TRABAJO PRACTICO DE LABORATORIO DE GENETICA

LABORATORIO N°2 Purificación de ADN

Marco Teórico
Todas las células del cuerpo humano poseen al menos una copia completa de ADN. Es
por esto que se puede obtener ADN de tejido de cualquier origen.
Generalmente es deseable que la obtención de la muestra de ADN no cause ningún tipo
de daño a la persona y que sea fácil y rápidamente obtenible. Estos requisitos se
cumplen en las muestras de sangre. Existen innumerables métodos que permiten obtener
ADN a partir de sangre entera, que difieren en la pureza y cantidad de muestra necesaria
para realizar una extracción.

La sangre se compone de varios tipos celulares. Los más importantes son los glóbulos
rojos y los glóbulos blancos. Los primeros carecen de núcleo pues lo pierden durante su
maduración, por lo tanto no poseen ADN. Los glóbulos blancos, en cambio, poseen
núcleo y por tanto ADN. Entonces para obtener ADN a partir de muestras de sangre
sólo son necesarios los leucocitos. Si bien, en un principio se purificaban primero los
glóbulos blancos para luego extraer ADN a partir de ellos, el posterior avance de la
técnica permite hoy en día extraer ADN a partir de sangre entera con la misma pureza,
sumando rapidez y sencillez.
En la mayoría de los casos después de realizar la lisis de las células (para lo cual se
suelen utilizar detergentes), estos protocolos tienen siempre un paso de purificación con
un solvente orgánico. En la mayoría de los casos se usa cloroformo o una mezcla de
cloroformo/isoamílico que permiten eliminar proteínas y restos de membranas celulares
que quedan en la interfase entre el solvente orgánico y la fase acuosa. Este paso es muy
importante para la pureza del ADN que se quiere aislar.
Otro paso común en todos los protocolos es el agregado final de sales, como acetato de
sodio, perclorato de sodio, cloruro de sodio, acetato de amonio, etc. que funcionan
como quelantes del ADN. Se necesita además la presencia de alcohol (isopropanol o
etanol 100%) que cambia la constante dieléctrica del agua permitiendo separa el ADN
de la fase acuosa.

Actividad:
Extracción de ADN a partir de sangre periférica
Se realizará extracción de ADN a partir de las tres muestras de sangre periférica
extraída por los alumnos y una del laboratorio.

Método de CTAB

Materiales y Reactivos
-Pipetas, tubos de 15ml y 1,5ml
-Buffer T10E10 ( Tris 10mM – EDTA 10mM)
-Solución de CTAB 2% (NaCl 1.4M, EDTA 20mM, Tris 100mM, β -mercaptoetanol
0.2%, CTAB 2%)
-IAC (cloroformo : isoamílico, 24:1 v/v) saturado en H2O
-Etanol al 100% (colocar en heladera antes de comenzar para enfriarlo)
-H2O miliQ

Procedimiento
1-Tomar 3ml de sangre y agregar 3ml de T10E10.
2-Agitar suavemente por inversión 10 min.
3-Centrifugar durante 10 min. a máxima velocidad (centrifuga Rolco) y descartar el
sobrenadante.
4-Se repite este paso hasta que el pellet quede muy limpio.(2 veces)
5-Agregar 3ml de una solución de CTAB 2%. Agitar enérgicamente durante 10 min.
6-Incubar 1 hora a 60°C hasta disgregación completa del pellet.
7-Purificación de ADN: agregar 1 Vol. de IAC saturado en H2O, tomar la fase de abajo
(aproximadamente 3ml), luego invertir el tubo suavemente por 5min y centrifugar 5min
a máxima velocidad. En este paso obtendremos dos fases una orgánica (abajo) y otra
acuosa (arriba) donde se encuentra el ADN.
8-Recuperar el sobrenadante (fase acuosa) trasvasarla a un tubo limpio.
9- Por último precipitar el ADN de la fase acuosa con 2 Vol. de etanol 100% frío.
10-Recuperar el ADN visible con un tip estéril y colocarlo en un tubo de 1,5ml. Dejar
secar en estufa a 37°C y resuspender en 500µ l de H2O miliQ. En caso de no obtener
ADN visible centrifugar a máxima velocidad.