A

PRAKTIKUM BIOKIMIA & BIOLOGI MOLEKULER, Laboratorium Biologi Farmasi

AMPLIFIKASI DNA DENGAN

METODE PCR
CAPAIAN PEMBELAJARAN PRAKTIKUM
 Menjelaskan dan memahami metode Polymerase Chain Reaction
(PCR) dan elektroforesis
 Melakukan amplifikasi DNA dengan metode PCR
 Melakukan visualisasi hasil PCR dengan metode elektroforesis
 Menganalisis dan mengevaluasi hasil elektroforesis

Kasus:
Anda adalah seorang apoteker yang bekerja di bagian Quality Control (QC)
industri herbal PT Herbagene yang akan melakukan pemeriksaan autentikasi
bahan baku herbal X yang akan digunakan dalam produksi sediaan Obat Herbal
Terstandar. Karakteristik herbal X tidak menunjukkan spesifitas pada hasil
pengujian morfologi, anatomi maupun kandungan kimia sehingga perlu
dilakukan pengujian karakterisasi DNA. Hasil isolasi DNA menunjukkan
kualitas yang murni (A260/A280= 1,85) dengan konsentrasi 100 μg/ml,
sehingga dapat dilakukan amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction
(PCR). Hasil PCR divisualisasi dengan metode elektroforesis.

Instruksi Praktikan:
1. Buatlah skema kerja amplifikasi DNA dengan PCR dan visualisasi hasil PCR
dengan elektroforesis.
2. Berapa melting temperature (Tm) untuk setiap jenis primer pada PCR?
3. Berapa ukuran fragmen DNA hasil PCR?
4. Ambillah kesimpulan dan berikan rekomendasi apakah metode PCR
berhasil mengamplifikasi fragmen DNA yang diinginkan.

Praktikum minggu ke-11, Amplifikasi DNA dengan PCR, FF Universitas Surabaya

 LEMBAR HASIL PENGUJIAN

Kondisi Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Komposisi metode A:
Reaksi PCR (total volume 25 μl) menggunakan 1x buffer PCR yang mengandung
75mM Tris, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4; 1,5 mM MgCl2; 0,01% Tween 2; masing-
masing dNTPs 0,2 mM, 10 ng//μL DNA isolat, primer forward dan reverse masing-
masing sebanyak 0,4 μM (jenis primer ada pada Tabel 1.), dan Taq DNA
polymerase 10 U/μL.

Tabel 1. Jenis Primer yang Digunakan untuk Amplifkasi DNA Herbal X

No Primer Arah Urutan Primer (5’-3’) DNA Suhu
Primer amplikon Annealing
(bp) (°C)

1 Pgi_F1 Forward GGCAGTTGGCTAATGAAAGGTTGTA 88 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

2 Pgi_SPF1 Forward TGTCGGGCAAGGCCAAAAATG 121 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

3 Panax_F1 Forward GGTGCTTTGAGTGCTGCTGA 191 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

4 Pgi_F2 Forward TGAAAGGTTGTAATAGTTT 249 48

Pgi_R1 Reverse AATGAAAAGGAATGAAAG

5 Pgi_F3 Forward ACGGTTGCTTTTCCATCATTGTGT 311 64

Panax_R1 Reverse AAGCACCGCTATGCGCGAA

Program PCR:
Amplifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan tahapan sebagai
berikut: Proses denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, proses penempelan
pada suhu annealing sesuai jenis primer pada Tabel 1. selama 20 detik, dan
proses pemanjangan pada suhu 72°C selama 30 detik. Tahap dilanjutkan dengan
final extension pada 72°C selama 5 menit.

Kondisi Elektroforesis:

2
DNA hasil amplifikasi divisualisasi dengan melakukan elektroforesis pada gel
agarosa 3% dalam buffer dengan pewarna etidium bromide (0.5 μg/ml).
Elektroforesis dilakukan pada 100 V selama 30 menit dan DNA diamati dengan
UV transilluminator. Ukuran DNA hasil PCR dibandingkan dengan
penanda/marker (ladder) untuk mengetahui panjang DNA sampel.

Gambar 1. Hasil visualisasi DNA herbal X (serbuk herbal diekstraksi dengan

pemanasan selama 30 menit) hasil PCR dengan beberapa jenis primer.
Keterangan: 1. Hasil PCR dengan primer nomor 1; 3. Hasil PCR dengan primer
nomor 2; 5. Hasil PCR dengan primer nomor 3; 7. Hasil PCR dengan primer nomor
4; 9. Hasil PCR dengan primer nomor 5. Urutan primer dan kondisi primer
merujuk pada Tabel 1. Nomor 2,4,6,8,10 adalah kontrol negatif dari sampel nomor
sebelumnya. M adalah Marker.

3
 LEMBAR KERJA
Kelompok: …
Nama NRP
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Skema Kerja Amplifikasi DNA Herbal X dengan PCR:

Rancanglah skema kerja amplifikasi DNA Herbal X dengan PCR

Perkiraan Suhu Annealing tiap Primer:

4
Tuliskan hasil perhitungan melting temperature (Tm) tiap jenis primer di Tabel 1,
berdasarkan perhitungan pada OligoAnalyzer. Sertakan screenshoot nilai TM di
salah satu pasang primer.
(https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)

Primer 1:
 Forward =
 Reverse =

Hasil Screenshoot nilai TM:

Primer 2:
 Forward =
 Reverse =

Primer 3:
 Forward =
 Reverse =

Primer 4:
 Forward =
 Reverse =

Primer 5:
 Forward =
 Reverse =

Skema Kerja Visualisasi Hasil PCR dengan Metode Elektroforesis:

5
Rancanglah skema kerja metode elektroforesis.

6
Ukuran Fragmen DNA Hasil Elektroforesis

Tuliskan ukuran pita DNA pada hasil amplifikasi dengan berbagai jenis primer
(Gambar 1.) sebagai berikut dengan menggunakan kalkulator pada
http://biotools.nubic.northwestern.edu/SizeCalc.html Sertakan screenshoot hasil
perhitungannya di setiap sampel.

Sampel 1: …… bp

Hasil Screenshoot Perhitungan:

Sampel 3: …… bp

Hasil Screenshoot Perhitungan:

Sampel 5: …… bp

Hasil Screenshoot Perhitungan:

7
Sampel 7: …… bp

Hasil Screenshoot Perhitungan:

Sampel 9: …… bp

Hasil Screenshoot Perhitungan:

Pengambilan Keputusan
Kesimpulan:
Ambillah kesimpulan apakah apakah metode PCR berhasil mengamplifikasi
fragmen DNA yang diinginkan. (Kesimpulan disertai dengan alasan)

8
Diskusi Kasus:
Bagaimana pengaruh waktu ekstraksi simplisia herbal X terhadap hasil
amplifikasi DNA dengan PCR?