PROGRAM STUDI PETERNAKAN JURUSAN PETERNAKAN DAN PERIKANAN FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERIKANAN UNIVERSITAS TADULAKO Bahan Seminar : Proposal Penelitian Judul : Pengaruh Level Glukosa Pada Pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat Terhadap Kualitas Spermatozoa Sapi Donggala Pembawa Seminar: Putra Aditiya Kurniawan ‘Stambuk : 012117 146 Dosen Pembimbing : 1. Dr. Ir. Mirajuddin, M.Kes.IPM 2. Dr. Ir. Yulius Duma, M.P.IPM Tempat - Waktu t= BAB. I PENDAHULUAN 1.1. LatarBelakang Sapi Donggala merupakan sumberdaya genetik seperti halnya sapi lokal Indonesia lainya yang dapat dikembangkan untuk perbaikan mutu genetik sapi lokal Indone: Sulawesi Tengah memiliki breed ternak yang tidak terdapat di Provinsi lain di Indonesia yaitu sapi lokal Donggala yang mana ternak tersebut memiliki standar mutu bibit di Indonesia, sehingga pengembangan sapi Donggala adalah langkah yang harus diambil untuk mencegah dari ancaman kepunahan karakteristik atau sfat-sifat yang memiliki nilai ekonomis yang tinggi. Peningkatan genetik ternak dapat dilakukan melalui aplikasi teknologi Inseminasi Buatan (IB) juga untuk tujuan percepatan produktivitasnya dan populasinya. Berhasilnya suatu program (IB) pada ternak tidak hanya tergantung pada kualitas dan kuantitas semen yang di ejakulasikan, juga kesanggupan untuk mempertahankan kualitas dan volume semen yang lebih baik schingga lebih banyak betina yang dapat diinseminasi. Pengenceran semen dilakukan untuk mengurangi kepadatan dan menjaga kelangsungan hidup spermatozoa. Bahan pengencer tersebut mengandung zat-zat makanan sebagai sumber cenergi dan tidak bersifat racun bagi spermatozoa, dapat melindungi spermatozoa dari kejut dingin (cold shock), menghambat pertumbuhan mikroba serta bersifat sebagai penyangga (Djanuar, 1985). Untuk menghaslikan bahan pengencer berkualitas tinggi dibutubkan bahan pengencer semen yang mampu mempertahankan kualitas spermatozoa selama proses penyimpanan, pendinginan maupun pada saat thawing. Karna itu, bahan pengencer semen beku harus mengandung sumber nutrisi, buffer, bahan anti cold shock, antibiotic, dan krioprotektan yang dapat melindungi spermatozoa selama proses pembekuan. Sumber energi yang paling banyak digunakan adalah karbohidrat terutama pada glukosa yang paling mudahdimetabolisme oleh spermatozoa. Buffer yang umum digunakan adalah tris sitrat_ yang mempunyai kemampuan sebagai penyangga yang baik dengan toksisitas yang rendah dalam konsentrasi yang tinggi (Steinbach dan Foote, 1967). ‘Masalah utama yang sering dihadapi pada bahan pengencer yaitu belum adanya bahan, pengencer optimal atau gold standard yang namun mampu mempertahankan kualitas spermatozoa dalam waktu yang relatf lebih lama. Bahan pengencer yang baik harus dapat memberikan kemampuanya dalam menekan tingkat penurunan kualitas spermatozoa sehingga pada akhirnya dapat memperpanjang lama penyimpanannya pasca pengenceran (Solehati dan Kune, 2009). Berdasarkan permasalahan tersebut diatas, penelitian ini didesain dan direncanakan untuk mendapatkan recovery motilitas spermatozoa progresif dengan viabilitas tinggi hasil pemberianlevel Glukosa pada pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat terhadap kualitas spermatozoa dengan motilitasprogresif, morfologi normal, persentase spermatozoa hidup, dengan tepat mempertahankan fertilitasnya. Penyiapan spermatozoa ternak sapi yang unggul dalam upaya pemenuhan ketersediaannya guna mendukung percepatan produktivitas dan populasi ternak sapi Donggala. Sclain hal tersebut, hasil penelitian ini pun diharapakan sebagai inovasi dalam mendukung kelestarian dan pemanfaatan yang berkelanjutan terhadap ternaklokal Sulawesi Tengah, maka perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui' motilitas, morfologi dan viabilitas spermatozoa dari semen sapi Donggala dalam pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat dengan berbagai level Glukosa. 1.2. Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui pengaruh level Glukosa yang pada bahan pengencer Tris Sodium Bicarbonat terhadap kualitas spermatozoa sapi Donggala. 2. Untuk mendapatkan recovery motilitas spermatozoa progresif dengan viabilitas tinggi hasil pemberian level Glukosa pada bahan pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat terhadap spermatozoa sapi Donggala 1.3 Manfaat Penelitian 1. Referensi atau informasi ilmiah mengenai peningkatan kualitas spermatozoa pada pengaruh pemberian level Glukosa pada pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat untuk penelitan dan penggunaan yang lebihluas. 2. Metode yang tepat untuk mendapatkan bibit spermatozoa sapipotong yang berkualitas dalam mengatasi keterbatasan bibit spermatozoa sapi potong asli/lokal Indonesia unggul, dan sekaligus mendukung pengembangan dan pemanfaatan ternak potong asli/local sebagai Sumber Daya Genetik Ternak (SDGT) Indonesia, serta untuk tujuan percepatan pengaliran Keunggulan pejantan melalui aplikasi teknologi inseminasi buatan (IB) dan atau teknologi reproduksi lainnya, 1.4 Hipotesis Penggunaan level Glukosa pada pengencer Tris Sitrat Sodium Bicarbonat terhadap kuaitas spermatozoa dapat _meningkatkan recovery motilitas spermatozoa progresit, spermatozoa dengan morfologi normal, dan persentase spermatozoa hidup yang lebih tinggi pada semen sapi Donggala. BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini direncanakan pelaksanaannya di UPTD Pembibitan ternak Provinsi Sulawesi Tengah untuk penampungan semen, Laboratorium Reproduksi dan Produksi Fakultas Peternakan dan Perikanan Universitas Tadulako sebagai tempat analisis semen setelah penampungan dan penyimpanan sampel semen yang dicobakan. Penelitian ini akan berlangsung mulai bulan Desember tahun 2021 sampai Januari tahun 2022. 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Bahan Penelitian Sitrat1, Semen segar. Semen segar yang akan dijadikan bahan dalam pengenceran spermatozoa pada penelitian ini adalah semen segar sapi Donggala, yang diperoleh melalui penampungan semen dengan metode vagina buatan. Sapi yang dijadikan sumber semen adalah sapi Potong Donggala sebanyak 3 ekor dengan kisaran umur 2 sampai 5 tahun. 2. Pengencer semen (extender). Extender yang akan digunakan adalah Tris — Citrate — Sodium Bicarbonat - D-Glucose 3. Kertas lakmus, untuk mengukur pH 4. Bahan untuk analisis kualitas spermatozoa: ~ NaCl 3,0%, untuk mematikan spermatozoa pada analisis konsentrasi spermatozoa pet ml semen dengan kamar hitung hemositometer improvedNeubauer dan Spektofometer - Eosin 2,0 %, untuk perwarnaan pada pembuatan preparat apusan spermatozoa untuk analisis morofologi dan viabilitas spermatozoa - Bahan-bahan pendukung lainnya: aqudestilasta, aluminium voil, Tissue, dandetergen. 5. Bahan Penampungan semen: Metode vagina buatan ~ Vaselin - Air panas - Tabung penampung semen - Detergen 3.2.2 Peralatan penelitian Peralatan Penelitian 1, Obtilab Viewer untuk analisis spermatozoa (konsentrasi, motilitas, morfologi, dan viabilitas) 2. Hemositometer “improve” Neubauer, sebagai alat untuk menghitung konsentrasi spermatozoa per ml semen 3. Pipet pencampur (pipet dengan pengaduk berwarna merah) dengan aspirator 1 set: untuk menghisap dan mencampur semen dengan NaCl 3% pada proses menghitung konsentrasi spermatozoa dengan Hemositometer. 4. Object dan Cover glass: untuk analisis spermatozoa 5. Pipet tetes dan Micropipet, untuk mengambil sampel semen atau sperma sebelum atau sesudah perlakuan pada analisis kualitas spermatozoa selama penelitian 6. pH, untuk mengukur pH semen segar dan semen cair setelah penggantian seminal 7. Rak tabung reaksi: wadah penampung semen sebelum dan sesudah perlakuan pada proses analisis spermatozoa. 3.3 Variabel Penelitian Variabel peenelitian yang akan diukur meliputi kualitas semen segar/ejakulat secara makroskopis dan kualitas spermatozoa sebelum dan sesudah pemberian perlakuan secara mikroskopis. 3.3.1 Penilaian Kualitas Semen Segar/Ejakulat Dilakukan Secara Makroskopis 1. Volume: Pengamatan secara langsung dengan melihat jumlah volume pada tabung reaksi setelah ejakulat 2. Warna: Di lihat secara visual. Semen segar terdiri dari beberapa warna yaitu: susu atau kream putih kekuningan 3. Bau: Pengamatan terhadap bau dilakukan dengan cara mengendus tabung reaksi yang berisikan semen setelah ejakulat 4. Konsistensi/kekentalan: Untuk mengetahui kosistensi atau kekentalan dilakukan dengan melihat kepadatan semen dalam tabung reaksi 5. Ph: Dihitung menggunakan PH meter atau kertas lakmus3.3.2 Penilaian Kualitas Spermatozoa Mikroskopis 1. Konsentrasi spermatozoa per ml semen dihitung menggunakan hemositometer neubare, sperma biasanya dihitung di empat kotak sudut dan kotak pusat. Kedua sisi hemositometer diisi dan dibarkan menetap selama 3-5 menit, kemudian dilakukan perhitungan, dan jumlah harus sesua dalam 10%. Rata-rata dari dua hitungan digunakan dalam perhitungan. (Strasinger KS, Lorenzo SM. 2014, WHO.2010) 2. Motilitas spermatozoa: Y Gerakan masa, untuk semen segar menurut Feradis (2010) menyatakan bahwa sperma dalam suatu kelompok mempunyai kecenderungan untuk bergerak sama-sama dalam satu arah yang menyerupai gelombang yang tebal atau tipis, bergerak cepat atau lamban tergantung dari spermatozoa hidup didalamnya. Gerakan massa spermatozoa dapat dilihat jelas dibawah mikroskop dengan pembesaran (10x 45). ¥ Gerakan individu: Dibawah pandangan mikroskop (10x45) pada selapis tipis semen diatas obyck glas dan ditutup coverl glas akan terlihat gerakan-gerakan_ individual spermatozoa. Pada umumnya yang terbaik adalah pergerakan progresif atau gerakan maju kedepan. Gerakan berayun atau berputar ditempat biasanya terjadi pada semen yang tua. Jika semen tidak bergerak maka dianggap mati ( Feradis, 2010.) pengamaan gerakan individu dibagi menjadi 3, yaitu: a. Motil progresif b. Motil non-progresif c. Immotil 3. Morfologi spermatozoa Menurut (Hardijanto dkk, 2010) pengamatan morfologi abnormaltas primer atau keala terlampau besar (macrocephalic), kepala terlampau pendek (microcephalic), kepala pendek melebar, pipih memanjang, piriformis, kepala rangkap, ekor berganda, bagian melipat, membengkok, membesar, bertaut abaxial pada pangkal kepala, ekor melingkar, putus terbelah. Abnormalitas skunder termasuk ekor yang putus, kepala tanpa ekor, bagian tengah yang melipat, adanya butiran protoplasma proksimal atau distal dan akrosom terlepas. Pengamatan morfologi terbagi menjadi 3, yaitu: ‘a. Spermatozoa normal b. Spermatozoa abnormal kepala: abnormal primer c. Spermatozoa abnormal badan/ekor: abnormal sekunder 4. Viabilitas spermatozoa: Menurut (Bansal dan Bilaspuri,2008) semen segar atau semen perlakuan diteteskan pada gelas objek menggunakan Eosin 3%. Campuran semen dan Eosin 3% dibuat olesan dengan ujung gelas objek yang lain hingga didapatkan olesan tipis di sepanjang gelas objek. Preparat ulas dikeringkan kemudian diamatidengan mikroskop cahaya dengan pembesaran (10x45). Spermatozoa yang masih hidup tidak berwarna sedangkan spermatozoa yang mati berwarna merah. Pengamatan viabilitas dibagi a. persentase spermatozoa hidup dan b. spermatozoa mati 3.4 Definisi Operasional dan Cara Pengukuran Variabel 1. Kualitas semen/sperma segar/ejakulat. Data kualitas sperma segar diambil sebagai data awal untuk menentukan layak atau tidaknya sperma segar dianalisis lanjut. Sperma segar yang dinilai normal saja yang diberi perlakuan. Penilaian kualitas sperma dilakukan secara makroskopis, meliputi: a). Volume, diukur sesaat setelah penampungan sperma (metode: vagina buatan) yaitu membaca pada skala tabung penampungan atas sejumlah sperma yang tertampung. (Volume normal : + Iml; Havez dan Hafez, 2000).b). Warna, penilaiannya melalui pengamatan langsung pada sperma yang ditampung; wana sperma yang baik adalah krem susu. (Hafez dan Hafez, 2000). ). Bau, yakni dengan cara mendekatkan mulut tabung penampung yang yang berisi sperma pada hidung. d). Kekentalan, penilaiannya dengan cara melihat gelombang atau gerakan masa spermatozoa di atas objek gelas. ). pH, diukur dengan menggunakan kertas lakmus atau dengan pH meter. 2. Kualitas spermatozoa. Data parameter kualitas spermatozoa dianalisis secara mikroskopis, sebelum dan sesudah diberi perlakuan. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan kepastian dari pengaruh perlakuan. Parameter kualitas spermatozoa yang akan diukur, adalah: a). Konsentrasi. Konsentrasi adalah jumlah spermatozoa per ml sperma (ejakulat). Penilaiannya adalah dengan metode perhitungan secara langsung memakai Hemocytometer “improved” Neubauer dan atau dengan menggunakan ectrophotometer. 8. Motilitas atau daya gerak spermatozoa digunakan sebagai ukuran kesanggupan spermatozoa untuk membuahi sel telur. Penilaian motilitas, menggunakan mikroskop cahaya biasa, Kemudian diklasifikasikan ke dalam: a = Spermatozoa dengan gerakan maju lurus (progresif) Spermatozoa, tidak bergerak maju (non progresif) Spermatozoa, tidak bergerak (immotil) Total ke tiga kategori = 100 % ©). Morfologi. Morfologi adalah merupakan ukuran dari suatu bentuk spermatozoa normal atau abnormal. Perhitungannya didasarkan pada pemeriksaan sekitar 200 - 1000 sel spermatozoa, kemudian dikategorikan berdasarkan: a = Spermatozoa normal b = Kelainan badan atau leher e = Kelainan ekor “Total ke tiga kategori=100% = =————~S 3. Uji vitalitas spermatozoa (hari) Vitalitas Spermatozoa digambarkan dalam proporsi spermatozoa “hidup’ yang tidak terpulas atau kapasitas osmoregulasi di bawah kondisi hipoosmotik. Teknik Apusan Spermatozoa Hidup: Spermatozoa hidup ditentukan dengan menggunakan teknik pulasan yang berdasarkan prinsip bahwa sel mati dengan membran plasma rusak akan dimasuki zat warna, Tatacara: (i) Satu tetes sperma segar (10 — 15 pil) dicampurkan dengan satu tetes larutan Eosin 0,5% (5 g/l) pada kaca objek kemudian tutup dengan kkaca penutup (ii) Setelah 1 —2 menit amati siapkan melalui mikroskop biasa ataumikroskop beda fase dengan pembesaran 400 X. ii) Cacah spermatozoa yang tidak terwarnai (hidup) dan yang terwarnai (mati), sebanyak 100 sel. Cara ini juga merupakan suatu uji ketelitian penilaian motilitas karena persentase sel mati tidak boleh melebihi persentase spermatozoa immotil (WHO, 1992). 3.5 Tahapan Penelitian Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 5 ulangan. Adapun perlakuan yang adakan dicobakan adalah sebagai berkut: 3.5.1 PerlakuanMengenai perlakuan yang akan peneliti analisis adalah sebagai berikut: PO: Semen Segar + Tris-Sitrat + Glukosa 0% + Sodium Bicarbonat 0% P1: Semen Segar + Tris-Sitrat + Glukosa 0,5% + Sodium Bicarbonat 0,1% P2: Semen Segar + Tris-Sitrat + Glukosa 1,0% + Sodium Bicarbonat 0,1% P3: Semen Segar + Tris-Sitrat + Glukosa 1,5% + Sodium Bicarbonat 0.1% Bentuk umum model linier aditif dari Rancangan Acak Lengkap (RAL) Penelitian ini didesain menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 5 ulangan dengan jangka waktu I minggu. Yjept +465 Keterangan; Y; : Nilai pengamatan perlakuan ke-1 ulangan ke-j y : Rataan Umum pengaruh perlakuan i €; : Pengarub galat percobaan pada perlakuan ke-I dan perlakuan ke-j Adapun ulangan diatas jumlah pengamatan berdasarkan jumlah sampel semen, yang diamati diperoleh dari 5x penampungan 3.5.3. Tahapan penelitian Penelitian yang direncanakan merupakan experimental design dengan pra post test analysis, Tahapan penelitian yang sekaligus menunjukan perlakuannya dapat dilhiat pada gambar berkut. 3.6 Analisis Data Data kualitas spermatozoa, menggunakan analisis of varians(Anova) satu arah. Apabila terdapat pengaruh yang nyata (P<0,5) atau sangat nyata (P<0,01), dilanjutkan dengan uji Barf, Data nilai sperma segar sebelum perlakuan, dianalisis dengan statistic deskriptit (Steel dan Tortie, 1991). DAFTAR PUSTAKA Bansal, A.K. and G.S. Bilaspuri. 2008. Effect Of Manganese on Bovine sperm molity, Viability, and lipid peroxidation in vitro. Anim. Reprod. 5(3):90-96 Djanuar. 1985. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan Pada Sapi. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Feradis. 2010. Bioteknologi Reproduksi pada Ternak. Alfabeta. Bandung Hafez, E.S.E. 2000. Semen Evoluation. In Reproduction In Farm Animals. 7th ed, Lea and Febiger, Pholadelphia Hardijanto, T. Sardjito, T. Hernawati, S. Sulsilowat dan T.W. Suprayogi. 2010. Buku Ajar Inseminasi Buatan. Airlangga University Press. Surabaya Solihati N dan Kune P. 2009. Pengaruh Jenis Pengencer Terhadap Motilitas dan Daya Tahan Hidup Spermatozoa Semen Cair Sapi Simental. Makalah. Disampaikan Pada Seminar Steinbach J, Foot RH. 1967 Osmotic pressure and pH effects on survival of frozen or liquid spermatozoa. J Dairy Sci. 50:205 Strasinger KS, Lorenzo SM. 2014. Urinalysis and Body Fluid, 6" Ebition. Ward MM. Editor. Untet State: FA Davis Company. 204-13p WHO, 1992. Laboratory Manual for the Examination of Human sperma and sperm-Cervical ‘Mucus Interaction. Third Ed., WHO Puld. Cambridge University Press