan produk-produk transgenik.
UAS
Daftar Buku:
• Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula, Prinsip Dasar Teknik Analisis Molekuler. Unri-Press.
180 halaman.
• Jamsari, 2008. Pengantar Pemuliaan, Landasan Biologis, Genetis dan Molekuler. Unri Press.
• Lewin, B. 2000. Genes. Oxford-University Press. 990 pp.
• Watson, J.D., J. Tooze, D.T. Kurtz. 1983. Recombinant DNA, A short course. Scientific
American Book. 260 pp.
• Marshall, G., D. Walters. 1994. Molecular Biology in Crop Protection. Chapmann & Hall.
283 pp.
• Suzuki, D.T., A.J.F. Griffith, J. H. Miller, R.C. Lewontin. 1989. An Introduction to Genetic
Analysis. W.H. Freeman and Company. 768 pp.
• Kempken, F and R. Kempken. 2000. Gentechnik bei Pflanzen. Springer-Verlag. Berlin. 245
pp.
• Nevers, P. 1991. Pflanzenzüchtung aus der Nähe gesehen. Max-Planck-Institut für
Züchtungsforschung. 87 p
• Brown, T.A. 2007. Genomes 3. Garland Science Publishing.
• Clarck, D.P. 2005. Molecular Biology, Understanding the genetic revolution. Elsevier
Academic Press. USA.
Kriteria Penilaian :
Skoring penilain dilakukan sesuai dengan kriteria penilain yang
berlaku ditingkat Fakultas sebagai berikut:
Nilai dalam Point Rentang skor

huruf
A 4,00 85-100
A- 3,50 80-84
B+ 3,25 75-79
B 3,00 70-74
B- 2,75 65-69
C+ 2,25 60-64
C 2,00 55-59
C- 1,75 50-54
D 1,00 40-49
E 0,00 00-39
Komponen Penilaian:
1. Penguasaan Teori
Parameter : 1. UTS = 25%
2. UAS = 25%
3. Kuis (I+II) = 10%
2. Penguasaan Praktek Nilai Praktikum (30%), terdiri dari
a. UAP = 40%
b. Aktifitas selama praktikum (bertanya, diskusi, inisiatif,
kreatifitas)= 10%
c. Laporan praktikum = 20%
d. Seminar hasil praktikum = 20%
e. Kehadiran praktikum = 10%
Aturan dan ketentuan praktikum dibuat dalam ketentuan
tersendiri.
3. Tugas mandiri : 10%
Disiplin:
• Toleransi keterlambatan dalammengikuti
perkuliahan maksimal 15 menit berlaku untuk
Dosen dan mahasiswa yang disepakati pada hari
pertama perkuliaahan.
• Seluruh tugas yang diberikan dikumpulkan
sebelum perkuliahan dimulai. Setelah kuliah
dimulai, maka tidak akan diterima.
• Segala bentuk kecurangan (ujian, tugas,
plagiarisme, dll.) merupakan tindakan kriminal
dan memiliki sanksi akademik dan hukum yang
berlaku.
Kontrak Perkuliahan:
• Kuliah berdasarkan tatap muka, dan diskusi. Bilamana terjadi
pembatalan kuliah, maka akan diganti sesuai dengan jadwal yang
disepakati.
• Kuliah menerapkan sistem SCL (student centered learning)
• Pakaian kuliah harus rapi, tidak boleh berambut gondrong, pakai
kaos oblong dan sandal.
• Mahasiswa hanya diperkenankan mengikuti perkuliahan jika
terlambat ≤ 15 menit (besaran waktu ini ditentukan berdasarkan
kesepakatan bersama pada hari pertama kuliah)
• Kehadiran kuliah minimal 75 % atau 12 kali jika total kuliah 16 kali.
Kehadiran praktikum 100 %.
• Praktikum diatur sendiri oleh Penanggung jawab praktikum dengan
asistennya.
Demikian kontrak perkuliahan ini dibuat, agar disetujui dan ditaati
oleh semua pihak.
Padang, ....
Dosen Penanggungjawab Perwakilan/Komting Mahasiswa
.
Prof. Dr. Sc.agr. Ir. Jamsari, MP. ..................................................

Materi I. Pengertian dan Kontribusi Rekayasa genetika dalam
berbagai kehidupan manusia
No Tujuan Pokok Bahasan Sub Pokok Bahasan Est. Waktu Kepustak

Instruksional aan
Khusus
1. Mahasiswa Pengertian dan 1. Pengertian rekayasa 20 menit 1, 6, 7
mampu Kontribusi Rekayasa genetika. 20 menit
menjelaskan genetika dalam 2. Sejarah perkembangan 20 menit
pengertian berbagai kehidupan teknologi Rekayasa 20 menit
rekayasa manusia Genetika. 20 menit
genetika dan 3. Potensi pemanfaatan
manfaatnya teknologi rekayasa
bagi genetika dalam berbagai
kehidupan aspek kehidupan
manusia. manusia.
4. Keahlian yang dibutuhkan
dalam teknologi rekayasa
genetika.
5. Potensi Resiko
penggunaan produk
rekayasa genetika
terhadap kehidupan
manusia.
1. Pengertian Rekayasa Genetika.
• Scientific alteration of the structure of genetic

material in a living organism. It involves the
production and use of recombinant DNA and has
been employed to create bacteria that synthesize
insulin and other human proteins.
• (Life Sciences & Allied Applications / Genetics)
alteration of the DNA of a cell for purposes of
research, as a means of manufacturing animal
proteins, correcting genetic defects, or making
improvements to plants and animals bred by man
• The science of altering and cloning genes to
produce a new trait in an organism or to make a
biological substance, such as a protein or hormone.
Genetic engineering mainly involves the creation of
recombinant DNA, which is then inserted into the
genetic material of a cell or virus.
2. Sejarah Perkembangan Teknologi
Rekayasa Genetika
Timeline Perkembangan rekayasa Genetika
Tahun Kejadian penting
1865 Gen dianggap sebagai faktor partikulat
1900 Penemuan kembali hukum Mendel (Correns, Tschermak, de Vries)
1903 Khromosome adalah unit keturunan
1910 Gen-gen terletak pada kromosom
1913 Kromosome mengandung gen-gen yang tersusun secara linear
1927 Mutasi adalah perubahan physik pada gen
1931 Rekombinasi disebabkan oleh pindah silang
1944 DNA adalah materi genetik
1945 Gen adalah pengkode protein
1953 DNA berbentuk double helix (Watson dan Crick)
1958 Replikasi DNA bersifat semikonservatif
1961 Kode genetik tersusun secara triplet
1972 Kloning DNA ke dalam plasmid vektor
1976 Kloning gen pengendali insulin
Timeline Perkembangan Bioteknologi
Tahun Kejadian
1972 Dihasilkannya rekombinan DNA pertama dengan bantuan enzim Ligase,
Dihasilkannya organisme transgenik pertama oleh Cohen, et al.
1973 Ditemukannya teknik elektrophoresis dengan Agarose
1975 Sekuensing dengan metode pemutusan berantai
1975 Metode hibridisasi DNA
1977 Didirikannya perusahaan yang bergerak dalam teknologi gen: Genentech
1978 Diperkenalkannya RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
1981 579 gen manusia berhasil dipetakan diperkenalkannya Hibridisasi in-situ
1982 Genbank sekuens pertama didirikan
1983 Identifikasi pertama penyakit Huntington’s pada kromosom IV
1984 Diperkenalkannya Pulsefield Gel Elektroporesis (PFGE)
1985 Diperkenalkannya PCR (Polymerase Chain Reaction)
1987 Diperkenalkannya YAC (Yeast Artificial Chromosome)
1988 Didirikannya proyek pensekuenan genom manusia
1989 Peta lengkap pertama genome Hemophilius influenzae
1992 Peta tautan lengkap genome manusia pertama
Timeline Perkembangan Bioteknologi
Tahun Kejadian
1993 Diperkenalkannya ESTs (Expressed Sequences Tags), Dipublikasikannya
peta fisik pertama genome manusia
1995 Genom Haemophilus influenza dan Mycoplasma genitalium lengkap
disekuens
1996 Genom Saccharomyces cereviceae (Eukaryot) lengkap disekuens, juga
Eschericia coli , Methanococcus fannaschii (Archaeobacteria) lengkap
disekuens, Diperkenalkannya teknologi chip
1997 Dipublikasikannya peta fisik genom manusia yang lengkap
1998 Genom C. elegans selesai disekuens
1999 Genom Drosophila melanogaster selesai disekuens
2000 Genom Arabidopsis thaliana selesai disekuens
2000 Genome manusia H.sapiens selesai disekuens
2000 Genom Oriza sativa selesai disekuens
2002 Genom nyamuk Anopheles gambiae dan Plasmodium palcifarum
selesai disekuens
3. Potensi pemanfaatan teknologi
rekayasa genetika dalam berbagai
aspek kehidupan manusia
Penciptaan Varietas Resisten
• Resistensi terhadap Herbisida
Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman transgenik

pertama yang diusahakan secara komersial, dengan alasan:
1.Relatif mudah untuk menghasilkannya
2.Gulma dapat menyebabkan 10-15% pengurangan hasil
3.Penggunaan herbisida yang tidak saja mahal, akan tetapi juga tidak ramah
lingkungan.
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Herbisida Total X Herbisida Selektif
•Meracun terhadap semua jenis •Aktif pada dosis tertentu

tumbuhan terhadap tumbuhan tertentu
dengan karakter morfologi dan
fisiologi tertentu
•Cepat terurari di tanah
•Persistensi lama di tanah dan
•(Phosphinothricin, Basta=(WP) air.
PPT/10 hari), Glyphosat (Round up
•Atrazin, Bromoxynil, 2.4-D
(WP)/3-60 hari)

Penciptaan Tanaman Resistensi terhadap Herbisida
Herbisida Basta ®
Sumber gen Resisten: gen bar- dan gen pat- diisolasi dari
Bakteri tanah Streptomyces hygroscopicus dan S. viridochromogenes
Mutan Lucerne (Medicago sativa) gen toleran terhadap Basta
Produk: Phosphinothricin-acetyltransferase
Fungsi: detoksifikasi melalui proses acetilasi
Promotor: 35S-Promotor dari CaMV
Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai

Glyphosat
Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor)

dari A. tumifaciens strain CP4 (mutant)
Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Kapas, kentang, Jagung, kedelai, tembakau dan gandum
1996-1997 (USA):
Tanaman transgenik resisten herbisida menurunkan penggunaan herbisida
22-26%.
Erosi tanah menurun 90%, peningkatan produksi 5%
Problem :
kekuatiran tentang penyebaran gen herbisida resisten, dicoba
penggunaan plastida sebagai target untuk pengintegrasian gen asing

Resistensi terhadap herbisida

Resistensi terhadap Serangga
Pertimbangan:
Penggunaan insektisida yang jelas selain tidak ekonomis juga tidak ramah
lingkungan
Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga
Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin
European corn borer

Tanaman: Kapas, kentang, jagung, tomat
Keuntungan:
Kapas: penghematan insektisida 3,6 juta
liter, produksi 7% meningkat
Jagung : 300.000 kg (10%)
Western corn rootworm

Resistensi terhadap Serangga

Problem:
Ada serangga yang resisten terhadap δ_endotoxin,
Strategi lain:
Serin-Proteinase-inhibitor (menghambat enzim
pencernaan)

Resistensi terhadap Virus
Cross protection
Coat protein gen ditransfer sebagai pelindung thdp. virus asing
Source: www.apsnet.org

R-Gene (-Resistent Gen)
Resistensi terhadap Bakteri dan jamur
200 jenis bakteri bersifat pathogen (prokaryot)
8000 jenis jamur bersifat pathogen (Eukaryot) (100.000 jenis
nonpathogen)
Pathogen Tanaman Inang Gejala Penyakit
Bakteri
Agrobacterium tumifaciens Tumbuhan dikotil Pembentukan tumor
Erwinia amylovora Apel, peer
Pseodomonas syringae pv. lachrymans Timun Bercak daun
Streptomyces scabies Kentang Bisul
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Padi Blast
Jamur
Ophiostoma novo-ulmi Ulm Mati ulm
Phytoptora infestans Kentang Busuk umbi
Puccinia graminis Gandum Karat hitam

Kerusakan akibat Jamur dan Bakteri:
• Kerusakan morfologis, fisiologis

• kontaminasi (mycotoksin) didalam bahan makanan dalam jang-
ka panjang bersifat carcinogenic
Kasus Phytoptora infestans
Tanaman kentang di USA (1845),

kelaparan terparah di dunia sehingga
menyebabkan migrasi besar-besaran
dari Irlandia ke USA
Strategi:
- Chitinase untuk mencerna lapisan chitin dinding sel jamur (spesifik)
- α-Thionin terhadap Pseudomonas syringae, dan Fusarium oxysporum

Strategi
- Gen Cholinoxygenase dari bakteri Arthrobacter globiformis
menghasilkan Transgenik Arabidopsi thaliana toleran terhadap
kadar garam tinggi (Glycinbetain)
- Mannitol-Dehydrogenase (E. coli )menyebabkan akumulasi
mannitol yang bisa meningkatkan toleransi terhadap
kekeringan pada tanaman tembakau
- Quicsilberreduktase (bakteri) pada tanaman Liriodendron
tulipifera meningkatkan toleransi terhadap logam perak
- Gen Metallothionin pada tanaman tembakau meningkatkan
resistensi terhadap logam Cadmium

Toleran terhadap stress lingkungan (abiotic-stress)
• Panas,
• Dingin,
• Kekeringan
• Kadar Garam yang tinggi
• Kekurangan mineral
• Logam berat
• Radiasi UV-B

Gene glutathione dari E. coli
berperan dalam chelating untuk
mengurangi keracunan pollutant.
Deteksi pollutant
Rumput lapangan golf
 Tahan herbisida
 Tumbuh lambat
mengurangi pemangkasan
mengurangi polusi
Bio Steel
 Jaring laba-laba adalah protein terkuat
 Protein penyusu jaring laba-laba
diekspresikan di bulu domba
 Hasilnya utuk membuat baju tahan
peluru (Nexia)
Deteksi Ranjau Darat
Dibutuhkan oleh Angkatan Darat,
Tanpa upaya ini,anak-anak dan penduduk sipil terancam
Bantuan Bioteknologi Tanaman
(dikembangkan oleh Aresa Biodetection)
• Gen yang peka terhadap logam dimasukkan ke dalam
tanaman
• Apabila akar tanaman menyentuh ranjau darat,
Tanaman berubah warna dari hijau menjadi merah
Mendeteksi ranjau darat

Perubahan pada bahan makanan
Negara berkembang: kekurangan pangan
Negara Maju : Alergi, kualitas bahan makanan, transportasi
Strategi
- Gen AGPase (ADP-Glucose-phsoporilase) dari E. coli digunakan untuk
meningkatkan kandungan pati pada tanaman kentang
Sebaliknya teknik ekspressi antisense
Dihasilkan kentang yang menghasilkan amylopketin, tapi tanpa amylosa
(penting untuk industri)
- Gen Thioesterase dari Umbellularia californica dapat meningkatkan kandungan
Laurat pada tanaman Raps, berguna dalam pembuatan margarin

Perubahan pada bahan makanan
Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

- Pada tanaman padi dihasilkan tanaman transgenikj yang
mampu menghasilkan kadar β-Carotin yang tinggi. Untuk itu
empat macam gen pengkode empat macam enzim
diintegrasikan:
- Phyton-Synthase, Phytoen-Desaturase, ζ-Carotin-Desaturase
dan Lycopen-ß-Cyclase.
- Golden Rice

Rasa dan Daya Simpan
• Polygalacturonase dengan teknik antisense
dapat diinaktifkan dan daya simpan
menjadi lama.
• Tomat dengan tanda Flavr Savr®.
Bahan baku industri
•Poly (3HB) = PHB untuk menghasilkan materi
bioplastik. Berhasil dicobakan pada plastida
tanaman Arabidopsis thaliana dari gen
Ralstonia eutropha
Source: Wikipedia
E. coli
Produksi Metabolik Sekunder
• Alkaloid : Morphin = Atropin (Papaver somniferum)
Taxol untuk kanker dari Taxus brevifolia
• Bahan untuk imunisasi: Gen spaA menghasilkan
protein yang mampu mencegah karies gigi
proteins such as growth hormones, insulin, blood

substitutes, and trypsin inhibitor
Promega-3 fatty acid not from fish
PENGANTAR PEMULIAAN TANAMAN
Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY
RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar

Tumbuhan Normal Tumbuhan Steril (MS)
TA29 Barnase TA29 Barnase

TA29 Barstar
Barnase + Barstar
Barnase
Degradasi RNA di tapetum
Tapetum mati
Tapetum hidup
Pollen tidak terbentuk

Pollen terbentuk normal
Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA
References:
1. Hayward, et al. (1993). Plant Breeding-principles and prospects. Chapman & Hall.
2. Fehr, W.R. (1987). Prnciples of cultivar development. Macmillan Publishing. Co. New York.

4. Keahlian yang dibutuhkan dalam
teknologi rekayasa genetika.
Keahlian yang dibutuhkan
Ilmu
pendukung
Bidang Kajian
sesuai bidang Pertanian
kajian Kedokteran
Peternakan
Farmasi
Rekaya
sa Teknologi pangan
?????????
Genetik Lingkungan
Kehutanan
Industri
Nanoteknologi
5. Potensi Resiko penggunaan
produk rekayasa genetika
terhadap kehidupan manusia.
Potential Risk of GMOs
• Ecological aspects:
- Biodiversity of plants, insects, spiders, and other
animals.
- Crosspollination concerns,
• Human health aspects: Allergens and toxins, gene
transfer to microorganism within the body
• Horizontal gene transfer: soil bacteria could be
pesticide resistant
Strategies for Stopping the Spread of Foreign
Genes
Male sterility - Stopping pollen production

“Termination gene”
Chloroplast transformation - Keeping pollen

transgene-free
Keeping transgenic seeds from sprouting

Selesai
Bioteknologi Tanaman
Vektor Kloning Untuk

Transformasi Genetik:
Plasmid dan Phagemid.


Sub Pokok Bahasan
1. Pengertian vektor kloning untu transformasi

genetik.
2. Pengertian dan karakteristik plasmid.
3. Kapasistas kloning plasmid.
4. Pengertian phagemid.
5. Kapasistas kloning phagemid
1. Pengertian vektor kloning untuk
transformasi genetik.
Vektor Kloning
VEKTOR: Media untuk dan memperbanyak dan

mentransformasi fragmen DNA

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman
TRANSFORMASI GENETIK
1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens
Agrobacterium tumifaciens
adalah bakteri tanah penyebab
tumor pada tanaman
dikotiledon.
Pertama ditemukan tahun

1907, dilanjutkan dengan
penemuan plasmidnya yang
berukuran 200-800 kb.

Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut
dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid)
tms tmr nos
T-DNA = DNA transfer
noc = katabolisme
T-DNA Nopalin
LB
nos = sinthesis Nopalin
RB
tmr = sintesis Sitokinin
noc tms = sintesis Auxin
vir Ti-Plasmid vir = daerah virulen
ori = asal replikasi
tra LB = batas kiri
RB = batas kanan
ori

Kromosom dalam inti
sel tumbuhan
Agrobacterium
Pelukaan
Sel tumbuhan
Infeksi pada sel tumbuhan dan

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor

Vektor Kloning
Persyaratan Suatu Vektor:
1. Replikasi Autonom Dalam Inang
2. Berpenanda Untuk Seleksi
3. Berposisi Kloning Tunggal
4. Berberat Molekul Kecil
5. Memiliki Beberapa Kopi Pada Setiap Sel
6. Tidak Berkonjugasi

Vektor Kloning
Contoh Vektor:
1. Plasmid
2. Fag  (Fag M13)
3. Kosmid
4. P1- (PAC) (Plasmide Artificial Chrom.)
5. BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)

2. Pengertian dan Karakteristik
Plasmid
PLASMID:
Dna Ekstrakromosomal Berbentuk Sirkular Tertutup,

Berpita Ganda..
KROMOSOMAL DNA
PLASMID
Sumber: Wikipedia

Jenis-jenis Plasmid
F-plasmid: F adalah singkatan dari fertility,
Plasmid ini mengandung perangkat gen-gen tra.
R-plasmid: R adalah singkatan dari resistance
Col-plasmid, adalah plasmid yang mengandung
gen yang mengkode produksi senyawa
bakteriosin
Degradative plasmid, plasmid yang dapat
mencerna beberapa senyawa yang tidak umum
seperti toluene atau asam salisilat.
Virulence plasmid, adalah plasmid yang dapat
menyebabkan (Ti plasmid :Tumour inducing
plasmide
Elemen-elemen penyusun faktor F :
1. Ori T (origin of transfer): sekuens yang berfungsi
menandai titik awal selama transfer konjugatif.
2. Ori V (origin of replication): sekuen yang
berfungsi dalam replikasi di dalam sel resipien.
3. Daerah tra (transfer genes): gen yang mengkode
F-pilus dan pori-pori untuk transfer.
4. IS (elemen insersi): disebut juga dengan “gen
egois” yang fragmen yang dapat
mengintegrasikan dirinya sendiri pada lokasi yang
berbeda-beda.
Jenis bakteri berdasarkan keberadaan faktor F
1. Bakteri Hfr: bakteri yang memiliki faktor F yang

terintegrasi di dalam genom bakteri.
2. Bakteri F+: bakteri memiliki faktor F sebagai
plasmid yang independen dari genom bakteri.
Plasmidnya hanya mengandung sekuen dari
faktor F dan tidak mengandung sekuen DNA dari
genom bakteri.
3. Bakteri F’ (F-prime): bakteri yang memiliki
plasmid F tetapi didalamnya juga terdapat sekuen
DNA yang berasal dari genom bakteri.
4. Bakteri F-: bakteri yang tidak memiliki faktor F.
Kelengkapan Plasmid
Promoter
Marker (penanda) genetik
Resistensi antibiotik
Epitop
Daerah MCS
Kendali Host terhadap Replikasi Plasmid
 Kontrol ketat (stringed control) Kontrol longgar (relaxed control)

(10-200 kopi)

Contoh Peta Plasmid
SISTEM VEKTOR - INANG

Eco RI Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III
MCS = Multicloning Site
P O Z
lac
pBin19
Km® 10 kb

SISTEM VEKTOR - INANG

KLONING DALAM PLASMID
Bam HI Bam HI Bam HI
Eco RI Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III

MCS = Multicloning Site
DNA Asing
P O Z
lac
pBin19
Km® 10 kb

Ligasi fragmen dengan plasmid
DNA Asing
Km®
DNA Ligase

Ligasi fragmen dengan plasmid
DNA Asing
Km®

Isolasi DNA Plasmid
Tris, Buffer EDTA

CENTRIFUSE + NaOH dan SDS
Km® PELLET
CENTRIFUSE Km®
Km®
Km®
Km®
Km®
Km®
Km®

Penampilan DNA plasmid stlh diisolasi
Isolasi DNA Plasmid
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Plasmid untuk Kloning Produk PCR
Produk PCR
Produk PCR yang dihasilkan oleh enzim

DNA Polymerase non “Proofreading”
biasanya menghasilkan ujung Adenyl (A)
Plasmid Kloning Produk PCR
Source: Promega, USA

Differential RAPD-Fingerprinting
AA B
B
C
C
Cutting of specific fragments
OPN15-Cg
Before cutted After cutted
1400 bp (A#1)
900 bp (A#2)
750 bp (A#3)
Cloning RAPD specific fragment
pGem-T Easy Vector, supplied by Promega-USA

Cloning RAPD specific fragment
E. coli, strain DH5α

Analisis DNA Plasmid dan insersi
Sumber: Jamsari

Analisis DNA Plasmid dan insersi dengan PCR
1000 bp
750 bp
500 bp 520 bp
250 bp
200 bp
Analisis DNA Plasmid dan insersi dengan PCR
1000 bp
750 bp
500 bp 520 bp
370 bp
250 bp
Visualisasi hasil restriksi insert menggunakan enzim BamHI

3. Kapasistas Kloning Plasmid.
Kapasitas Tampung Beberapa Vektor
Vektor Inang Kapasitas kloning
Plasmid Escherichia coli ~ 5000 bp
Plasmid Saccharomyces ~ 5000 bp
cerevisiae
Plasmid Bacillus subtilis ~ 5000 bp
-Phage Escherichia coli 9 – 23 kb
Cosmid Escherichia coli 30 – 48 kb
P1-(PAC) Escherichia coli 85 – 110 kb
BAC Escherichia coli 30 – 350 kb
YAC Saccharomyces 50 kb – 2 Mb
cerevisiae

Vektor Berkapasitas Besar
4. Pengertian Phagemid
hibrida of the filamentous phage M13 dan

plasmids untuk menghasilkan vektor yang
dapat tumbuh sebagai plasmid dan juga dapat
dimuat sebagai DNA pita tunggal dalam
partikel virus.
Phagemid
Disamping memiliki ColEI ori plasmid tersebut juga memiliki f1-

ori. MCS diletakkan diantara gen Lac-Z. Vektor juga dilengkapi
dengan gen resisten antibiotik ampicilin
5. Kapasistas kloning phagemid
Vektor Kapasitas maks.(kb) Catatan

Plasmid 10-15 kb
Phagemid < 6 kb
λ-Phage < 25 kb
Cosmid < 50 kb
Sering ditemukan
YAC 20-2000 kb
khimera
P1-Phage 30-100 kb
BAC 100-300 kb
PAC 100-300 kb
SELESAI

Kuliah III.
Vektor kloning berkapasitas besar :

Cosmid, BAC, YAC,

Sub Pokok Bahasan
1. Manfaat kloning berkapasistas besar.

2. Jenis-jenis vektor plasmid berkapasitas
besar.
3. Pengertian dan karakteristik BAC, YAC dan
Cosmid.
4. Kekurangan sistem BAC, YAC dan Cosmid
Manfaat kloning berkapasistas besar.
Memperkecil jumlah klon pustaka

DNA/genom yang harus dibuat.
Memudahkan penanganan dan
penyimpanannya.
Memudahkan/mempercepat proses seleksi
tranformant target.
Pustaka DNA
Disebut juga bank klon (clone bank) atau gen
bank, atau pustaka klon.
Sekumpulan klon (bakteri) transformant

yang mengandung set potongan DNA
(cDNA) dari sebagian atau keseluruhan set
genom lengkap suatu organisme (bakteri,
virus, tumbuhan, hewan, manusia).
Pustaka DNA
Library at Melk Abbey in Austria, Source: Wikipedia
Pustaka Klon/Pustaka DNA

PENYUSUNAN PUSTAKA DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
Km®
D
E
F
G
H

Pustaka DNA
Simpan pada
suhu -80oC atau -20oC
Memperkecil Jumlah Klon Pustaka
Ukuran Genom 125 Mb 125 Mb

Jumlah Klon Pustaka
125 Mb
EcoRI (6) = 46 = 4 kb =
125.000.000/4096 = 30.517 klon
MSeI (4) = 44 = 4 kb =
125.000.000/256 = 488.281 klon
2. Jenis-jenis vektor plasmid berkapasitas besar.
Vektor Kapasitas maks.(kb) Catatan
Plasmid 10-15 kb
Phagemid < 6 kb
λ-Phage < 25 kb
Cosmid < 50 kb
Sering ditemukan
YAC 20-2000 kb
khimera
P1-Phage 30-100 kb
BAC 100-300 kb
PAC 100-300 kb
3. Pengertian dan Karakteristik
Cosmid , BAC, dan YAC.
Cosmid
• Kosmid merupakan vektor yang
dikembangkan dari plasmid dilengkapi
dengan sekuen Cos
• Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori
yang memungkinkan untuk bisa bereplikasi
didalam E. coli.
• Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali
oleh Collins dan Hohn (1978).
Cosmid
Karakteristik
• Sekuen cos berasal dari phage λ yang
merupakan sekuen berpita tunggal.
• Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid
untuk masuk kedalam struktur bakteriophage
sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri.
• Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan
dalam penyusunan pustaka DNA dengan ukuran
37 sampai 57 kb,
• Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb.
Transfeksi Cosmid sebagai
Vektor Transformasi
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
• Butuh kloning dengan kapasitas besar:
Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode
faktor defisiensi koagulasi (pembekuan)
darah pada jenis hemopilia A, memiliki
ukuran 190 kb
sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi
dalam regulasi perkembangan pola
segmentasi dada membentang sepanjang
320 kb.
• Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
Karakteristik penting plasmid YAC
• Dikembangkan dari plasmid pBR322

• Memiliki komponen gen yeast : SUP4, 7RP1,
HIS3 dan URA3.
• Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk
pengendali gen tRNA tyrosin)
• Host (inang) yang digunakan untuk
transformasi adalah spheroplast sel yeast
Prinsip kloning dengan YAC
Kelemahan
• Sering mengandung khimera.
• Sebab: artefak ligasi atau disebut juga
dengan kokloning, delesi serta bisa
diakibatkan oleh adanya rekombinasi
• Nagaraja et al (1994) 50% nya ;Olson et al
(1987) =10%
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
• Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
• Mengandung:
oriS, repE – F: replikasi dan pengaturan
jumlah salinan plasmid di dalam sel inang.
parA and parB: pembagian plasmid F
kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi
• Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah
150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
• Dikembangkan oleh Kim, Shizuya, dll.
Beberapa Contoh Vektor
BAC
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
insert Jumlah Equivalensi Sisi
Spesies Vektor
(kb) klon genom kloning
Sorghum BTX623 145 10,752 2.0X pBeloBAC11 BamHI
Kedelai (Forrest) 125 35,328 4.8X pCLD04541 BamHI
Beet Gula 140 57,600 10.6X pCLD04541 BamHI
Tomat (L. esculentum)
125 36,864 4.8X BIBAC2 BamHI
Mogeor
Gandum Chinese Spring 210 4,608 pBeloBAC11 HindIII
Hewan
Ayam White Leghorn (female) 134 49,920 5.5X pECBAC1 HindIII
Kuda 130 50,688 2.2X pECBAC1 BamHI
Tikus 150 99,840 5.0X pECBAC1 HindIII
Serangga
Anopeles gambiae PEST 133 30,720 14.0X pECBAC1 HindIII
Semut api 140 23,040 5.3X pECBAC1 HindIII
Nyamuk 180 50,688 8.2X pECBAC1 EcoRI
Ulat Sutera (Bombyx mori)
165 21120 6.6X pBeleoBAC11 Bam HI
P50
Mikroba
Bakteri 65 3,840 pECBAC1 BamHI
4. Kekurangan sistem BAC, YAC dan
Cosmid
• Kelebihan Cosmid, YAC, BAC: kapasitas besar

• Kekurangan terutama YAC: Chimera
• Cosmid juga tidak stabil: 35%
• BAC lebih sedikit mengandung khimera dan
efisiensi transformasi 100x dibanding YAC.
Kestabilan Pustaka
Klon
Sumber: Ioannou, et al., (1994).

Selesai
Materi IV-



Beberapa Tanaman Budidaya Transgenik.
Buah Sayuran Butiran Tanaman lain Bunga2an

Apel Kol Bunga Jagung Kapas Krisantemum
Pisang Brokolli Padi Luzerne Kalankoa
Peer Chikori Gandum Raps Pelargonia
Strawberry Timun Lada Petunia
Kiwi Kentang Kol liar Mawar
Melon Wortel Kedelai
Jeruk Kol Bg Matahari
Pepaya Selada Tembakau
Plum Oliv Tebu
Anggur Asparagus Beet gula
Ubi Jalar
Tomat
Zucchini
METODE TRANSFORMASI

2. Transformasi dengan Biolistik
3. Transformasi dengan fusi protoplasma
4. Transformasi dengan mikroinjeksi
5. Transformasi dengan elektrophorasi (Electrophoration)
6. Transformasi dengan chemical (heat shock)

Agrobacterium tumifaciens
adalah bakteri tanah penyebab
tumor pada tanaman
dikotiledon.
Pertama ditemukan tahun

1907, dilanjutkan dengan
penemuan plasmidnya yang
berukuran 200-800 kb.

Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut
dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid)
tms tmr nos
T-DNA = DNA transfer
noc = katabolisme Nopalin
T-DNA nos = sinthesis Nopalin
LB
RB tmr = sintesis Sitokinin
tms = sintesis Auxin
noc
vir = daerah virulen
vir Ti-Plasmid ori = asal replikasi
LB = batas kiri
tra
RB = batas kanan
ori

Kromosom dalam inti
sel tumbuhan
Agrobacterium
Pelukaan
Sel tumbuhan

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor

LB RB
1
T-DNA
LB RB
2
T-DNA
virD2
LB RB
3
virD2
virE2
virD2
LB RB
4
Komplek T-DNA-Protein

LB T2 Gen P2 T1 SMG P1 RB
T-DNA dimodifikasi
LB RB
vir Ti-Plasmid E. coli - plasmid

E.c. ori
tanpa T-DNA dengan T-DNA
A.t. ori Kan®

SKEMA SISTEM VEKTOR BINER

TRANSFORMASI BIOLISTIK
= PARTIKEL BOMBARDEMEN
= MIKROPROJEKTIL
KELEBIHAN:
1. TIDAK MEMERLUKAN PENGHILANGAN DINDING SEL
2. TEORITIS SETIAP SEL ATAU JARINGAN BISA DITRANSFORMASI
3. CARA TRANSFORMASI TIDAK SEKOMPLEKS A. TUMIFACIENS
4. VEKTOR YANG DIPERLUKAN UNTUK TRANSFORMASI SEDERHANA
5. DAPAT MENGAKOMODASI LEBIH DARI 10 GEN SEKALIGUS PADA
PLASMID YANG BERBEDA
6. METODENYA DAPAT DITERAPKAN PADA SETIAP ORGANISME DAN
GENOTIP

Hind III Sma I
Eco RI
T Plasmid untuk transformasi biolistik
P
Amp® = gen resistensi ampicilin
SMG = Gen penanda untuk
Amp®
SMG tumbuhan
P = promotor
T = terminator
E.c. ori

KAMAR TEKANAN
PEMEGANG MAKRO
DNA BERLAPIS
PARTIKEL EMAS
CAWAN PETRI DGN

JARINGAN
TANAMAN BIORAD
PRINSIP ALAT TRANSFORMASI BIOLISTIK

Particle Bombardment
KELEMAHAN:
1. EFISIENSI RENDAH (0,05%)
2. TIDAK SETIAP DNA YG DITRANSF. STABIL
TERINTEGRASI DIDALAM INTISEL
3. KEBANYAKAN HARUS MENGGUNAKAN
JARINGAN MERISTEM

Transf. potongan daun dgn A. tumifaciens Transformasi kalus dengan biolistik
Potongan daun dengan A. tumifaciens Embrio/Kallus diinisiasi dan dikultivasi

dikokultivasi
8-12 minggu
1-2 hari
Potongan daun dicuci Transformasi biolistik
Perlakuan antibiotik untuk mematikan

Bakteri dan menseleksi sel-sel Pertumbuhan kallus tanpa seleksi
transformant
4 hari
2-4 minggu
Transfer potongan daun ke medium Pertumbuhan kallus dengan media
regenerasi dan seleksi (pembentukan seleksi
kalus dan tunas)
8-12 minggu
6-10 minggu
Potongan daun diletakkan pada medium Regenerasi dan seleksi lanjutan
tanpa phytohormon untuk pembentukan
akar 8-12 minggu
4-6 minggu Regenerasi tanaman transgenik
Regenerasi tanaman transgenik

DNA MICROINJECTION
• direct microinjection of a chosen gene
construct
• (a single gene or a combination of genes)
from another member of the same species or
from a different species
• into the pronucleus of a fertilized ovum
• one of the first methods that proved to be
effective in mammals (Gordon and Ruddle,
1981)
• the introduced DNA may lead to the over- or
under-expression of certain genes
• The insertion of DNA is random process
• high probability that the introduced gene will
not insert itself into a site on the host DNA
• manipulated fertilized ovum is transferred
into the oviduct of a recipient female or
foster mother
• induced to act as a recipient by mating with a
vasectomized male
• Applicable to a wide variety of species.
Procedure for DNA microinjection
• fertilized eggs to be inoculated by microinjection is
increased by superovulation
• female mice are given an initial injection of
pregnant mare’s serum and another injection,
about 48 hours later, of human chorionic
gonadotropin.
• the super- ovulated females are mated and killed
• the fertilized eggs are flushed from their oviducts
• microinjection of the fertilized eggs
• the microinjected transgene construct is often in a
linear form and free of prokaryotic vector DNA
sequences
Peralatan Mikroinjeksi
Transgenic mice by DNA microinjection
3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma
LANGKAH PERTAMA:
MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI DINDING SEL
(ENZIMATIS) :
UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE
PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM MEDIUM: ISO-OSMOSIS
VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK

METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL)
ELECTROPHORATION
PROBLEM: REGENERASI TRANSFORMANT

Fusi Protoplasma
Inter-specific and inter-generic fusion achievements
Cross Crossed with

Oat Maize
Brassica sinensis B. oleracea
Torrentia fourneri T. bailloni
Brassica oleracea B. campestris
Datura innoxia Atropa belladonna
Nicotiana tabacum N. glutinosa
Datura innoxia D. candida
Arabidopsis thaliana Brassica campestris
Petunia hybrida Vicia faba
Electrophorasi
Electrophorasi
SISTEM SELEKSI DAN REPORTER

NH2
1. SELEKSI DOMINAN:
CH2
ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID: O
OH
Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO
Gentamycin dari Micromonospora purpurea HO
Neomycin dari Streptomyces fradiae O

HO NH2
Streptomycin dari Streptomyces griseus
CH2O O NH2
O
HO
NH2 OH
STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN

SELESAI

Materi VI.
Isolasi gen Target I:
Berbasis Fungsi dan Peta

Sub Pokok Bahasan
1. Prinsip dan tujuan isolasi gen

target.
2. Pengertian isolasi gen target
berbasis fungsi.
berbasis posisi/peta.
4. Pengertian dan prinsip penyusunan
peta genetik.
1. Prinsip dan Tujuan Isolasi Gen Target.
Isolasi Gen TargeT Isolasi gen target
PS T
Dr. Jamsari, Prog. STudi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPTA
Mengisolasi gen ≠ mengisolasi DNA
genom
G Gn
Gn = DNA genom
G = gen
Hubungan Gen-DNA/Protein
ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC..........GCAGGGAGGCAAACAATGA Gen/DNA
Reverse transkripsi Transkripsi
AUGUUACGUCCUGUAGAAACCCC..........GCAGGGAGGCAAACAAUGA mRNA
Sekuensing Asam amino Translasi
MLRPVEUP..........QQGGKQ. Asam
amino/polipept
ida/protein
Sekuens nukleotida gen GUS
ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCG
AAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGT
TTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCG
AAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATC
AGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAG
TGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAA
AACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACC
ACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACT
GGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAG
GCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGT
CACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGA
ACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAG
GATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCAT
TACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCG
GCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCA
ACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTG
GTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAA
GCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCAT
CAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAG
AGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCG
TGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATAT
GTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGC
AAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTC
TGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGA
Sekuens Asama amino gen GUS
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAI
AVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFD
AVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVC
VNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYT
TPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDAD
QQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIY
PLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLM
VHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAV
GFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNH
PSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVM
FCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQ
EKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVF
DRVSAVVGEQVWNFADFATSQGILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAF
LLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ.
berbasis fungsi dan Peta
ISOLASI GEN
FuncTional PosiTional cloning

cloning
DikeTahui Produk Tidak dikeTahui

Isolasi Gen TargeT
biokimia
Analisis ProTein Posisi ?

(geneTis/fisik)
Analisis AA Kloning/Isolasi
Sekuensing
DNA DNA
PE T
Isolasi gen target berbasis fungsi
1. Kloning Berbasis Fungsi
Isolasi gen yang didasarkan atas informasi produk biokimia
dari gen Target
PRASYARAT:
ADA PRODUK BIOKIMIA DARI GEN TARGET
DIUJI DENGAN METODE MUTANT KOMPLEMENTER
DITRACE/TELUSURI DARI PROTEIN; ASAM AMINO;
DAN LEVEL ASAM NUKLEOTID (DNA)

Seleksi
karakTer
IdenTifikasi
biokimiawi
Purifikasi
proTein
TargeT
IdenTifikasi
proTein TargeT
Sekuensing
proTein/DNA ACGTCTTGAACCT ACGTCTTGAACCT
Problem FuncTional Cloning
Kebanyakan Produk Gen Tidak

DikeTahui
PhenoTyp Yang Bisa DiamaTi
TnTukmengukur Produk Biokimia Gen
TerbaTas
Penggunaannya TerbaTas
2D-elekTrophoresis
Sumber: ProTeomic of M. TrauncaTula, Nagaraj, eT al., (2007)

Maldi Toff
A B
Profil respon Arabidopsis
Thaliana Terhadap kondisi
dingin menggunakan Gas
chromaTography-mass
specTromeTry (GC-MS)
3. Isolasi Gen Berbasis Peta
2. Kloning Berbasis Posisi PERSYARATAN:
1.TERSEDIA PETA GENETIK YANG AKURAT
MATERIAL DASAR UNTUK MELOKALISASI
POSISI GEN TARGET SECARA GENETIS.
2.TERSEDIANYA PETA FISIK DISEKITAR GEN
TARGET
MATERIAL FISIK POSISI GEN TARGET
SECARA AKTUAL

2. Kloning Berbasis Posisi
Prinsip Penyusunan Peta Genetik
dan Fisik
2. Kloning Berbasis Posisi PETA GENETIK:
POSISI TARGET GEN SECARA TEORITIS YANG DITENTTKAN

BERDASARKAN HASIL ANALISIS GENETIS SEGREGASI ALEL-
ALEL TETUA DAN KETURUNANNYA.
LANGKAH PENYUSUNAN PETA GENETIK:
1. MENEMUKAN PENANDA ANTARA ALLEL DOMINAN-

RESESIF
2. MELAKTKAN PERSILANGAN INDIVIDU YANG
MENGANDUNG ALEL DOMINAN DAN RESESIF
3. MELAKUKAN ANALISIS PEDIGREE POLA PEWARISAN ALEL-
ALEL

2. Kloning Berbasis Posisi Langkah Penyusunan PeTa GeneTik:
Menemukan Penanda AnTara Allel Dominan-resesif
• Melakukan Skrining Marker (Bsa=bulked SegreganT

Analysis) (SisTem Penanda: RFLP, AFLP, SSR, STS, SNP, Dll)
UNTUK MEMPEROLEH
MARKER POLYMORPHISME PADA ALEL TARGET
• Menggunakan Marker Polymorphismus untuk Melakukan
Analisis Pedigree Alel-alel Dari TeTua Kepada
KeTurunannya
• Analisis TauTan (Linkage Analysis) Marker Masing-masing
Alel
• MenenTukan Jarak GeneTis

2. Kloning Berbasis Posisi Genotiping Karakter Penotif
♂ ♀
2. Kloning Berbasis Posisi Genotiping Karakter Penotif
BSA=Bulked SegreganT Analysis
48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58
Bulked segreganT
analysis

Single planT analysis
F M M M M F F F F F M F F F M F F M F M F M M M M M F M M M M MM M M M M M M M M M M M

L5
Peta Genetik kromosm L5

terdiri dari 19 marker AFLP
dan 5 marker STS, serta
lokus sex (M)

2. Kloning Berbasis Posisi Hibridisasi fragmen lokus marker AFLP secara In Situ
Hibridisasi Southern bloT Fluorescence in situ hybridization

(FISH)

2. PENYTSTNAN PETA FISIK
PeTa fisik : peTa posisi suaTu lokus (gen) TerTenTu yang besarannya
dinyaTakan dengan saTuan pasangan basa (pb) aTau basepair
(bp)
PeTa fisik disusun dari:

1. Hibridisasi in-siTu dengan menggunakan probe-probe spesifik yang
posisinya secara geneTik sudah dikeTahui
2. Menggunakan sekuens DNA berukuran besar (HMW) yang dicerna
dengan rarecuTTer dan dirunning dengan PFGE, dihibridisasi dengan
probe yang posisi geneTiknya sudah dikeTahui
3. Penyusunan conTig dari klon-klon yang mengandung insersi dengan
ukuran besar (PAC, Kosmid, BAC, YAC, dll.).

cM
0.0 PM3159
PENYTSTNAN PETA FISIK
7.8 PM3449
15.4 PM4461
18.2 PM4151
24.7 STS3660
25.6 EM3660
25.6 EM4447.2
27.9 EM4447.1
28.0 EM3950
29.5 EM3156
29.6 STS3156
29.7 SEX (M)
29.8 STS4150.3
29.8 STS4150.2
29.9 STS4150.1
30.0 EM4150
30.0 EM3353
30.0 PM3551
33.8 EM3251
33.8 EM4654
36.8 PM4455
36.8 PM3648
40.1 PM3262
42.1 PM4050
55.3 PM 3148

Sumber: SMR-BüTTner

BioTeknologi TnTuk PerlinTan
2. PENYTSTNAN PETA FISIK
 Hibridisasi in-siTu :

HMW-DNA HMW-DNA di resTriksi
dengan enzim „RarecuTTer“
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
750 kb
SouThern 500 kb
Transfer;
350 kb
Hibridisasi
dengan 150 kb
spesific
50 kb
probe
20 kb
5 kb

PENYTSTNAN PETA FISIK DGN. KLON BERINSERSI BESAR
. planT maTerial : YY male planTs
• vecTor: pBeloBAC-kan, pBeloBAC11
• hosT: DH10B (E. coli)
• resTricTion cloning siTes : HindIII, BamHI

BAC inserT size
BAC inserT size disTribuTion

kb
194.0
no. of clones in a size
50
40 145.5
class
30 97.0
Frequency
20 48.5
23.1
10
0 9.4
200
VecTor
100
125
150
175
75
25
50
size (kb)

2. PENYUSUNAN PETA FISIK
M 1 2 3 E V P11 - P19 RA - RH C1 - C12 MT73-MT76 3 2 1 M
300 bp
PTSTAKA BAC
*
200 bp
AFLP-BASED SCREENING
100 bp
*
*
M 1 2 3 E V W P91 A B C 5 6 7 MT361-MT364 M
COLONY HYBRIDIZATION
434 bp
184 bp
165F12
124 bp
PCR-BASED SCREENING

Kombinasi Primer untuk Skrining Klon-klon BAC

Assembling Contig
A 1 2 3 4 5 6 7 8
A 77E 7
12 kb
6 kb 73F6
4 kb
B 54G 8
2 kb
1 kb
364C 6
0.5 kb
55B 1
C 347D 2
B 1 2 3 4 5 6 7 8 C 1 2 3 4 5 6 7 8
45B 2
12 kb 3E 11
D
6 kb
4 kb 407A 8
2 kb 10C 2
1 kb E 373B 5
= SP6-end
= T7-end
0.5 kb
115G 11 100 k b

Perbandingan Peta Genetik dan Fisik
~ 106 kb/cM ~ 880 kb/cM
383B 6
347D2 54G8 373B 5
77E7 3E11
151F5 385C3 45B2 364C6 381C5 407A8
73F6 115G11
55B1 46C7 10C2
STS4150.1
EM4447.2
EM4447.1
EM3950
STS3156
EM3156
EM4150
PM3159
PM3551
EM3353
EM4654
M
4.34 0.47 0.44 0.86 0.20 0.07 0.33 3.27 cM
9.94 cM
1.06 cM = 932 kb
Prediksi Gap
EM4150
M
EM4447.1
555 kb (3-4 CW???)

Chromosome Walking !!!
1. Jika berTemu dengan daerah sekuens repeTiTive,

maka proses walking Tidak bisa dilanjuTkan
2. MendapaTkan ujung klon yang bersifaT „single
copy“ cukup suliT
3. Jika daerah TargeT merupakan daerah „cold spoT
region“ maka korelasi jarak fisik dengan jarak
geneTik bisa sangaT Tinggi, sehingga beberapa
kali “walking” harus dilakukan

2. Kloning Berbasis Posisi Chromosome Walking
1.06 cM = 932 kb
EM4150
M
EM4447.1
555 kb (3-4 CW???)

Sekuens nukleotida gen GUS
ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCG
AAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGT
TTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCG
AAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATC
AGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAG
TGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAA
AACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACC
ACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACT
GGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAG
GCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGT
CACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGA
ACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCAAAG
GATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCAT
TACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCG
GCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCA
ACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTG
GTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAA
GCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCAT
CAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAG
AGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCG
TGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATAT
GTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGC
AAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTC
TGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGA
SELESAI

Bahan Ajar Rekayasa Genetika

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Bahan Ajar Rekayasa Genetika

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Kuliah I: Pendahuluan

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

• Nomor Kode/Beban SKS : PAE 412/ 3 (2-1)-

• Setelah lulus mengikuti perkuliahan rekayasa

Nilai dalam Point Rentang skor

Prof. Dr. Sc.agr. Ir. Jamsari, MP. ..................................................

No Tujuan Pokok Bahasan Sub Pokok Bahasan Est. Waktu Kepustak

• Scientific alteration of the structure of genetic

• Resistensi terhadap Herbisida

Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman transgenik

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

•Meracun terhadap semua jenis •Aktif pada dosis tertentu

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor)

Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga

Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin

European corn borer

Western corn rootworm

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

• Kerusakan morfologis, fisiologis

Kasus Phytoptora infestans

Tanaman kentang di USA (1845),

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

• Kadar Garam yang tinggi

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Mendeteksi ranjau darat

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

proteins such as growth hormones, insulin, blood

Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY

RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar

TA29 Barnase TA29 Barnase

Degradasi RNA di tapetum

Pollen tidak terbentuk

Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Male sterility - Stopping pollen production

Chloroplast transformation - Keeping pollen

Keeping transgenic seeds from sprouting

Vektor Kloning Untuk

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

1. Pengertian vektor kloning untu transformasi

VEKTOR: Media untuk dan memperbanyak dan

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens

Pertama ditemukan tahun

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Infeksi pada sel tumbuhan dan

Infeksi pada sel tumbuhan dan

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA