BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan

berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak yang dapat berupa gas atau
zat cair, dan fase diam yang dapat berupa zat cair atau zat padat. Kromatografi
merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fase, satu dari fase-fase ini membentuk suatu lapisan
stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan
yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fase stasioner mugkin
suatu zat padat atau suatu cairan, dan fase yang bergerak mungkin suatu cairan
atau suatu gas.
Kromatografi cair kinerja tinggi (sebelumnya disebut sebagai kromatografi
cair tekanan tinggi), HPLC(High Performance Liquid Chromatography) adalah
teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran , untuk mengidentifikasi setiap komponen , dan untuk mengukur
masing-masing komponen. HPLC dianggap sebagai teknik instrumental kimia
analitik (sebagai lawan dari teknik gravimetri). Secara umum, metode ini
melibatkan sampel cairan yang melewati bahan adsorben padat dikemas ke dalam
kolom menggunakan aliran cairan pelarut. Setiap analit dalam sampel berinteraksi
sedikit berbeda dengan bahan adsorben, sehingga memperlambat aliran analit.
Jika interaksi lemah, analit mengalir dari kolom dalam waktu singkat, dan jika
interaksi yang kuat, maka waktu elusi panjang.
HPLC merupakan Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom
berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa
partikel kecil (3m hingga 50 m), yang memungkinkan tercapainya
keseimbangan secara cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom
partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu
mengalirkan fasa gerak pada tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai

[Type text] Page 1

 laju aliran beberapa ml per menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji
yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20 g) untuk isi kolom tersebut di atas,
maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini kromatografi cair
dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada
kromatografi gas, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan
panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat
yang dapat menguap.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa pengertian HPLC?

2. Apa saja jenis- jenis HPLC?
3. Bagaimana prinsip dasar HPLC?
4. Apa komponen-komponen HPLC?
5. Bagaimana cara kerja HPLC?
6. Bagaimana diagram alir HPLC
7. Apa kelebihan dan kekurangan HPLC?
8. Bagaimana aplikasi HPLC?

1.3 Tujuan

1. Mengetahui pengertian HPLC
2. Mengetahui jenis- jenis HPLC
3. Mengetahui prinsip kerja HPLC
4. Mengetahui komponen-komponen HPLC
5. Mengetahui cara kerja HPLC
6. Mengetahui diagram alir HPLC
7. Mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC
8. Mengetahui aplikasi HPLC

[Type text] Page 2

 BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian

HPLC yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom
dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan
kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi
melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi
dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom
dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini
membuatnya lebih cepat.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan
fase cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu.
Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

2.2 Jenis-Jenis HPLC

Berdasarkan prinsip kerjanya :

1. HPLC Isocratic
HPLC isocratic digunakan pada analisis senyawa kimia yang tidak
memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, tekanan (preassure) dan daya
alir (flow) selama sampel diinjeksikan dan terelusi di dalam kolom.
2. HPLC Gradient
HPLC gradient digunakan pada analisis senyawa kimia yang biasanya
memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, suhu, preassure dan flow selama
sampel terelusi di dalam kolom agar senyawa kimia tersebut dapat dipisahkan dari
campurannya secara sempurna.

[Type text] Page 3

·         Berdasarkan berdasarkan sifat kepolaran (polarity) dari fase diam dan fase
geraknya :
1. Kromatografi fasa normal (normal phase) adalah kromatografi yang
dilakukan dimana fase diam lebih polar dibandingkan fase geraknya.
Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol
yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan
adalah heksana atau i-propileter.
2. Kromatografi fase terbalik (reversed phase) balik adalah kromatografi
dengan fase gerak lebih polar dibandingkan fase diamnya. Fase gerak yang
digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Selain klasifikasi tersebut, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan
jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika
dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus
silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi
silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah  atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut

[Type text] Page 4

akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran

[Type text] Page 5

 ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan
sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.3 Prinsip Dasar HPLC

Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji
diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan
terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan
afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder
yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

2.4 Komponen-Komponen HPLC

Komponen  HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa,
alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Berikut diagram skematik sistem kromatografi cair:

[Type text] Page 6

 Keterangan :
1. Botol pelarut (reservoir) dan fase gerak
a. Botol pelarut
Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau
eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa. Wadah fase gerak harus
bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam
fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis.
Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan
resolusi ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
b. Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh

[Type text] Page 7

karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fase gerak HPLC:
 Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan
yang akan dianalisis.
 Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya
kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
 Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom.
 Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun.
 Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP
(centi Poise).
 Sesuai dengan detector.
2. Pompa(Pump)
Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan
melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output
pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,
dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan.

[Type text] Page 8

 3. Injektor (injector)
Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel
yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom.
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume
(misalnya 20 – 500 μL).

    Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini
bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi
tidak dipengaruhi
b. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang
digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan
pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil
dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat
menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk
menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan
cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume

[Type text] Page 9

 yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi
LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila
VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Syarat- syarat injektor yang baik yaitu dapat memasukkan sampel ke
dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin, mudah digunakan. keberulangan
tinggi dan dapat bekerja walaupun ada tekanan balik.
4. Kolom (coloum) dan fase diam
a. Kolom(coloum)
Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada
pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil,
oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel
silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.Berhasil atau gagalnya suatu
analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika yang dimodofikasi yang dimodofikasi secara kimiawi
secara kimiawi (bonded (bonded phase), atau polimer-
phase),atau polimer-polimer polimer stiren/divinil benzen.Rata-
stiren/divinil benzen.Rata- rata diameter partikel 3,5 atau
rata diameter partikel 3,5 10µm dengan kisaran sempit.
atau 10µm dengan kisaran

[Type text] Page 10

 sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi

terklorinasi atau alkohol atau alkohol untuk fase normal.
untuk fase normal. Untuk Untuk fase terbalik (reversed
fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau
phase) digunakan metanol asetonitril + air atau
atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100
bufer.Kecepatan alir : 1-3 µl/menit.Modifikasi instrumen
ml/menit Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan
bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
fase diam, akan tetapi umur hanya ¼ dari kolom konvensional.
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

[Type text] Page 11

  Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
b. Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.
5. Detektor (detector)
Detektor digunakan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor HPLC yang
umum digunakan adalah detektor UV 254 nm.
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil

[Type text] Page 12

 c. stabil dalam pengopersiannya
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
6. Komputer (PC) dan Printer
Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari
pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil
pembacaan disebut kromatogram.

2.5 Cara Menggunakan HPLC

Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk
ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan
pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian
bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi
oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat =
recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa
pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi
dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter permenit. Rekorder
menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel.
Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil
volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini
terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic
polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben
padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam
suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven
dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami
perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18
yang terikat pada silica gel.

[Type text] Page 13

 Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak
selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah
mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada
kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Elusi pada HPLC adalah elusi secara isokratik yaitu komposisi fase gerak
tetap selama elusi, elusi bergradien yaitu fase gerak berubah ubah selama elusi
Faktor yang mempengaruhi :
a. Tekanan yang digunakan
b. Kondisi fase diam
c. Temperatur kolom
d. Keunggulan
e. Lebih cepat dan efisien waktu
f. Ukuran kolom kecil sehingga pemisahannya sempurna
g. Mempunyai detektor yang senitif
h. Kromatogram biasanya tidak terdapat noise
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien
dapat dipilih dengan cara trial and error.
Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai
fungsi dari afinitas elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam.
Hal ini sesuai dengan ekstraksi liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu.
Sesuai dengan prinsip tersebut maka komponen yang hidrofob dari analit akan
keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan komponen yang
hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah.
Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruangan pembuangan dari
HPLC ini dicuci dengan asam asetat.

[Type text] Page 14

2.6 Diagram Alir HPLC

Adapun cara untuk melihat seluruh proses diagram alir HPLC, antara lain:
1. Injeksi sample
Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
2. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa
itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
3. Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet.
4. Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah
X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui
layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar
(sangat sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan
berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

[Type text] Page 15

2.7 Kelebihan dan Kekurangan HPLC
1. Kelebihan HPLC
a. Dapat dilaksanankan pada suhu kamar
b. Karna sudah digital maka lebih cepat, praktis dan mudah
melaksanakannya
c. Peka dan detektor HPLC dapat bervariasi
d. Pelarut pengembang dapat dipakai berulang kali demikian juga dengan
kolomnya.
e. Ideal untuk molekul besar dan ion
f. Mudah memperoleh cuplikan
g. Memiliki daya pisah yang baik
h. Dapat menghindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang
di analisis.
i. Dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan
termolabil
j. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
2. Kekurangan HPLC
a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organik
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan
gradient elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian
yang terbatas
e. Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
f. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan
ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh
kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus
dijaga.

[Type text] Page 16

2.8 Aplikasi HPLC
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin
Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
7. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
8. HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak
atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC
berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan
senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-
komponennya.
9. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya
terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.
HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah
spekrum UV atau spectrum sinar tampak.

[Type text] Page 17

 BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan
1. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom,
detector, pengolahan data.
2. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase
mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara
lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil
samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam
suatu campuran.
3. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan
yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-
zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan
fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan
dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi
pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus
mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient
elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian
yang terbatas.

[Type text] Page 18

 DAFTAR PUSTAKA

http:// Cara Kerja HPLC - ReferensiKu.htm

http:// ChemistryKu Makalah Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).htm

http:// HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ Lansida.htm

http:// KIMIA INDONESIA High Performance Liquid Chromatography

(HPLC).htm

http:// Tentang Kimia HPLC (High Performance Liquid Chromatography).htm

[Type text] Page 19