UNIVERSIDAD DE COLIMA

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN MEDIA

SUPERIOR

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

Elaborado por: Q.F.B. Mónica Alcaraz Munguía

Aprobado por la Academia Estatal de Microbiología:

M.V.Z. Eduardo Aguilar Torres
M.V.Z. Gustavo Valpuesta Vega
QFB. María Mercedes Suárez Bravo
QFB. Patricia Edwigis Valladares Celis

Supervisado por: Licda. Laura Araceli Jiménez Cobián

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AGOSTO DEL 2009

JUSTIFICACIÓN

El presente trabajo se elaboró con la finalidad de

proporcionar un material ordenado y de fácil acceso al trabajo
académico el cual se complementa con la actividad científica en el
laboratorio.

Actualmente no se encuentra un manual de prácticas de

microbiología en el nivel medio superior dentro de la página de la
Universidad de Colima ni en bachilleratos que tengan el área
Químico Biólogo o un área en común en donde se contemple la
asignatura de microbiología general en el nivel medio superior.

La intención de este manual es satisfacer las necesidades del

docente en los aspectos teóricos llevados en el aula con la
actividad científica desarrollada en el laboratorio de tal forma que
se nos facilite el trabajo ordenado y uniforme en todos los
bachilleratos.

El manual consta de quince prácticas y fue elaborado tomando

en cuenta las referencias bibliográficas que marca el programa de
educación media superior de la Universidad de colima para la
asignatura de Microbiología.

La elaboración del manual se realizó en varias etapas

mediante la recopilación de prácticas. Cada práctica inicia con el
título en la parte central el cual se seleccionó de acuerdo a la
dosificación del programa por semana. El objetivo hace referencia
al aspecto significativo que se pretende que los alumnos logren al
final del experimento. La introducción es la parte teórica de cada
una de las prácticas, fue tomada de diversas referencias
bibliográficas. En la parte experimental el procedimiento se tomó
de diversos manuales de otras Universidades y de la misma
Universidad de Colima.

El cuestionario en el que el alumno demuestra su aprovechamiento

logrado al final de la secuencia de aprendizaje se elaboró basado

2
 3

en el aspecto introductorio y resultados experimentales que se

esperan de cada práctica. Así mismo se complementa con
observaciones que el alumno realizará mediante dibujos o
esquemas y finalizará con conclusiones personales del mismo.

INDICE DE PRÁCTICAS

Página

Práctica No 1 Empacado del material y esterilización

por calor
seco.............................................................................. 7
Práctica no 2 Esterilización por calor húmedo
Práctica No 3 Preparación de medios de cultivo
Sólidos........................................................................................
21
Práctica No 4 Preparación de medios de cultivo
Líquidos......................................................................................
. 21
Práctica No 5 Sembrado en placa de microorganismos
del medio
ambiente..................................................................... 28
Práctica No 6 Aislamiento de Hongos mediante el
método extensión en
placa.......................................................... 32
Práctica No 7 Aislamiento de bacterias mediante el
método sembrado en placa por
estrías........................................ 35
Práctica No 8 Manejo y uso del microscopio
óptico Compuesto……………………………………………………

3
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Práctica No 9 Tinción de la cápsula

bacteriana.................................................. 40
Práctica No 10 Tinciones
selectivas..................................................................... 42
Práctica No 11 Tinción de
Gram........................................................................ 46
Práctica No 12 Tinción ácido-Alcohol
resistente................................................. 49
Práctica No 13 Efecto de la presión osmótica sobre la viabilidad
y el crecimiento de los
microorganismos.................................. 51
Práctica No 14 Determinación del tiempo y punto térmico
mortal en
microorganismos....................................................... 54
Práctica No 15 Inhibidores
bacterianos.............................................................. 58

RECOMENDACIONES GENERALES

1.-La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de

este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio
2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y
abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de
éste.
3.- Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las
mochilas deberán ser colocadas en los cajones de las mesas
de trabajo.
4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún
objeto a la boca.

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5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.

6.- Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de
usarla.
7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá
efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.
8.-Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9.- Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo
que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor.
10.- Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización
de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica
se suspenderá para todo el equipo.
11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá
esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso.
12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos,
cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al
profesor.
14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe
colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes
datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del
nombre del alumno.
16.- Después de la incubación es necesario la esterilización del
material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos
daño a nuestra salud.

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17.- Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del
laboratorio.
18.- Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRÁCTICAS DE ESTE CURSO

1.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 10%

PREPARACIÓN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de
agua destilada

2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%

PREPARACIÓN

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Azul de metileno
5.0 gr
Agua destilada
100 ml

3.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE GRAM

COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FÓRMULA:
Cristal violeta
2.0 gr
Etanol al 95% 20
ml
Oxalato de amonio
0.8 gr
Agua destilada
80 ml
PREPARACIÓN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones

SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio
10.0 gr
Agua destilada
20.0 ml
Yodo metálico 5.0
gr
Etanol, aforar a
100.0ml
PREPARACIÓN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metálico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol

SOLUCIÓN DE ALCOHOL ACETONA

FORMULA
Acetona 1
volumen
Etanol al 95% 2
volúmenes

COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina
0.5 gr

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Agua destilada
100.0 ml
PREPARACIÓN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, después
aforara a 100 ml con más
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
FORMULA:
Fucsina básica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIÓN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en baño a
ebullición
2.- Añadir la fucsina básica y disolver
3.- Añadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solución a 500 ml con agua destilada

B) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO

FORMULA
Ácido clorhídrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIÓN
Adicionar el ácido clorhídrico al etanol, lentamente y agitando

C) COLORANTE AZUL DE METILENO

FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml

5.- MEZCLA CRÓMICA

Dicromato de potasio
20.0 gr
Ácido sulfúrico concentrado
20.0 ml.
Agua destilada
250.0 ml.

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EMPACADO DEL MATERIAL Y ESTERILIZACIÓN POR CALOR

SECO

Práctica No 1
Nombre Del Alumno:__________________________________Semestre______
Grupo______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________
Calif:__________

OBJETIVO:

El alumno aprenderá el procedimiento para empacar diversos

materiales de uso en microbiología así como el procedimiento de la
esterilización por calor seco de estos.

SUSTANCIAS QUIMICAS
MATERIAL

Detergente Extran
Matraces
Agua destilada Tubos
de ensaye
Horno a 170·C Pipetas
Termómetro Cajas de
petri
Papel
estraza
Algodón
Escobillo
nes

INTRODUCCION.

EMPACADO DEL MATERIAL

Antes de iniciar un empaque del material que se desea esterilizar, es
necesario que todas las prácticas que se realicen estén en condiciones de
esterilidad y se debe, en primer lugar, limpiar el área de trabajo con alguna
sustancia desinfectante y encender el mechero. Se emplearán distintos
agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio,
cloroxilenol, formaldehído, etc.) para desinfectar superficies.
El material a esterilizar se deberá de empacar correctamente con papel
estraza Una de las razones de la importancia del papel en nuestra vida
cotidiana es la enorme cantidad de usos que se le pueden dar a este producto.

9
 10

De la misma manera, el papel puede adaptarse a las diferentes utilidades que

se vayan a realizar llegando a contabilizarse hasta 457 variedades diferentes
de papel. Las variedades dependen de una serie de características físicas que
hacen que el papel se pueda adaptar a diferentes usos como: Impedir el
ingreso de microorganismos al interior, Sellar en forma completa para evitar
contaminación, Soportar la tracción y manipulación habitual sin sufrir deterioro
y hacer permeable al método de esterilización seleccionado. Todo esto se logra
Empacando en primer lugar en campo de algodón, y posteriormente en
empaque mixto o en polipropileno de acuerdo con el tamaño del material.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

La muerte microbiana se produce por una esterilización, ya sea como
consecuencia de mecanismos de transferencia de energía, además de la
oxidación. En la esterilización por Calor seco existe una destrucción de los
microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando las
proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las
membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como
ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri,
pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los
materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil
(algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos
Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos
eléctricos por los que circula aire caliente, en vista ¡de que el calor es menos
eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C
a 170·C durante una hora o más. Para materiales de vidrio de laboratorio es
suficiente una exposición de dos horas de duración a 160·C ( 320 ·F) para que
quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen incineración para
objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeños
instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO

I) EMPACADO DEL MATERIAL

l.- Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente
Extran o Alkox (Fácilmente se contamina con esporas difíciles de eliminar)
enjuaga con abundante agua de la llave y en seguida con agua destilada.
2.- Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado

3.-Empaca el material correctamente

A) CAJAS DE PETRI

Corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad

de 2 a 3 cajas. Colócalas en la parte central y Envuélvelas según te indique
tu profesor.:Se toman los extremos de Papel y se unen , Se hace un

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 11

nuevo doblez recargando ligeramente en la caja para marcarlo, Los

extremos se doblan en forma triangular .Ya en forma triangular se doblan
hacia atrás quedando listas para esterilizar.

B) PIPETAS
Introduce una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta,
procurando que quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm
de ancho envuélvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira
hacia arriba hasta el final de la pipeta.

C) TUBOS DE ENSAYE.
Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapón de algodón.
Coloca algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo
procurando que quede bien apretado, deposítalos en recipientes adecuados,
tápalos con papel estraza y átalos.

D) MATRACES.
Tapa el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para
evitar que se destape ( se tapa en la misma forma que el tubo). Como
protección coloca un gorrito de papel estraza y átalo con cinta.

E) MATERIAL METÁLICO
El asa de platino, tijeras, bisturí, material quirúrgico no es necesario
empacarlo para su esterilización.

II) ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

1.-Las normas de Procedimiento de la Institución establecerán las condiciones
de trabajo según la carga, volumen, peso, resistencia térmica del material. Es
imprescindible respetar los parámetros obtenidos en la validación del
procedimiento. La temperatura de esterilización por Calor Seco deberá estar
entre 160·C a 170 °C. y el tiempo de aplicación será de una hora o más.

2.- El material a esterilizar se deberá cargar con el esterilizador frío, teniendo

en cuenta las siguientes recomendaciones: Cada unidad deberá quedar
separada de las vecinas
Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del
esterilizador
La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la
capacidad total de la cámara

3.-Colocar el material dentro del Esterilizador. Encender el Esterilizador,

Verificar que los instrumentos de control de ciclo, tiempo ( l hora) y
temperatura( 170·C) se encuentren en la posición correcta. Esperar hasta que
los instrumentos de medición alcancen la temperatura seleccionada para el
ciclo

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 12

4.- Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzará a descontar

el tiempo de esterilización. Cumplido el tiempo de exposición se apagará el
Esterilizador
La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya
enfriado.

5.-Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del Esterilizador

porque ello implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo,
además de que el cambio de temperatura rompería la cristalería

6.- una vez alcanzada la temperatura de 160ºC en el horno con aire caliente
coloca todo el material
que se empacó y toma el tiempo de 2 horas para su esterilización

CUESTIONARIO:

1.- Porqué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el

material?
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- ¿Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con
papel estraza? ¿Porque?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3.- Qué finalidad tiene el empacado antes de la esterilización?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________
4.- Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de estraza? ¿Por qué?
____________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

5.- Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos
de las pipetas y de los Matraces Erlen
Meyer__________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- Qué desventaja tiene el utilizar la esterilización por calor seco en este
laboratorio?
________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

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7.- Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
8.- A qué temperatura y cuánto tiempo tendrás que emplear para esterilizar
por calor seco el material de laboratorio para asegurar la destrucción de
microorganismos patógenos y esporas?
________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Realiza los dibujos correspondientes del procedimiento de empacado que

realizaste para cada tipo de material de laboratorio. Así mismo dibuja el horno
en donde realizaste la esterilización por calor seco.

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

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 14

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Práctica No 2
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_______________________________
Calif:_____________

OBJETIVO:

El alumno conocerá y aplicará el procedimiento de esterilización por calor

húmedo, así como las ventajas del procedimiento.

MATERIAL
SUSTANCIAS

Reloj Agua de
la llave
Autoclave u olla de presión Extran
3 Soporte universal Alkox
2 mechero fischer
Material de cristalería limpio, seco y empacado

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 15

Asa de platino

INTRODUCCIÓN

AGENTES FÍSICOS ANTIMICROBIANOS.

A) CALOR HÚMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad
elevada, es uno de los métodos más efectivos para matar microorganismos. El
calor húmedo mata a los microorganismos coagulando sus proteínas. Es mucho
más rápido y efectivo que el calor seco. El vapor a presión proporciona
temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la
ventaja de un calentamiento rápido, así como penetración rápida y abundante
humedad..
El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se
denomina autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de
vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la
presión establecida durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente
el autoclave funciona a una presión de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121·C
( 249·F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la
naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del
volumen del material. Una temperatura de l00·C es la suficiente para matar a
todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para
matar a estas se requiere una temperatura de 121·C durante 15 minutos y a
una presión de 15 libras.
Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule,
jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azúcar
especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presión.
B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los
microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando las
proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las
membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como
ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri,
pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los
materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil
(algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos
Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos
eléctricos por los que circula aire caliente, en vista ¡de que el calor es menos
eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C
a 170·C durante una hora o más. Para materiales de vidrio de laboratorio es
suficiente una exposición de dos horas de duración a 160·C ( 320 ·F) para que
quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen incineración para
objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeños
instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO

C) ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO (vapor a presión)

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 16

1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas

como Extran, mezcla Crómica con concentraciones adecuadas tomando en
cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel
absorbente y empácalo. Tenlo listo para su esterilización.

2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca e

introduce unas gradillas metálicas que servirán de base al material a
esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de
presión, evitando que el material toque las paredes.

3.- Cierra la autoclave u olla de presión, cuidando de dejar abierta la válvula de

salida de vapor que ayudará a expulsar el aire contenido dentro y que éste es
desplazado por el vapor que se produce. .- si el aire no fue eliminado
totalmente de la autoclave, el manómetro aumentará a 15 libras. Pero la
temperatura no habrá alcanzado los 12l·C. Por esto se debe medir el tiempo
cuando la temperatura llegue a l12·C

4.- Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05·C

indica que está libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120·C,
mantenla durante 15 minutos para que se efectúe la esterilización (15 libras de
presión). Transcurrido este tiempo se corta la fuente de calor.

5.-Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida
de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material

6.- Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a la

salida de vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión las
hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que
se enfríe perfectamente

CUESTIONARIO.

1.- Cuál material se puede esterilizar por calor seco y cuál no. ¿Porqué?
_______________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas
vegetativas?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

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 17

5.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para

esterilizar por calor seco?
___________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para
esterilizar por calor húmedo?
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

7.-Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
8.- Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
9.- Qué tipo de esterilización es más recomendable y por qué?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilización por calor

húmedo que realizaste en la práctica

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CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

Práctica No 3
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:

Adiestrar al alumno en la preparación de diferentes medios de

cultivo

MATERIAL
SUSTANCIAS

4 Matraz Erlen Meyer de 250 ml Agar nutritivo

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1 Baño maría Miuller Hinton

3 Tripies Agar base
sangre
2 Mecheros Fisher Agar
Macconkey
3 Telas de asbesto Agar- Manitol-
Sal- Agar
Agitador
4 Vaso de precipitado de 250 ml
1 Espátula
1 Vidrio de reloj
Cajas de petri
Tapones de algodón
Autoclave u olla de presión
Papel estraza
Tubos de ensayo 16X150

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y
debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las
bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a
los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios
de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se
encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de
carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo
del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos
que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para
promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su
aspecto físico.

Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su

aspecto en: : Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: I.- Medios de
cultivos básicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos,
diferenciales, de transporte.

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PROCEDIMIENTO:

1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se

enciende el mechero

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la
cantidad necesaria según el volumen requerido.

2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada

en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En
el último paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso
y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias
quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente
estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad.

3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un

matraz y esterilizarlo a 121·C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente
mantener el mechero encendido para formar un área de esterilidad al
momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml. A 20
ml De Agar por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja
inmediatamente

4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar

directamente en ellos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y
papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie
lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 · sobre una varilla de vidrio.

5.- . Para preparar el Agar base Sangre es necesario Adicionar en

condiciones de asepsia sangre desfibrinada estéril en concentración
final de 15%. Después de la esterilización del Agar base Mezclar
cuidadosamente y poner en cajas petri estériles.

A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI

3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser
utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a
realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el
medio de cultivo.

4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área

estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la
caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la

20
 21

base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz
que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15
ml. A 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se
procede a tapar la caja inmediatamente

5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre

la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja.

6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo,

anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no
se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el
refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga
sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar

7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario
secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de
microorganismos.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un medio de cultivo?

________________________________________________________________________________

2.- Qué es un cultivo de microorganismo?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

3.- Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el

laboratorio de microbiología.

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

5.- De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de

medios de cultivos?
________________________________________________________________________6.- Por
qué es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de
cultivo en las cajas de petri?

21
 22

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

7.-Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de

carne y Peptona?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________8.-
Escribe la composición química para cada medio de cultivo que utilizaste.

Agar nutritivo
Miuller Hinton

Agar base sangre Agar

Macconkey

Agar- Manitol- Sal- Agar

OBSERVACIONES.

Dibuja todos los pasos realizados en la preparación de los medios de cultivo.

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

22
 23

Práctica No 4
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aprenderá la técnica del vaciado en placa del medio de cultivo

preparado en la sesión anterior en cajas de petri ya esterilizadas además
preparará medios de cultivo líquido estéril.

MATERIAL SUSTANCIAS

3 Telas de asbesto
3 Tripies o soportes Universales
2 Mecheros Fisher
2 Agitadores Medio de cultivo para caldo
nutritivo
2 Vasos de precipitado de 250 ml Medio de cultivo para caldo
triptona
2 Espátulas Fenol al 5%
2 Vidrio de reloj
Tubos de ensaye 20 X 200 mm
Tapones de algodón
Autoclave u olla de presión
Papel estraza
Equipo para Baño María

INTRODUCCIÓN

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es

necesario utilizar un medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias
orgánicas e inorgánicas necesarias indispensables para el normal desarrollo de
su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder
multiplicarse, pueden manifestar características de crecimiento y propiedades
bioquímicas; aspectos de gran importancia para su clasificación. Estos
preparados estériles que poseen los elementos necesarios para el desarrollo de
un microorganismo, se denominan medios de cultivos y pueden dividirse por
su:

23
 24

A) ASPECTO:

Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente para:- Cultivar los

microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la
producción de metabolitos específicos La multiplicación bacteriana en los
medios de cultivos líquidos se manifiesta generalmente por el enturbiamiento
de éste;.- Estimular y promover la selección de algún o algunos
microorganismos e impedir que otros se multipliquen.- Identificar al
microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
Medios semisólidos.- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si
el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia
blanda. Medios sólidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de
microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios
de cultivo que se emplean en Microbiología. , En los medios de cultivos sólidos
la multiplicación bacteriana se manifiesta por una formación macroscópica
denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicación de una
sola célula bacteriana.

B) USO

I.- Medios de cultivos básicos. Se caracterizan por ser pobres en material

nutritivo, de manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la
preparación de otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo peptonado
y el Agar-Agar corriente.
II:_ Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran:
a) Medios mejorados. En general son los mismos medios básicos a los que
se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de
estos medios es universal y está orientado especialmente a obtener buen
desarrollo de cualquier tipo de bacteria, se utilizan en primera instancia en el
aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o de productos
patológicos.Los medios de este tipo de uso más frecuente son: Agar tripticasa-
sangre, caldo tripticasa, Agar chocolate, medio de Mueller-Hinton.

b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o

limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo
de otras. consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene
numerosas otras especies.Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para
el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el
aislamiento de bacterias Gram(+).

c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna

propiedad bioquímica de la bacteria como degradación de hidratos de
carbono, proteínas, hidrólisis de la urea, etc., contienen indicadores de ácido
base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las
características típicas de las colonias el estudio en estos medios debe
realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de
este tipo, de uso preferencial en la bioidentificación de bacilos Gram(-) ya que

24
 25

ellos no tienen características muy distintivas en las colonias o cultivos en

general. Entre los de uso más corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azúcar
(TSI agar Medio de SIM, Caldo glucosado fosfatado, Voges-Proskauer o del rojo
de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons- Medio caldo urea,

d) Medios de transporte. Sirven para transportar los especimenes que

contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el
laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se
altere la proporción original de la flora microbiana en los especimenes.

PROCEDIMIENTO:

B) PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

* Preparar caldo nutritivo y caldo triptona

1.- Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria según el
volumen de medio de cultivo requerido.

2.- Disolver el medio en agua destilada agitando el recipiente

3.- Envasar el volumen necesario en matraces, tubos u otros recipientes.

Procurar que el volumen del medio no rebase la mitad de la capacidad del
recipiente, pues de otra manera el medio se puede regar

4.- Tapar el recipiente con algodón, gasa y papel estraza.

5.- Esterilizar en autoclave a 121·C durante 15 minutos, a menos que se

indique otra cosa.

6.- antes de usar el medio de cultivo, se debe someter a una prueba de

esterilidad, para lo cual se debe meter a una estufa a 37·C durante 24 horas. El
medio debe permanecer libre de crecimiento.

CUESTIONARIO

1.- Qué es un medio de cultivo?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- Qué tipo de nutrientes requieren los microorganismos para poder crecer en
un medio de cultivo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.- ¿ Cómo nos podemos dar cuenta que existió crecimiento de
microorganismos en un medio líquido? 4.-¿Cómo se manifiesta el crecimiento

25
 26

de los microorganismos en un medio de cultivo sólido?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.-¿Cuál es el elemento principal del medio de cultivo que favorece su
solidificación?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- De acuerdo a su uso ¿ Qué tipo de medios de cultivos podemos encontrar
en el mercado?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.- Escribe dos ejemplos de medios selectivos encontrados en el laboratorio
en donde puedan desarrollarse los microorganismos
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
8,. Qué finalidad tiene guardar invertidos los medios de cultivo ya preparados
en las cajas de petri en el refrigerador o en la estufa de incubación?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
9.- Escribe dos medios de cultivos que nos permiten determinar alguna prueba
bioquímica_____________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_

OBSERVACIONES:

Dibuja todos los pasos del proceso de vaciado del Agar en cajas de petri
esterilizadas

26
 27

CONCLUSIONES:_____________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
__

SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO

AMBIENTE

Práctica No 5
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVOS

- Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio

ambiente, determinando las diferentes morfologías de colonias que se
obtienen.
- Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de
bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

MATERIAL

• 3 cajas de Petri estériles preparadas con Agar nutritivo

• Caja de hisopos estériles sin abrir toallas de papel
• 3 cajas de petri estériles preparadas con Agar sangre.
• Cinta pegante
• Marcador permanente o lápiz de cera
• Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución
blanqueadora , jabón líquido Extran o alkox.

INTRODUCCIÓN

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja.

Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de
nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los
microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, así como a
casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en
contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran
más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo

27
 28

entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Las superficies

del baño, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las
tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes
tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere

técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo
mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo
puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula
parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales
nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y
la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales
es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula
sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica (siembra por
estría en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37:C , las
células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un
lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células denominadas
colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es
presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos
células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de
otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo
puro. La mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son
inofensivas, pero algunos son patógenos o causan enfermedad. Por esta razón,
queremos controlar el número de microbios que nos rodea. La posibilidad de
infectarnos aumenta con el número de microbios en los objetos circundantes.
Pero ¿qué podemos hacer para reducir el número de microbios en las
superficies que nos rodean?

PROCEDIMIENTO

En esta actividad escogerás un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda

causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la
manija, el marco, el control remoto de la televisión, una moneda). Este fomite
ayudará a confirmar la presencia de microbios y los efectos de un
desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio
de cultivo en cajas de Petri.

1. Si tienes el cabello largo, recógetelo para mantenerlo lejos de las cajas de

Petri cuando estés trabajando. Lava tus manos. Limpia tú área de trabajo
frotando suavemente, con la solución desinfectante en una toalla de papel.
Saca tus cajas de Petri pero no abras las cajas hasta que se te indique.

2. Escoge un objeto del salón de laboratorio (la

manija, el marco, el control remoto de la televisión,
una moneda, etc.). Toma una caja de Petri sin
abrir y con tú lápiz de cera o marcador, divide la
base de la caja en cuatro secciones iguales.

28
 29

Escribe el nombre del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4.
Abre la caja de hisopos de algodón y escoge uno con cuidado para no tocar la
punta. Limpia tú objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo
volteándolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie
del objeto.

3. Ahora abre la tapa de la caja y suavemente

haz cuatro siembras sobre la superficie de la caja
como se muestra en la ilustración, empezando en
la sección designada "1" y continuando en el orden
de las secciones, de manera que la última siembra
esté en la sección 4. Presiona firme pero suavemente y no retiñas las siembras
anteriores. Tus siembras sólo deben dejar una impresión muy ligera en el Agar.
Cierra la caja y séllala con dos pedazos de cinta. No cubras la caja con cinta o
no podrás verla bien.

4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y

desígnala “Control.” Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente
con una toalla de papel humedecida con agua-solo frótala un par de veces; no
la restriegues. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área limpiada.
Abre la tapa de la segunda caja y haz SUAVEMENTE 4 siembras en la superficie
de la caja, siguiendo el orden de las secciones numeradas como lo hiciste
previamente. Cierra la caja y séllala.

5. Divide la tercera caja de Petri en 4 secciones numeradas y desígnalas con el

nombre del desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador"). Usa el
desinfectante escogido para limpiar la otra mitad del objeto que trabajaste
antes. Con un nuevo hisopo estéril, toma muestra del área. Repite el proceso
de sembrar la caja. Ciérrala y séllala.

6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descártalos. Pon las cajas
en un lugar apartado y déjalas incubar a la temperatura de 37·C durante 24 a
48 horas. Limpia tu área de trabajo con la solución desinfectante y lava tus
manos.

7.- Repite todo el experimento utilizando Cajas de cultivo con Agar sangre sólo
que ahora selecciona otro Fomite que no hayas empleado

7. Después de que hayan pasado dos días, mira las cajas de Petri iniciales. No
la abras. A la vez examina las otras cajas de Petri sin abrirlas. Crea una tabla
que compare las cajas sembradas antes y después de limpiar el objeto (mira la
tabla de ejemplo). Asegúrate de indicar si los microbios crecieron en cada
siembra.

8. Nota: un adulto supervisor debe hacer este paso preferiblemente.

Cuidadosamente abre las cajas de Petri en un lavaplatos e inúndalas con
blanqueador o alcohol sin diluir. Déjalas por una hora y enjuágalas
completamente; colócalas en una bolsa plástica, amárrala y descártala.

29
 30

Asegúrate de no tocar la superficie de las cajas cuando las abras y lava tus
manos cuidadosamente después de manipularlas. Limpia tú área de trabajo
con la solución desinfectante.

CUESTIONARIO

1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- Qué es in inóculo?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.- Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice
que no forma un cultivopuro?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos?
________________________________________________________________________________
5.- ¿En cuál caja crecieron más y más grandes las colonias? ¿Por qué piensas
eso?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.-¿Cómo es el patrón que observas en el tamaño y cantidad de colonias en
cada caja?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

8.- Completa en la siguiente tabla anotando X en los espacios

correspondientes a las divisiones realizadas en donde hayan crecido los
microorganismos

A) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO

Caja 1 Caja 2 Caja 3

Siembra 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Crecimien
to

B)MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE

30
 31

Caja 1 Caja 2 Caja 3

Siembra 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Crecimien
to

OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de

las cajas de petri con Agar nutritivo. Y los resultados de las colonias
bacterianas que crecieron.

CONCLUSIONES___________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
__

AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL METODO

EXTENSIÓN EN PLACA

Práctica No 6
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aislará actinomiceto del suelo mediante el método extensión en

placa utilizando una varilla angular de vidrio

MATERIAL MATERIAL BIOLÓGICO

1 varilla de vidrio doblada Muestra de suelo

2 pipetas de 1 ml 2 caja con medio de cultivo estéril Czapeck

31
 32

5 tubos de ensayo 2 caja con medio estéril de Gelosa glicerol extracto de

levadura (GGL)
Asa bacteriológico 2 caja con medio estéril Gelosa peptona Dextrosa extracto
de levadura (GPDL) Alcohol al 70%

INTRODUCCION

Uno de los problemas más frecuentes en Microbiología es el aislamiento

de un cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de que es muy
difícil aislar una sola célula, existen técnicas capaces de aproximar este ideal
En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de
modo que se impida cualquier tipo de contaminación en el área de trabajo. Los
procedimientos utilizados par conseguirlo se conocen con el nombre de técnica
aséptica, y se citan a continuación:
-Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el
material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de
microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.
-Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar.
-Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez
destapadas, y después de la inoculación.
-Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por
la parte que no entra en contacto con tubos y matraces.
-Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo
de contaminación sea mínimo.
-Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de
trabajo.
Técnicas de siembra
La siembra de microorganismos puede realizarse en medios líquidos o en
medios sólidos.
En el primer caso, para la inoculación se utilizará asa estéril si el medio de
partida es sólido, o pipeta estéril (Pasteur o graduada) si es líquido.
En el segundo caso, cuando se parte de otro medio sólido, se utiliza el asa de
platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para
siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir
el microorganismo en el seno del medio de cultivo sólido; cuando el medio de
partida es líquido, se puede pasar al medio sólido con un asa de platino
calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta
(Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extenderá sobre la
placa con un asa de Digralsky. O con una varilla doblada.

En general, en Microbiología se trabaja con cultivos puros de microorganismos.

Un cultivo puro es aquél en que todas las células provienen de una sola célula
inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que
todas sus células proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar
un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del
mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio sólido en
placa.

32
 33

Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden

resumir en los siguientes:
-Siembra en placa de la muestra de partida.
-Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua
estéril y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan
deben ser idénticas.
-A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en
medio líquido, consiguiéndose ya un cultivo puro.
-Para la conservación de los cultivos puros de un microorganismo existen
diversos métodos, el más simple es la resiembra en tubos inclinados que se
mantienen, normalmente refrigerados, durante 3-6 meses.

PROCEDIMIENTO

1.- Hacer diluciones decimales a partir de la muestra de suelo hasta 10-5

2.- Sólo vas a necesitar las últimas dos diluciones es decir: 10 -4 , 10 –5 las demás
se desecharán.
3.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo Czapeck en
una anota la dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10-5
4.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GGL) en
una anota la dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10-5
5.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GPDL) en
una anota la dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10-5
6.- Esteriliza el asa bacteriológica en el mechero, espera que se enfríe cerca
del área estéril e
introdúcela en la dilución 10-4
7.- Coloca una gota de esta dilución 10-4 en el centro de la superficie del Agar
en el primer medio de cultivo Czapeck., tapa la caja de petri
8.- Vuelve a introducir en la misma dilución 10-4 y coloca una gota en el
siguiente medio (GGL), repite lo mismo y coloca una gota en el tercer medio de
cultivo (GPDL) . No olvides tapar las cajas para evitar que se contamine.
9.-Esteriliza el asa bacteriológica y ahora introdúcela en la dilución 10-5 repite
los pasos anteriores, pero ahora para todas las cajas que están rotuladas con
la dilución 10-5 No olvides tapar los medios de cultivo.
10.- Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo más corto de la
varilla de vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la
varilla . Permite que arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la
varilla de vidrio se enfríe por un minuto
11.- Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota
de cada dilución sobre toda la superficie de cada placa de Agar inicia con las
diluciones 10-5
12.- Invierte la caja de petri, incúbala a temperatura de 37ºC por 24 horas.

CUESTIONARIO

1.- A qué grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos?

_______________________________________________________________________________

33
 34

2.- ¿Para qué son utilizados en el área médica los actinomicetos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.-Qué tipo de técnica utilizaste para sembrar a estos microorganismos?
________________________________________________________________________________
4.- Menciona otra técnica para aislar cultivos puros de microorganismos?
________________________________________________________________________________

5.- ¿Cuál fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- ¿Por qué iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las
diluciones l0-5 que contenían a los microorganismos y no con las diluciones de
l04?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.-¿Qué apariencia presentaron las colonias después del tiempo de incubación?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

8.- Esquematiza el proceso de dilución para la muestra de tierra que

realizaste

OBSERVACIONES

Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de
microorganismo por extensión en placa, así como los resultados obtenidos al
cabo de 24 horas.

34
 35

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

AISLAMIENTO DE BACTERIAS MEDIANTE EL METODO

SIEMBRA EN PLACA POR ESTRÍAS

Práctica No 7
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

35
 36

OBJETIVO:

Demostración de los medios de defensa del huésped en la piel y garganta

mediante el método de siembra en placa por estría.

MATERIAL MATERIAL
BIOLÓGICO

Cajas de petri con Agar- Sangre (GS) Exudado

faringeo
Cajas de petri con Manitol sal Agar (MSA) Solución
salina estéril
Cajas de petri con Agar vogel y Jonson (AVJ) Raspado de
piel
Cajas de petri con Agar Estafilococo S110
Mechero Fisher
Asa de platino
Hisopos estériles

INTRODUCCIÓN

La piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la

penetración de los gérmenes, por ello actúa como mecanismo de defensa. Los
mamíferos son frecuentemente infectados por algunas de las bacterias
preexistentes en su medio ambiente, aunque en general viven en equilibrio
con estos microorganismos, manteniéndoles limitados a zonas relativamente
superficiales de su organismo. Sin embargo las bacterias infecciosas producen
enfermedades al invadir tejidos más profundos. Por lo tanto para mantener la
salud, el huésped debe defenderse constantemente frente a la invasión por
parte de las bacterias.
Los factores mecánicos, químicos y microbianos desempeñan un papel
importante al restringir la colonización de las bacterias a las superficies
corporales.
Factores mecánicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas
constituyen barreras que resultan más o menos impermeables a las bacterias.
La impermeabilidad de la piel es mayor que en la mayoría de las mucosas.
Cuando se altera la integridad de la superficie epitelial, pueden desarrollarse
infecciones subcutáneas. Las bacterias que causan más frecuentemente estas
infecciones son las que existen habitualmente en la superficie cutánea,
folículos pilosos y glándulas sudoríparas en la piel, es decir los estafilococos.
Factores químicos: La acidez de las secreciones gástricas mantienen sin
duda la esterilidad habitual del estómago. El Ph bajo de la piel (3-5), debido en
gran parte a los productos ácidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda
el crecimiento de muchos microorganismos que toman contacto con sus
superficie

36
 37

Factores microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de

muchas bacterias y hongos potencial mente patógenos en lugares superficiales
donde de no ser así, podrían producirse enfermedades.
La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el
aislamiento e identificación de microorganismos, por lo tanto se refiere a los
componentes de la flora normal como a microorganismos con acción patógena.
Es importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad
patógena definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades, en tanto
que otros, llamados oportunistas, guardan una posición ambigua y pueden
encontrarse tanto como componentes de la flora normal, como asociados a
procesos patológicos, causados por otros microorganismos que son verdaderos
responsables (por ejemplo los virus) Los estafilococos están entre las primeras
bacterias que se reconocieron como patógenas, y se descubrieron por primera
vez a principios de la década de1880.
Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo
forman parte de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior;
muchas de las especies que se encuentran en el hombre son comensales. La
especie predominante patógena para el hombre es el staphylococcus aureus,
constituye la causa más común de las infecciones supurativas para el hombre.
El aislamiento de S. aureus a partir del exudado faríngeo y exudado de piel, no
tiene importancia diagnóstica, ya que se considera parte de la flora normal de
la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clínico.

PROCEDIMIENTO:

1.- Limpiar y esterilizar el área a trabajar con fenol al 5%

2.- Prender el mechero fischer cerca de donde se va a trabajar, si es posible
colocar otro
3.- Humedecer el hisopo en solución salina estéril, pasarlo sobre la superficie
de la piel (con o sin pelo)
4.- Descargar el hisopo en dos cajas de petri con el medio ya preparado. (Es
recomendable que para cada dos cajas se utilice un solo hisopo con muestra).
No retires completamente las tapas de los medios de cultivo para evitar que se
contaminen
5.- quemar el hisopo y tirarlo.
6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo, enfríalo introduciéndolo en un
extremo del Agar
7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por el método de estría
utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar
completamente la tapa de los medios de cultivo.
8- Repetir el mismo proceso con otro hisopo estéril y con solución salina para
otras dos cajas . siembra por estría utilizando el Asa de platino y así hasta que
se terminen se sembrar todos los medios preparados.
9.- Incubar a 37ºC por 24-48 horas y observar resultados.
10.- Repite el mismo procedimiento pero ahora toma muestra de la faringe
con hisopos estériles en las zonas afectadas como: amígdalas, pared posterior

37
 38

de la faringe, en general cualquier área que manifiesta signos de inflamación,

exudados y úlceras, procurando no tocar con el hisopo la lengua.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

A) REACCIONES POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS

GELOSA SANGRE
Para el aislamiento, cultivo y detección de actividad hemolítica de
Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se
observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia
butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemólisis. Las
colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, Estos crecen
rápidamente a 37  C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura
ambiente (20  C).

MANITOL SAL AGAR (MSA)

Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y enumerar especies clínicas de
estafilococos El manitol cuando es utilizado por los microorganismos, vira de su
color original rojo a amarillo. Se observan colonias chicas, blancas, convexas,
de consistencia butirácea , presentan bordes irregulares. S. aureus Manitol sal
Colonia amarilla S. epidermidis Manitol sal Colonia incolora

AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ)

Para la detección de Staphylococcus aureus coagulasa-positivo, se observan
colonias negras Pequeñas. bordes irregulares con halo amarillo. Para S.
epidermidis y otros Pequeñas, negro-grisáceos, sin halo, El medio presenta un
vire de rojo pálido a amarillo.

38
 39

ESTAFILOCOCO S110
S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se observan colonias chicas,
convexas, De consistencia butirácea y bordes Regulares.

B) DESCRIPCIÓN DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las
siguientes características:
.FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.
.TAMAÑO: grande (más de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.), pequeña (1-2
Mm.)
.COLOR. Reportar el color final después de la incubación
.BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado
.ELEVACIÓN: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado
.SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cuándo los microorganismos pueden causar daño en nuestro

organismo?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

2.- Qué tipo de bacterias son encontradas con mayor frecuencia en nuestra
piel y que pretenden aislarse en esta práctica?
_____________________________________________________________________________
3.-¿ Qué finalidad tiene humedecer el hisopo con solución salina estéril?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
4.- ¿Por qué no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en

39
 40

las cinco cajas de petri con los medios ya preparados?

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
5.- ¿Por qué se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo
ya preparado antes de realiza el sembrado por estrías de los
microorganismos?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
6 ¿En qué cosiste el aislamiento por estrías?

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

7.- Después de haber incubado a 25·C por 48 horas describe las colonias
obtenidas en cada medio de cultivo utilizado

GELOSA SANGRE MANITOL SAL AGAR

(MSA)
.FORMA: FORMA:
.TAMAÑO: TAMAÑO:
.COLOR. COLOR:
.BORDE: BORDE:
.ELEVACIÓN: ELEVACIÓN:

AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ) ESTAFILOCOCO S110

.FORMA: FORMA:
.TAMAÑO: TAMAÑO:
.COLOR. COLOR:
.BORDE: BORDE:
.ELEVACIÓN: ELEVACIÓN:

OBSERVACIONES:.

Dibuja y colorea todos los resultados obtenidos después de las 48 horas de

haber sido incubados.

40
 41

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Práctica No 8
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________
Calif:__________

OBJETIVO

El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus

partes y lo manejará correctamente observando la Presencia de
microorganismos en muestras biológicas

MATERIAL. MATERIAL BILÓGICO

SUSTANCIAS
Microscopio compuesto Sarro dental Sol. Salina. NaCl
al 0.85%
Porta y cubre objetos Muestra de orina Sol. de yodo-
lugol
Palillo Muestra de Excremento
Hisopo

INTRODUCCION.
El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más
útil en un laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o
agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a
simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones,
desde cien veces a cientos miles de veces.
Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios
ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un
sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios de campo claro,
campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios
electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para
producir una imagen ampliada.

41
 42

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la

platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el
uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o
colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,

empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de
incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando
lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y,
cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico
hasta obtener un enfoque fino.

5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y

suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque
fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible
volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3.
El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es
fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si
se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

PROCEDIMIENTO

TECNICAS DE MONTAJE HÚMEDO

La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar
organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se
hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una
lámina de vidrio y cubriéndola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para
reducir la tasa de evaporación y eliminar corrientes de aire, generalmente se
rodea la gota con vaselina.
Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de
campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es
posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilización de filtros
especiales.

42
 43

MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLÓGICA (NaCl 0.85%) O AGUA

Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias
A)
1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solución salina
2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compañero que no se
haya lavado los dientes y colócala en la solución salina mezclando
cuidadosamente
3.- . Examinar con objetivos de 40X y 60 X.

B)
1.- Centrífuga aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5
minutos.
2.- Desecha el líquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento urinario
3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos
limpio y seco
4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de 40X
y 60X

C)
1.- En un tubo de 13 X 100mm coloca las tres cuartas partes de solución salina
fisiológica
2.- Con un aplicador de madera toma muestra de excremento de varias partes
de la muestra y deposítalo dentro del tubo con la solución salina, agita
uniformemente.
3.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de muestra preparada en
los pasos anteriores
4.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio con
objetivo 40X y 60X

MONTAJE EN SOLUCIÓN YODO LUGOL

Utilizada para identificar en heces fecales Protozoos intestinales con sus
organelos citoplasmáticos
1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solución de yodo lugol
2.- Con un palillo de madera toma una pequeña cantidad de muestra fecal y
deposítala en el portaobjetos mediante movimientos de rotación y extendiendo
la muestra por toda la gota
• En el paso No 2 Puedes utilizar la muestra salina preparada en
el inciso C en lugar de la muestra de excremento en forma
directa
3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio

CUESTIONARIO:
1.- ¿Que es poder de resolución?

2.- ¿Qué finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto:

________________________-_______________________________________________________
________________________________________________________________________________

43
 44

3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- ¿Qué tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en
muestras biológicas?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

OBSERVACIONES.
Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada
muestra que preparaste durante el experimento.

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

44
 45

TINCIÓN DE LA CÁPSULA BACTERIANA

Práctica No 9
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO

El alumno aprenderá diversas técnicas para la tinción de la cápsula

bacteriana en distintos cultivos bacteriológicos.

MATERIAL

Cultivo de 24 horas de Klebsiella Rhinoscleromatis en Macconkey o citrato de

simmons (puede aislarse del excremento seco de palomas)
Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)
Cepa de 24 horas en Agar Saboraud Cryptococcus neoformans.
Tinta china ( recientemente filtrada)
Frasco con mordente de Knaysi
Frasco con rojo congo
Frasco con mordente de cápsula

45
 46

INTRODUCCION

La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El

tamaño de estas cápsulas está influenciado por el medio en el que crece la
bacteria. En algunos casos el grosor de la cápsula es sólo una fracción del
diámetro de la célula, en otros casos la cápsula es mucho mayor que la célula.
Las cápsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para
otros organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y
además sirven de reservorio de alimento almacenado. Tienen Propiedad
Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis, lo cual potencia su virulencia
ya que favorece la multiplicación y facilita la invasión. Brinda Protección frente
a Fagos.: Dificulta la fijación de bacteriófagos e impide el pasaje su pasaje que
puedan afectar a la bacteria Las cápsulas de ciertas bacterias productoras de
enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias. Si la bacteria
pierde totalmente su cápsula, puede perder su virulencia y por lo tanto su
capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras
de cápsulas son: neumococos, Klebsiella., aunque también puede estar
presente en bacterias gram positivas y Gram. negativas
Sin embargo las cápsulas tiene diversas propiedades como: Induce la
producción de anticuerpos protectores (esto es útil en la producción de algunas
vacunas) y Permite la diferenciación de tipos serológicos dentro de la misma
especie ya sea por aglutinación con sueros

PROCEDIMIENTO

TINCION DE CÁPSULA
A) METODO DE DUGUID
1.- Poner con el asa una gota pequeña de tinta china en el centro de un
portaobjetos limpio.
2.-Poner una gota de agua del mismo tamaño junto a la gota de tinta china
3.- Tomar con el Asa bacteriológica un pequeño fragmento del cultivo de
bacterias
4.- Hacer una suspensión ( sin extenderla) en la gota de agua
5.- Mezclarla con la tinta china
6.- Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión, evitando que queden burbujas
7.- Observar la preparación al microscopio con el objetivo seco fuerte y de
inmersión.

La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la

bacteria en un campo oscuro.

B) METODO DEL ROJO CONGO

1.- Poner una gota pequeña de rojo congo en el centro de un portaobjetos
limpio
2.-Tomar con el asa bacteriológica un pequeño fragmento de crecimiento de
colonia bacteriana

46
 47

3.- Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis

4.- cubrir el frotis ( SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL MECHERO) con una gotas del
mordente
de cápsula y dejarlo actuar durante un minuto.
5.-Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al aire
6.- Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión

La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la

bacteria de color rojo en un campo de azul oscuro.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué importancia médica tiene la cápsula bacteriana?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.-¿Qué características presenta la cápsula en las bacterias?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.- ¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- ¿Qué sucede con las bacterias cuando estas llegan a perder la cápsula?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

5.- Investiga de qué está compuesta la capa de material mucosa que forma la
cápsula
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Dibuja lo que observaste en ambos objetivos indicados en la práctica con el

microscopio compuesto

CONCLUSIONES:

47
 48

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

TINCIONES SELECTIVAS

Práctica No 10
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO
El alumno aplicará la técnica de tinción específica para lograr observar en el
microscopio la pared celular y endoesporas en distintas muestras
bacteriológicas

MATERIAL

Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus ( lacto bacilos) en Agar nutritivo

y Agar sangre
Cultivo de Bacillus cereus ( tierra contaminada y tratada a 80·C por 10
minutos) en Agar nutritivo y Agar sangre
Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

48
 49

Solución de ácido fosfomolíbdico ( 1%)

Solución acuosa de verde de metilo ( 1%)
Verde malaquita ( solución acuosa al 5%)
Safranina ( solución acuosa al 5% )
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio compuesto
Asa bacteriológica
Mechero Bunsen

INTRODUCCIÓN

PARED CELULAR
Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas
mucosas y externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es
una estructura muy rígida y que da forma a la célula. El espesor de la pared
celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son
considerablemente más gruesas.
Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la
división. Todas las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a
la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.
Composición química de las paredes celulares.- Los peptidoglicanos
proporcionan a la pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros,
están compuestos de tres clases de bloques estructurales: N- Acetil-
Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que consta de cuatro o
cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y Lisina.
Además contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos
Propiedades y Funciones: 1= Brinda protección y resistencia a la bacteria
frente a los posibles cambios de presión osmótica del medio en el que se
encuentra y a la acción de ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que
actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales.3=
Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.4= Participa en la división
(multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmática)5=
En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que presenta
endotoxinas (Lípido A).6= Es el sustrato donde actúan los  - Lactámicos y
otros antimicrobianos.
La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los
contenidos citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido
fosfomolíbdico, dejando la pared sin afectar. Después de teñir se puede
observar la pared celular con citoplasma como ahuecado
ESPORAS

Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso

que presentan algunas bacterias , especialmente del género bacilar. Su forma,
tamaño y ubicación varía según la especie. Estos cuerpos son producidos en el
último estadío del crecimiento celular, que bajo condiciones apropiadas,
germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o vegetativa.

49
 50

Las esporas son resistentes a muchos agentes químicos y físicos.

Hesiten dos tipos de esporas: Endosporas : espora presente en el interior de
la bacteria. Destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que
deriva. Es un cuerpo de pared gruesa muy refringente y sumamente resistente.
Son producidas por especies Bacillus, clostridium y Sporosarcina. Las
endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecación,
calor y mal suministro de nutrientes ( agentes químicos como desinfectantes)
Exosporas : esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la
forma de resistencia bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables
(nutrición, desecación, temperatura, presencia de agentes químicos, presiones,
etc.)

PROCEDIMIENTO
A) TINCIÓN DE LA PARED CELULAR
1.- Prepara un frotis húmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus
sobre un portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA. Prepara otro con B.
cereus
2.-Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos,
adiciónale la solución del ácido fosfomolíbdico cubriéndola por completo.
3.- Déjalo reaccionar 4 minutos.
4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar
totalmente el ácido fosfomolíbdico
5.-Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo
reaccionar 5 minutos.
6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del
material se
desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo
tiempo lava bien, hasta que el agua ya no arrastre colorante.
7.- Seca al aire y después examina con aceite de inmersión
8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro
o azul, mientras que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.

TINCIÓN DE LA PARED CELULAR (TÉCNICA DE KNAYSI)

1.- Hacer un frotis de Bacillus subtilis en la forma usual y fijarlo con calor.
Prepara otro con Bacillus cereus
2.- Cubrir el frotis con mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos.
3.- Lavar la preparación con agua
4.- Colocar con el asa bacteriológica una gota de fuscina fenicada sobre la
preparación.
5.- Poner un cubreobjetos sobre la preparación y observar al microscopio con el
objetivo de inmersión.

La pared celular se observa de color rojo intenso alrededor de la

bacteria, cuyo citoplasma se ve de un color rosa o rojo tenue.

50
 51

A) TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)

1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de
microorganismo uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus
2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de
Malaquita.
3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3
minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar
colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo
nuevamente.)
4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30
segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.
5-Informar: morfología, color y tipo de espora.

El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente..

La Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el
lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán
teñidas con el segundo colorante

TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE COLORACIÓN DE GRAM)

1.- Hacer un frotis de B.suptilis de la forma usual y otra de B. cereus
2.- Teñir con la coloración de Gram
3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersión
las esporas se pueden observar sin teñir o si se encuentra dentro del
bacilo, la espora no se tiñe y el citoplasma se ve de color morado

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

CUESTIONARIO

1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?

51
 52

_______________________________________________________________________________
3. ¿Qué característica y que color tiñeron las paredes celulares de las
bacterias que lograste observar?
_______________________________________________________________________________
4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas
y Gram negativas
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una
exospora
_______________________________________________________________________________
6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las
distintas muestras
microbiológicas?
______________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Dibuja las estructuras celulares que lograste observar con el objetivo de

inmersión

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
TINCIÓN DE GRAM

Práctica No 11

52
 53

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______

Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO

El alumno aplicará una técnica de coloración diferencial para la

identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas..

MATERIAL

Asa de platino Cultivos de Escherichia

coli
Microscopio Cultivo de Staphylococcus
aureus
Porta objetos Cultivo de Cándida
albicans
Aceite de inmersión Esputo de tuberculoso procesado en
autoclave

SUSTACIAS COLORANTES
Colorante violeta cristal de Gram
Solución decolorante alcohol acetona
Safranina de Gram
Yodo de Gram o lugol para gram

INTRODUCCIÓN

TINCION DE GRAM.
Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en
muestras clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación
bacteriana. El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de
Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las
formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos (alargadas) y formas
espiraladas
Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los
microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los
organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son
gramnegativos.
Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las
siguientes:

53
 54

La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos;

en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos gramnegativos son características de
especies de Neisseria
Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o
clostridium, los bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de
Listeria o una de las corineiformes ( difteroides)
Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas
en los laboratorios clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no
fermentados y especies de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una
buena orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más
adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en
especial para instaurar un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos

limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede
usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento
queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una
pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a
la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar
una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar
su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es
necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y
extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa
de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación
acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células
pueden deformarse o romperse.

A) TINCIÓN DE GRAM

1. Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso

anterior
2. Teñir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparación deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

54
 55

8. Teñir con safranina 1min.

9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre
todo en el color de cada preparación.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un frotis?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta
objetos?
_____________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
___
3.-¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de
los microorganismos?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.-De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que
funciona como colorante primario?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

6.-¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.-¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram positivas?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
8.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram. negativas?

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 56

9.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad
que causa cada una de ellas
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

10.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la

enfermedad que causa cada una de ellas.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

56
 57

TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

Práctica No 12
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aplicará las técnicas de coloración de microorganismos

ácido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades
morfológicas

MATERIAL:

*Un cultivo de 72 horas de mycobacterium. Si es posible se les facilitará un

esputo de tuberculoso procesado en autoclave.
* Un cultivo de 24 horas de streptococcus

REACTIVOS
* Fucsina de Ziehl- Neelsen
* Azul de metileno
* Alcohol acidulado

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se
caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las
restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de
lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos
microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la
coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o
negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de
Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como
solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Son bacilos

57
 58

ácido-alcohol resistentes por lo que la tinción de Zieh1Neelsen es útil para la

coloración de estos microorganismos obtenidos de muestras clínicas o de
cultivo. Con esta tinción, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un
fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con la tinción de
Gram, y se observan como bacilos gram positivos con tinción irregular. Estos
microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-
alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes
(BAAR). El género Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden
clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriológico, pero con
fines didácticos se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye
las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y
Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye
también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata Complejo
lepra. En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra
humana, y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedoresel. El
Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se
multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los
histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios Otras
Micobacterias. Micobacterias no comprendidas en los dos grupos anteriores.
Sólo algunas de ellas suelen ser patógenas, otras pueden ser patógenas
oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las
denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M. avium, M.
kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no
tuberculosas

PROCEDIMIENTO

1. Prepara un frotis bacteriano. Haciendo un delgado extendido del material

para su estudio y permitir que se seque al aire.
2. Fijar el frotis con calor, evitar que hierva
3. Cubrir la preparación con carbofucsina. o fuscina fenicada
4. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe
hervir. Si se evapora, se añade más carbofucsina para que no se seque
en ningún momento.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol. Hasta que solo permanezca un
tenue color rosa.
7. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.
8. Teñir con azul de metileno 1 min.
9. Lavar con agua el resto de colorante.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio. Con objetivo de inmersión por 100 X
( aceite)

La tinción es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

58
 59

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué Clasificación de bacterias pueden ser encontradas en este tipo de

tinción?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- ¿Qué otro nombre recibe la tinción ácido- alcohol- resistente?
________________________________________________________________________________
3.- ¿Qué coloración se tiñen las bacterias bacilares en la tinción ácido- alcohol-
resistente que da como resultado la reacción positiva?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.-¿Qué función tiene el alcohol en la técnica de tinción?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.-¿Qué especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

6.- ¿Qué especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la realización de la

práctica, así como el dibujo de las bacterias bacilares observadas en el
microscopio.

CONCLUSIONES:

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 60

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE LA VIABILIDAD Y

EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Práctica No 13
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:
• El alumno manejará las técnicas para observar el efecto de la presión
osmótica que ejerce el Cloruro de sodio y la Sacarosa sobre el
crecimiento microbiano

MATERIAL:

3 Tubos de 16X 150 . En cada uno 10 ml de caldo nutritivo adicionado con:

2ml de cloruro de sodio al 1%, 2ml de cloruro de sodio al 10%, 2ml de cloruro
de sodio al 20%
3 Tubos de 16X 150. En cada tubo 10 ml de caldo nutritivo adicionado con:
2ml de Sacarosa al 1%, 2 ml de Sacarosa al 10%, 2 ml de Sacarosa al 20%
Nefelómetro de Mac Farland
Pipetas de 5 ml , y de 1 ml estériles

60
 61

Agua destilada estéril

CEPAS: AGARES
Escherichia Coli * Agar sangre
Staphylococcus aureus * Agar Nutritivo
Klebsiella pneumoniae * Caldo nutritivo

INTRODUCCIÓN:

A) PRESIÓN:
La osmosis es la difusión a través de una membrana semipermeable que
separa a dos soluciones con distintas concentraciones de sustrato. El proceso
tiende a igualar la concentración de soluto a ambos lados de la memoran.
Cuando a ciertas células bacterianas se les suspende en una solución que
contiene una concentración elevada de cloruro de sodio (20%), el agua pasará
desde la región de menor concentración de sustancia disuelta ( el interior de la
célula tiene una baja concentración salina) a través de la membrana
citoplasmática que es semipermeable a la solución que rodea a la célula. Así la
célula se deshidrata produciéndose plasmólisis. Si las bacterias se colocan en
una solución que contiene menos del 1% de cloruro de sodio, el flujo de agua
se invertirá, es decir ocurrirá la difusión, ya que fluirá el agua desde la solución
externa al interior de la célula y originará la plasmotipsis. Dentro de la célula
se establece una presión osmótica a causa de la gran cantidad de agua que se
acumula allí, esta presión hará que se hinchen e incluso las células pueden
reventar. El mecanismo de inhibición microbiana es la plasmólisis: las células
se deshidratan y por lo tanto Son incapaces de metabolizar o crecer, pueden
morir o permanecer vivas pero en condiciones durmientes. Sin embargo
también existen microorganismos que requieren altas concentraciones salinas
y son denominadas halófilos, y los que requieren presiones osmóticas elevadas
se les conoce como osmófilos. La mayor parte de las bacterias pueden tolerar
una amplia gama de presiones osmóticas externas y fuerzas iónicas debido a
su capacidad de regular la osmolaridad interna y la concentración iónica. La
osmolaridad está regulada por el transporte activo de iones potasio al interior
de la célula
A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular
la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo
tanto, evita que la membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor
excesiva.

B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del

citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que
tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para
garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello
se logra esencialmente aumentando la concentración de un soluto muy soluble
en agua en el interior celular, soluto llamado genéricamente soluto
compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos:

61
 62

bombeando iones al interior;

sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;
bombeando sustancias osmoprotectoras.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE LA CEPA A ESTUDIAR

Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una
turbiedad del No 10
del nefelómetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelómetro solo
cuidar la turbiedad a manera de suspensión.

A) EFECTO DEL CLORURO DE SODIO

1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 3

tubos con 10 ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de cloruro de
sodio con las distintas concentraciones ( al 1%, 10% y 20 º% de NaCl)
2.-Rotularlas de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a
inocular en ellos
3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensión bacteriana correspondiente
4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada
5.- Incubar los tubos a 37·C durante 24- 48·C-
6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su
turbiedad, comparándola con las ampolletas del nefelómetro de Mac- Farland

B) EFECTO DE LA SACAROSA

1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 3

tubos con 10 ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de sacarosa
con las distintas concentraciones ( al 1%, 10% y20% de Sacarosa)
2.-Rotularlas de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a
inocular en ellos
3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensión bacteriana correspondiente.
4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada.
5.- Incubar los tubos a 37·C durante 24- 48·C.
6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su
turbiedad, comparándola con las ampolletas del nefelómetro de Mac- Farland.

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cómo se define la ósmosis?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- ¿Qué es plasmólisis y cuando ocurre?

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 63

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.- ¿Qué sucedió con las bacterias al incrementar la concentración del NaCl y
sacarosa en los distintos caldos nutritivos?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- ¿Qué nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones
osmóticas?
________________________________________________________________________________
5.- ¿Quién es el responsable en la célula bacteriana controlar la presión en
medios hipotónicos?
________________________________________________________________________________
6.- ¿Cuándo se establece un medio hipotónico?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

7.- ¿Cuándo se establece un medio hipertónico?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

RESULTADOS:

Anota los resultados del efecto del cloruro de sodio y de la sacarosa

sobre el crecimiento, indicando el número de ampolleta del nefelómetro a que
corresponda dicho crecimiento. En caso de no contar con el Nefelómetro
registra a manera de cruces dicho crecimiento bacteriano

CEPAS EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

1% NaCl 10% NaCl 20% NaCl
E.COLI
S.AUREUS
K.PNEUMONIAE
CEPAS EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
1% 10% 20%
Sacarosa sacarosa Sacarosa
E.COLI
S.AUREUS
K.PNEUMONIAE

OBSERVACIONES

63
 64

Dibuja a manera de esquema los pasos realizados en la elaboración de la

práctica, así como los resultados obtenidos después del tiempo de incubación.

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO Y PUNTO TÉRMICO MORTAL EN

MICROORGANISMOS

Práctica No 14
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________
Calif:__________

OBJETIVO

El alumno aplicará un método que le permitirá conocer la temperatura y

el tiempo mínimos necesarios para esterilizar una suspensión, así como el
efecto que tienen diferentes diluyentes sobre dichas determinaciones.

MATERIAL

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 65

Tubos de 13 X 100 estériles

Pipetas de 5 ml estériles
Pipetas de l ml estériles
Cajas de Agar Nutritivo o Agar sangre
Baños maría a 37·C, 70·C, y ebullición
Tubos de ensaye con 1 ml de puré de tomate, jugo de naranja y agua destilada
CEPAS
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Klebsiella Pneumoniae

INTRODUCCIÓN:

Diferentes especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones

de temperatura óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen
mejor a temperaturas bajas (15 a 20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de
30 a 37·C, la mayor parte de la termófilas entre 50·C y 60·C.
La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la
temperatura óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura
del huésped es óptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente.
El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se
correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha
especie.
Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la
respuesta al choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando
son expuestos a una elevación súbdita en la temperatura por arriba de la
óptima para el crecimiento. Al parecer estas proteínas son resistentes al calor y
estabilizan a las proteínas de la célula sensible al calor. Las bacterias también
exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la muerte de las células
por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el
enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90%
de las células

EFECTO LETAL DEL CALOR.

Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento,

se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa
que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe
a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura
esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño
irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la
práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí
algunos parámetros utilizados:

tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran

todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada
temperatura;

65
 66

tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10%

la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también
llamado valor D);
punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las
bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia
empleado es de 10 min).

PROCEDIMIENTO

A) PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS

1.- Adicionar agua destilada a cada cepa que se va a estudiar cuidado de que
quede turbia a manera de suspensión.
2.- Colocar 1 ml de jugo de naranja en un tubo de 13 X 100, 1 ml de Agua
destilada en otro tubo de 13X100 y 1 ml de puré de tomate en otro tubo de 13
X 100. Será necesario rotularlos.
3.- transferir 1 ml de la suspensión bacteriana preparada a cada tubo

B) DETERMINACIÓN DEL PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo
de bacteria a estudiar
3.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar.
4.- Anotar en cada tubo las temperaturas siguientes testigo, 37·C, 70·C,
y ebullición
5.- Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste
con agua, jugo de naranja y puré de tomate a tratar
6.- Calentar la suspensión a la temperatura indicada en un baño maría durante
10 minutos ( el tubo testigo NO SERA CALENTADO)
7.- Vaciar el contenido de cada tubo en la superficie de una placa de Agar
nutritivo y
Homogeneizar por rotación sobre la mesa o mediante extensión con varilla de
vidrio doblada a 90 grados
8.- Incubar a 39:C durante 24- 48 horas
9.- Observar si hay crecimiento.

C) DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de
bacteria a estudiar
2.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar
3.- Anotar en cada tubo los tiempos que se indican a continuación: Testigo,
5 minutos, 15 minutos, 30 minutos
4.- colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste con
agua, jugo de naranja y puré de tomate a estudiar
5.- Calentar en baño maría a 70·C para todos los tubos y respetando los
tiempos indicados ( el tubo testigo NO SE CALIENTA)

66
 67

6.- Vaciar el contenido de cada tubo sobre la superficie de una placa de Agar
nutritivo y
homogeneizar por rotación sobre la mesa o extensión con varilla de vidrio
doblado a 90 grados
7.- Incubar las placas a 37·C durante 24- 48 horas
8.- Observar si presenta o no crecimiento

CUESTIONARIO:

1: ¿Qué características presentan las bacterias llamadas psicrófilas?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.- ¿A qué temperatura crecen las bacterias mesófilas?
________________________________________________________________________________
3.- ¿Qué sucede con las proteínas en la célula bacteriana cuando se aplica un
cambio brusco en la temperatura

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.- ¿En qué consiste el tiempo térmico letal?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

5.- ¿En qué consiste el punto térmico mortal?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6.- ¿A qué temperatura se reporta el punto térmico mortal para las bacterias
estudiadas en los distintos diluyentes?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7.- ¿Qué muestras después de la incubación reporta el tiempo óptimo para la
destrucción de las bacterias en los distintos diluyentes?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________

RESULTADOS:

Completa las siguientes tablas después del tiempo adecuado y temperatura de

incubación para los distintos medios.

A) PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

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 68

Cepas Diluyente Crecimiento después de

calentar
E. coli Testig 37 70ºC Ebulli
o ºC c.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate
S. aureus Testig 37 70ºC Ebulli
o ºC c.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate
K.pneumoniae Testig 37 70ºC Ebulli
o ºC c.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate

B) TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

Cepas Diluyente Crecimiento después de

calentar
E. coli Testig 5 15mi 30
o min n min.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate
S. aureus Testig 37 70ºC Ebulli
o ºC c.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate
K.pneumoniae Testig 37 70ºC Ebulli
o ºC c.
Agua
Jugo de Naranja
Puré de tomate

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 69

OBSERVACIONES:
Dibuja los pasos que seguiste para la realización de la práctica

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________

INHIBIDORES BACTERIANOS

Práctica No 15
Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______
Grupo_______
Nombre del
titular_____________________________________Fecha____________________
Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________
Calif:___________

OBJETIVO:
El alumno manejará algunas técnicas para poner de manifiesto la
actividad de los antibióticos sobre el crecimiento microbiano.

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 70

MATERIAL:
Cajas de petri con medios de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo
Asa bacteriológica
Mechero Fisher
Sensidiscos ( antibiogramas)
Fenol al 5%

SUSTANCIAS BIOLÓGICAS
Cultivo de en caldo nutritivo de 24 horas de Bacillus subtilis ( lactó bacilos)
Cultivo de 24 horas Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)
Cultivo de 24 horas de Escherichia Coli en medio Macconkey

INTRODUCCIÓN:

ANTIBIÓTICOS
Son sustancias capaces de destruir y eliminar los microorganismos causantes
de una infección producida por bacterias (faringitis, bronquitis, otitis,
neumonía, amigdalitis, etc). No son eficaces cuando la infección es producida
por virus (gripe).
Cada tipo de antibiótico será efectivo para destruir una clase de
microorganismos en función de su modo de actuación..Se les llama antibióticos
de amplio espectro a los que son efectivos frente a un gran número de agentes
microbianos: los microorganismos causantes de la infección son capaces de
desarrollar resistencias al antibiótico de manera que este no será eficaz para
eliminarlos. Cada año se investiga creando nuevos antibióticos eficaces para
las formas microbianas resistentes a sus anteriores tratamientos. Se deben
usar siempre bajo prescripción médica.

Existen pruebas (antibiogramas) que determinan el antibiótico más eficaz para

cada infección, pero normalmente se sigue un protocolo de actuación de los
antibióticos de elección para cada tipo de infección.
Es el médico el profesional que juzga la infección existente y el antibiótico
eficaz para su tratamiento.
Los antibióticos siempre se deben tomar bajo prescripción médica y cumplir el
tratamiento completo. El incumplimiento del tratamiento puede dar lugar a
recaídas que precisarán el tratamiento con otro tipo de antibiótico por haber
desarrollado resistencia al primero.

MODO DE ACCION DE LOS ANTIBIÓTICOS

1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular. 2.- Alteración sobre la

membrana citoplásmica. 3.- Inhibición de la síntesis proteica.4.- Bloqueo de la
síntesis de los ácidos nucleicos.

ANTIBIOGRAMAS
Para estudiar la sensibilidad de un microorganismo por técnicas de
difusión se dispone de dos sistemas, el de discos de papel impregnados con el

70
 71

antibiótico y las tabletas, consistentes en una suspensión del antibiótico

liofilizada y comprimida en material inerte. Los fabricantes recomiendan
conservar los discos a –20 °C para largos periodos o entre 2 y 8 °C si se utilizan
en el plazo de una semana. Por el contrario, las tabletas se han considerado
más estables, pudiéndose almacenar a temperatura ambiente y manteniendo
su actividad más tiempo que los discos .Por lo que respecta a la temperatura
de conservación, al comparar para cada antibiótico los diámetros de los halos
de inhibición de los discos conservados entre 4 y 6 °C con los conservados a
temperatura ambiente no se encontraron diferencias significativas a lo largo de
todo el estudio; tampoco se encontraron diferencias al comparar los halos de
las pastillas conservadas entre 4 y 6 °C con las conservadas a temperatura
ambiente, de modo que tanto los antibióticos que permanecieron estables
durante el tiempo del estudio como los que disminuyeron su actividad lo
hicieron de modo paralelo a ambas temperaturas

PROCEDIMIENTO:

A) PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS

Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una turbiedad
del No 10
del nefelómetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelómetro solo
cuidar la turbiedad a manera de suspensión.

B) ACTIVIDAD DE LOS ANTIBIÓTICOS EN DISCO

1.- Marcar 2 placas Muller-Hinton, o Agar nutritivo con el nombre de la cepa
S.aureus y otra con el nombre de K.pneumoniae.
2.- Tomar con un hisopo diferente las muestras que fueron preparadas en el
inciso A de este procedimiento y sembrar las placas rotuladas
3.- Quemar el hisopo y desecharlo.
4. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas y presionar
ligeramente los discos contra la gelosa
5.-Incubar las placas a 37ºC durante 24 horas
6.- Medir el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento producidos por
cada antibiótico y notar los resultaos

C) DETERMINACIÓN DE INHIBIDORES EN LA LECHE

1.- Preparar el medio de cultivo de la siguiente forma:
-Preparar medio de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo, esterilizarlo y
enfriarlo a 40ºC
- Añadir 0.5 ml de B. Subtilis obtenido de un cultivo de 24 horas en caldo
nutritivo en una caja de petri esterilizada
- Vaciar 15 ml del medio de cultivo ya enfriado a 40ºC. Distribuir en forma
homogénea
- Dejarlo que solidifique.
2.- Tomar una muestra de leche y calentar a baño María a 80ºC durante 3
minutos exactamente, enfriar bruscamente la leche en un baño con hielo

71
 72

3.- Impregnar un disco de papel filtro con la leche fría, secarlo ligeramente y
con unas pinzas esterilizadas depositarlos en el centro de una caja de petri
preparada anteriormente
4.- Incubar la placa de 18 a 20 horas a 37ºC y observar las zonas de inhibición
causadas por los antibióticos sobre el B. Subtilis.
5.- Si la muestra de leche contiene antibióticos, alrededor del disco se formará
un halo, el cual indica la inhibición de microorganismos y presencia de
antibióticos en concentraciones superiores a las permitidas

CUESTIONARIO

1.- Qué función tiene lo antibióticos?

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2.-Qué son los antibiogramas y cuál es su función?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
3.-Menciona dos causas del porque los microorganismos pueden llegar a
hacerse resistentes a los antibióticos?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4.-En caso de no tener Sensidiscos en el laboratorio: ¿cómo puedes fabricarlos?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5.-Escribe dos Fuentes naturales de donde se puedan obtener los antibióticos
________________________________________________________________________________
6.-Según los resultados de tu práctica . ¿Qué medicamentos puedes utilizar
para destruir y eliminar a los microorganismos como: Staphylococcus y
Escherichia Coli?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

7.- Investiga qué tipo de enfermedades pueden ocasionar los microorganismos

estudiados en la práctica
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

8.-Existió inhibición de microorganismos y presencia de antibióticos superiores

a las permitidas en la leche que estudiaste?________por qué?

________________________________________________________________________________

72
 73

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Realiza los dibujos de los resultados obtenidos a las 24 horas de

incubación

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA

73
 74

1) Dr Martínez Ramos, Manual de Prácticas de Microbiología General, Centro

de Graduados e
investigación, Instituto Tecnológico de Veracruz, l993.

2) M.C Gaitán Hinojosa Mario Alberto, Manual de prácticas de Bacteriología

General, Facultad e
ciencias Químicas , Universidad de Colima.

3) Manual de Laboratorio Manual de prácticas de Microbiología. Cualquiera

de estas
prácticas se puede hacer perfectamente en un laboratorio de instituto ...
http://www.joseacortes.com/practicas/ Última modificación: 17-03-2005 ©
2001 por José A.
Cortés

4) El Microscopio óptico compuesto

Práctica de laboratorio: Manejo y uso del microscopio optico compuesto.
...
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella
...
www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm - 23k - En caché -

5) http://html.rincondelvago.com/biologia_41.html

6) http://html.rincondelvago.com/tincion-de-gram.html

7) gráficos obtenidos de:

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

8) Las tinciones - Monografias.com

Tinción Simple: utiliza un solo colorante. Tinción de Gram: ... En la
muestra de
la práctica anterior 3 eran gran positivo por su coloración morada. Tinción
...
www.monografias.com/trabajos15/ tinciones/tinciones.shtml - 28k -
En caché - Páginas similares

9) Pelczar, Michael, et.al, Elementos de Microbiología, McGraw-Hill, Mexico

10) Zinsser, Joklik Willett Amos, Microbiología, Editorial médica panamericana,

18º edición,
México.

11) Koheman Elmer w., et.al. Diagnóstico Microbiológico, Panamericana,

quinta edición, México.

74