Liu dkk.

Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57

Seluler & Molekuler
https://doi.org/10.1186/s11658-019-0181-x
Surat Biologi

SURAT PENELITIAN Akses terbuka

GRP78 mengatur biosintesis susu dan

perkembangbiakan epitel sapi
sel melalui jalur pensinyalan mTOR
Ying Liu 1, Xuemei Wang 2, Zhen Zhen 1, Yanbo Yu 1, Youwen Qiu 1 * dan Wensheng Xiang 1

* Korespondensi: yw12630 @ 126.

com
Abstrak
1 Laboratorium Kunci Departemen

Pendidikan Ilmu Perah, Provinsi
Heilongjiang, Cina
Daftar lengkap informasi penulis tersedia
di akhir artikel
Latar Belakang: Glukosa yang diatur protein 78 (GRP78) adalah anggota dari keluarga protein HSP70 dan
kunci pendamping retikulum endoplasma. Telah terbukti memainkan peran penting baik dalam pematangan,
pelipatan dan pengangkutan protein dan dalam selproliferasi. Namun, keterlibatannya dalam biosintesis susu
atau perkembangbiakan sel epitelial mammae primer (BMECs) sapi masih belum diketahui.

Metode: Ekspresi GRP78 dalam BMEC yang distimulasi dengan metionin, leusin, estrogen dan prolaktin ditentukan
menggunakan tes western blotting dan imunofluoresensi. Untuk mengeksplorasi fungsi GRP78 dalam BMEC,
protein diekspresikan berlebih atau dihancurkan, masing-masing menggunakan vektor ekspresi berlebih atau
campuran siRNA yang ditransfeksi ke dalam sel yang dikultur secara in vitro. Flow cytometry digunakan untuk
menganalisis proliferasi sel dan aktivitas sel. Isi laktosa dan trigliserida (TG) yang disekresikan dari BMEC yang
dirawat masing-masing diukur menggunakan alat uji laktosa dan TG. Analisis Western blotting digunakan untuk
mengukur β- kandungan kasein dan level protein dari molekul pemberi sinyal yang diketahui terlibat dalam
biosintesis susu dan proliferasi sel.

Hasil: Ekspresi berlebih GRP78 secara signifikan merangsang protein susu dan sintesis lemak susu,
meningkatkan proliferasi sel, secara positif mengatur fosforilasi target mamalia rapamycin (mTOR), dan
meningkatkan jumlah protein cyclinD1andsterol regulator element-binding protein 1c (SREBP-1c). Penurunan
GRP78 setelah transfeksi siRNA memiliki efek sebaliknya. Kami selanjutnya menemukan bahwa GRP78 terletak
di sitoplasma BMEC, dan bahwa ekspresi metionin, leusin, estrogen, dan prolaktin yang menstimulasi
menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam ekspresi protein GRP78 di BMEC.

Kesimpulan: Data ini mengungkapkan bahwa GRP78 adalah pengatur penting biosintesis susu
dan proliferasi BMEC melalui jalur pensinyalan mTOR.

Kata kunci: Cyclin D1, GRP78, Sel epitel susu sapi, mTOR, SREBP-1c

Latar Belakang

Protein 78 yang diatur oleh glukosa (GRP78, juga dikenal sebagai protein pengikat imunoglobulin BiP atau
HSPA5) adalah anggota dari keluarga protein HSP70. Ini adalah pendamping retikulum endoplasma (ER) utama
dengan berat molekul 78 kDa. Ini dapat memicu respon protein terbuka (UPR), yang disebabkan oleh stres
terkait ER [ 1 - 3 ]. GRP78 terdiri dari tiga domain: domain pengikat peptida, domain ATPase, dan C-

© Penulis. 2019 Akses terbuka Artikel ini didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0 ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tidak terbatas dalam media apa pun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan
sumbernya, memberikan tautan ke lisensi Creative Commons, dan menunjukkan apakah ada perubahan. Pengabaian Dedikasi Domain Publik Creative Commons ( http://creativecommons.org/
publicdomain / zero / 1.0 / ) berlaku untuk data yang tersedia dalam artikel ini, kecuali dinyatakan lain.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 2 dari 12

domain terminal [ 4 ], yang berisi motif retensi UGD yang umum untuk pendamping UGD.

UPR terdiri dari tiga cabang utama, yang masing-masing terdiri dari jalur yang dimediasi oleh protein kinase
R-like ER kinase (PERK), enzim yang membutuhkan inositol 1 (IRE1) dan pengaktifan faktor transkripsi 6 (ATF6)
/ cabang: protein kinase R -seperti jalur ER kinase (PERK); jalur enzim 1 yang membutuhkan inositol (IRE1); dan
jalur pengaktifan faktor transkripsi 6 (ATF6) [ 5 ]. GRP78 dikenal sebagai protein kunci untuk cross-talk di UPR [ 5 ].

Penelitian terbaru tentang mekanisme yang mengendalikan efisiensi biosintesis susu di kelenjar susu telah

mengungkapkan jalur pensinyalan seluler utama yang mengarah ke biosintesis susu. Target mamalia rapamycin (mTOR)

telah digambarkan sebagai mediator yang menentukan yang mengintegrasikan sinyal dari faktor pertumbuhan dan asam

amino untuk mengatur beberapa proses biologis yang berkaitan dengan sintesis protein susu dan proliferasi sel epitel

susu primer (BMEC) sapi [ 6 , 7 ]. Penelitian kami sebelumnya menegaskan bahwa beberapa asam amino, seperti

metionin, leusin dan lisin, dan beberapa hormon, seperti prolaktin dan estrogen, dapat secara efektif mengaktifkan

mTOR, meningkatkan sintesis protein susu di BMEC [ 8 - 10 ].

Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa fungsi mTOR sebagai hub pusat untuk mengontrol biosintesis
susu dan proliferasi BMEC [ 7 , 9 ]. Protein pengikat elemen pengatur steroid 1c (SREBP-1c) adalah faktor
transkripsi utama yang mengatur sintesis asam lemak seluler dan trigliserida di BMEC [ 11 , 12 ]. Cyclin D1 adalah
protein yang dibutuhkan untuk perkembangan dari fase G1 ke fase S dan G2 / M dari siklus sel [ 13 ]. Dalam jalur
pensinyalan yang terkait dengan biosintesis susu dan proliferasi sel, mTOR dikenal baik untuk mengatur ekspresi
SREBP-1c dan cyclin D1 [ 14 - 16 ].

Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa GRP78 mungkin mengatur jalur pensinyalan mTOR. Ini menghambat

apoptosis dengan menurunkan pengaturan penghambatan mTOR yang dimediasi AMPK [ 17 ]. Sistem gugurnya

terbukti menekan aktivasi Akt / mTOR [ 18 ]. GRP78 terkait dengan permukaan sel mungkin terkait dengan aktivasi

mTORC1 dan mTORC2 yang memberi sinyal pada sel kanker prostat [ 19 ]. Selain itu, rendahnya tingkat aktivitasnya

menyebabkan penghambatan mTORC1 yang sensitif terhadap rapamycin [ 20 GRP78 mengontrol UPR dan autophagy

untuk mengatur apoptosis sel, produksi susu selama menyusui, dan involusi kelenjar susu berikutnya [ 21 - 23 ]. Dengan

demikian, GRP78 merupakan molekul pensinyalan hulu pada jalur mTOR, namun peran fisiologis dan mekanisme

molekulernya dalam biosintesis susu masih memerlukan penelitian lebih lanjut.

Dalam studi proteomik sebelumnya (data tidak dipublikasikan), kami menemukan bahwa GRP78 menunjukkan
hubungan dengan biosintesis susu dan proliferasi BMEC. Kami berhipotesis bahwa GRP78 mungkin menanggapi
rangsangan ekstraseluler untuk mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel melalui jalur pensinyalan mTOR.
Dalam studi ini, kami menyelidiki fungsi GRP78 dalam biosintesis susu dan proliferasi sel, dan selanjutnya
mengamati ekspresi dan lokasi subseluler GRP78 di BMEC yang diobati dengan metionin, leusin, estrogen atau
prolaktin.

Bahan dan metode

Kultur dan perawatan sel primer
BMEC primer diperoleh dari jaringan susu sapi Holstein pertengahan laktasi yang sehat yang dibeli di pasar di
Harbin, Cina. Sel dikultur dan dimurnikan sebagai
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 3 dari 12

dilaporkan sebelumnya [ 24 , 25 ]. Kemurnian sel dievaluasi dengan mengamati morfologi mikroskopis dan
fluoresensi imun dari ekspresi cytokeratin 18 (CK18) di dalam sel, seperti yang dilaporkan sebelumnya [ 24 ]. Sel
biasanya dibiakkan dalam botol kultur yang berisi Dulbecco ' s dimodifikasi Eagle ' s medium (DMEM) dan Ham ' s
F-12 dalam campuran 1: 1 (medium DF-12; SH30023.01B; HyClone, Thermo Fisher Scientific) dengan 15%
serum janin sapi (FBS) dan 1% streptomisin dan penisilin. Budaya

kondisinya 37 ° C dalam suasana lembab yang mengandung 5% (v / v) CO 2. Untuk menyelidiki efek stimulasi
metionin, leusin, estrogen atau prolaktin pada GRP78
ekspresi protein, sel diinkubasi dalam enam piring berisi media DF-12 tanpa FBS dan diperlakukan dengan
metionin (0,6 mM), leusin (0,6 mM), estrogen (27,2 ng / ml), atau prolaktin (50 μ g / ml) selama 24 jam [ 16 ].
Setelah perawatan, sel dan supernatan dikumpulkan secara terpisah untuk dideteksi.

Immunofluorescence untuk mendeteksi ekspresi GRP78

Sel dibiakkan pada slip penutup di piring 6-sumur selama 2 hari untuk pewarnaan fluoresensi kekebalan. Kemudian,

difiksasi dalam 4% paraformaldehyde selama 30 menit dan dicuci dua kali dalam Tris-buffered saline (TBS). Untuk

mencegah pengikatan protein non-spesifik, sel yang dirawat diinkubasi dengan 5% BSA pada 37 ° C. Setelah dua kali

pencucian dengan TBS, sel dirawat dengan

0,2% Triton X-100 selama 30 menit dan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C dengan antibodi primer
yang menargetkan CK18 (1: 200, 10.830 - 1-AP, Proteintech) atau GRP78 (1: 200, 11.587 - 1AP, Proteintech).
Selanjutnya, sel dicuci dua kali dengan TBS dan diinkubasi dengan antibodi anti-kelinci IgM / AlexaFluor 488
(bs-0369M-AF488; BIOSS) atau antibodi IgG / AlexaFluor 647 anti-tikus kambing (bs-0296G-AF647; BIOSS) di 37
° C selama 30 menit. Sel-sel tersebut kemudian dicuci dua kali di TBS dan dicelup menggunakan DAPI (28718 - 90-3,
Sigma Aldrich) selama 15 menit. Gambar sel yang diwarnai ditangkap dengan sistem GE DeltaVision OMX SR.
Untuk analisis kuantitatif gambar, AIOD (kepadatan optik antar-parut area) GRP78 per sel dihitung menggunakan
ImageJ. Sepuluh sel dianalisis untuk setiap sampel.

Konstruksi vektor dan transfeksi

Itu Bostaurus Urutan DNA pengkodean GRP78 / HSPA5 (CDS; NM_001075148.1) diamplifikasi di Beijing
Genomics Institute dan diklon ke dalam vektor apcDNA3.1 (Addgene, 52.535, Biovector). Menggunakan
Lipofectamine 3000 (L3000 - 015; Thermo Fisher Scientific), plasmid ditransfeksi menjadi BMEC menurut
produsennya ' s instruksi. Sel yang ditransfeksi dengan vektor kosong berfungsi sebagai kontrol negatif. Sel
dikumpulkan 48 jam setelah transfeksi dan digunakan untuk percobaan selanjutnya.

transfeksi siRNA
AGRP78 siRNA pool dengan tiga siRNA yang menargetkan bagian yang berbeda dari GRP78

Urutan mRNA dibuat dan diproduksi oleh GenePharma. Scramble siRNA oligonukleotida, yang berfungsi sebagai
kontrol negatif (siRNA-NC), diproduksi oleh GenePharma. Mereka dirancang untuk tidak memiliki homologi
dengan gen sapi manapun. Urutannya adalah: si-GRP78 - 1, 5 ′ - GGGAAAGAAGGUUACUCAUTT-3 ′; si-GRP78 - 2,
5 ′ - AUCCAUUGAUAAUGGUGUCUUTT-3 ′; si-GRP78 - 3, 5 ′ - GCGCAUCGACACAA GAAAUTT-3 ′; dan siRNA-NC
UUGUACUACACAAAAGUACUG.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 4 dari 12

Menggunakan Lipofectamine 3000, sel-sel ditransfeksi dengan kolam GRP78 siRNA atau siRNA-NC menurut
produsen. ' protokol. Efisiensi transfeksi dengan kolam siRNA ini diverifikasi melalui analisis western blotting dari
ekspresi GRP78. Pada 24 jam pasca perawatan, sel dikumpulkan untuk dideteksi.

Blotting Barat
Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 24 ]. Secara singkat, sel dibilas dalam larutan saline

buffer fosfat dingin (PBS) dan dilisis dengan buffer lisis (Beyotime) pada suhu 4 ° C. Setelah sentrifugasi, 30- μ Sampel

protein g dikenakan SDS-PAGE, dipindahkan ke membran nitroselulosa, diblokir menggunakan susu skim 5% yang

dilarutkan dalam TBST, dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 ° C. Membran dibersihkan

dengan TBST, kemudian diinkubasi dengan IgG anti kelinci terkonjugasi peroksidase lobak (ZSGBBio) selama 1 jam

pada suhu 37 ° C. Substrat chemiluminescence (ECL) yang ditingkatkan (Sage Brightness) digunakan untuk

mendeteksi peroksidase lobak. Antibodi utama adalah: GRP78 (1:

500, 11.587 - 1-AP; Proteintech), mTOR (1: 500, ab2833; Abcam), p-mTOR (Ser2448; 1:
1000, # 2971; Teknologi Persinyalan Sel), SREBP-1c (1: 500, 14.088 - 1-AP; Proteintech), cyclin D1 (1: 500,
60,186 - 1-Ig; Proteintech), β- casein (1: 1000, bs-0813R; BIOSS), dan
β- aktin (1: 1000, M1501; HaiGene).

Pengukuran dari β- tingkat kasein, laktosa dan trigliserid

Tingkat β- kasein proteinin BMEC ditentukan melalui analisis western blotting. Jumlah trigliserida dan laktosa
yang disekresikan ke dalam media kultur oleh BMEC masing-masing dideteksi menggunakan TG GPO-POD
Assay Kit (ApplygenTech) dan Lactose Assay Kit (Megazyme), menurut pabrikan ' protokol.

Analisis nomor sel dan perkembangan siklus sel

Nomor sel secara otomatis dihitung menggunakan penghitung sel otomatis (Model DT CASY, Scharfe System

GmbH) menurut produsen ' protokol dan laporan kami sebelumnya [ 24 ]. Perkembangan siklus sel ditentukan dengan

menggunakan metode yang dijelaskan dalam laporan kami sebelumnya [ 16 ]. Secara singkat, sel dicuci dengan

PBS dingin, ditripsinisasi, dan dikumpulkan dengan sentrifugasi. Kemudian, sel difiksasi dengan etanol 75% dingin

pada suhu 4 ° C semalaman, dicuci 3 kali dengan PBS, kemudian disuspensikan kembali dalam PBS yang

mengandung 5 μ g / ml propidium iodida (Pharmingen) dan 0.1mg / ml RNase A. Terakhir, BMEC diinkubasi selama

15 menit dalam gelap pada suhu kamar dan kemudian dianalisis sitometri viaflow menggunakan sistem Guava

EasyCyte HT (Merck Millipore). Proporsi (%) sel pada setiap fase siklus sel dihitung berdasarkan hasil flow

cytometry.

Analisis statistik
Data percobaan disajikan sebagai alat ± kesalahan standar untuk setiap kelompok dari tiga percobaan
independen. Analisis statistik dilakukan dengan mendidik siswa ' Uji pertama atau ANOVA satu arah dengan
perangkat lunak Prism 5 (SPSS, Inc.). Tukey ' Tes post hoc digunakan untuk menganalisis perbedaan antara
rata-rata kelompok individu. Nilai p < 0,05 atau p < 0,01 dianggap signifikan secara statistik.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 5 dari 12

Hasil
GRP78 terlibat dalam biosintesis susu dan proliferasi sel
Dalam penelitian ini, BMEC berhasil dimurnikan dari kelenjar susu sapi perah dan diidentifikasi berdasarkan

morfologi mikroskopis dan imunofluoresensi. Fibroblas campuran yang mengandung serat panjang dikeluarkan dari

pencernaan viatrypsin. Sel-sel yang dimurnikan pada dasarnya menunjukkan morfologi sel bulat atau oval yang

sama (Gbr. 1 Sebuah). Kemurniannya diverifikasi menggunakan observasi imunofluoresensi. Hampir semua sel di

bidang penglihatan menunjukkan pewarnaan positif yang kuat untuk CK18 (Gbr. 1 b), mengkonfirmasikan bahwa sel

yang dimurnikan dari kelenjar susu adalah sel epitel.

Untuk menunjukkan bahwa GRP78 dikaitkan dengan biosintesis susu dan proliferasi sel, kami menyelidiki apakah

ekspresi GRP78 berubah sebagai respons terhadap rangsangan ekstraseluler. Hasil imunofluoresensi menunjukkan

bahwa GRP78 terlokalisasi pada sitoplasma, dan itu

Gambar 1 Asam amino dan hormon tertentu memicu ekspresi GRP78. Sebuah Morfologi mikroskopis dari sel yang dimurnikan. Bilah skala: 75 μ
m. b Deteksi CK18 di BMEC. CK18 (hijau), DAPI (biru), bilah skala: 25 μ m. c
Lokalisasi subseluler GRP78 dalam sel yang dirawat dengan asam amino esensial Met dan Leu dan hormon estrogen ( e) atau prolaktin
(PRL). Nuklei (biru), GRP78 (merah), batang skala: 10 μ m. d AIOD dari ekspresi GRP78 per sel dari ( b) dianalisis menggunakan ImageJ.
Sepuluh sel dianalisis per sampel. AIOD dari kontrol ditetapkan 1,00 untuk kejelasan. e Tingkat protein GRP78 dan β- kasein dalam sel
ditentukan menggunakan western blotting setelah perawatan dengan metionin (Met), leusin (Leu), estrogen ( e) atau prolaktin (PRL); β- aktin
berfungsi sebagai kontrol pemuatan. f Perubahan lipatan relatif pada tingkat protein GRP78 (protein / β- aktin) di ( e) diukur dengan
pemindaian grayscale. Data mewakili sarana ± SE dari tiga percobaan independen. Nilai dengan huruf kecil superskrip berbeda
menunjukkan perbedaan yang signifikan ( p < 0,05)
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 6 dari 12

asam amino metionin, leusin, estrogen atau prolaktin merangsang peningkatan ekspresinya (Gbr. 1 c dan d).

Untuk menentukan efek kuantitatif dari rangsangan ini pada ekspresi GRP78, kami menggunakan western blotting

untuk mengukur jumlah GRP78 dan β- protein kasein setelah perawatan. Itu β- kandungan protein kasein meningkat

secara signifikan (Gbr. 1 e), menunjukkan efek regulasi dari rangsangan, yang konsisten dengan penelitian kami

sebelumnya [ 14 ]. Kami menemukan bahwa kadar protein GRP78 meningkat secara signifikan pada stimulasi hormon

(estrogen atau prolaktin), sedangkan asam amino (metionin dan leusin) memiliki efek yang lebih lemah (Gambar. 1 e

dan f). Data ini mengungkapkan bahwa GRP78 diatur oleh rangsangan ekstraseluler, seperti hormon dan asam amino,

yang menunjukkan bahwa GRP78 mungkin terlibat dalam biosintesis susu yang distimulasi oleh asam amino atau

hormon dan proliferasi sel.

Knockdown GRP78 menurunkan biosintesis susu dan proliferasi sel

Untuk menyelidiki apakah GRP78 memainkan peran pengaturan dalam biosintesis susu dan proliferasi sel, kami

merobohkan GRP78 dengan mentransfeksi sel dengan siRNA yang menargetkan GRP78. Jumlah GRP78 turun ~

70% pada kelompok transfeksi siRNA, seperti yang ditunjukkan dalam analisis western blotting (Gambar. 2 a dan b).

Knockdown GRP78 secara signifikan menurunkan β- tingkat kasein (Gbr. 2 a dan c), tingkat trigliserida (Gbr. 2 d) dan

tingkat sekresi laktosa (Gbr. 2 e) di dalam sel, dibandingkan dengan kelompok siRNA NC. Knockdown GRP78

secara nyata menurunkan jumlah sel (Gbr. 2 f) dan persentase sel dalam fase S dan G2 / M, sementara secara

signifikan meningkatkan persentase sel dalam fase G1 (Gbr. 2 g dan h). Hasil ini menunjukkan bahwa GRP78

secara positif mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel.

Ekspresi berlebih GRP78 meningkatkan biosintesis susu dan proliferasi sel

Untuk membuktikan lebih lanjut bahwa GRP78 secara positif mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel, kami

membuat vektor pcDNA3.1-GRP78 dan mentransfeksikannya ke dalam sel yang dikultur. Hal ini menyebabkan

peningkatan yang signifikan dalam jumlah protein GRP78 (Gbr. 3 a dan b). Lebih dari ekspresi GRP78 secara

signifikan meningkatkan β- tingkat kasein (Gbr. 3 a dan c), tingkat trigliserida (Gbr. 3 d) dan tingkat sekresi laktosa (Gbr. 3

e) dibandingkan dengan kelompok vektor kosong. Ini juga secara nyata meningkatkan jumlah sel (Gbr. 3 f) dan

persentase sel dalam fase S dan G2 / M, sementara secara signifikan menurunkan persentase sel dalam fase G1

(Gbr. 3 g dan h). Hasil ini memberikan bukti lebih lanjut bahwa GRP78 merupakan regulator positif biosintesis susu

dan proliferasi sel.

GRP78 secara positif mengatur pensinyalan mTOR

Untuk menyelidiki mekanisme di mana GRP78 mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel, itu diekspresikan
atau dihancurkan dalam sel untuk mengungkapkan dampaknya pada ekspresi molekul pensinyalan yang
bertanggung jawab untuk biosintesis susu dan proliferasi sel. GRP78 over ekspresi dan knockdown dalam sel
dikonfirmasi dan ekspresi molekul pensinyalan ditentukan menggunakan analisis western blotting (Gbr. 4 a dan b).
Ekspresi berlebihan GRP78 secara signifikan meningkatkan regulasi tingkat protein p-mTOR, cyclin D1 dan
SREBP-1c dibandingkan dengan kelompok vektor kosong (Gbr. 4 a dan c). Knockdown GRP78 melalui transfeksi
siRNA memiliki efek berlawanan (Gbr. 4 a dan d). Tingkat ekspresi mTOR tidak berubah dalam sel setelah GRP78
diekspresikan atau dirobohkan,
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 7 dari 12

Gambar 2 RNAi dari GRP78 menekan biosintesis susu dan proliferasi sel. Sebuah Analisis Western blotting GRP78 dan β- kasein di BMEC
yang ditransfeksi dengan siRNA yang menargetkan GRP78. Sel yang ditransfeksi dengan scramble siRNA digunakan sebagai kontrol negatif
(siRNA-NC). b dan c Perubahan lipat relatif dalam tingkat protein (protein / β- aktin) dari GRP78 ( b) dan β- kasein ( c) ditentukan melalui western
blotting dan dihitung menggunakan pemindaian grayscale. d Kandungan Trigliserida (TG) dalam media kultur. e Isi laktosa dalam media
kultur. f Nomor sel diukur menggunakan penghitung sel. g, h dan saya Transisi siklus sel diukur ( g) dan dianalisis ( h dan saya) melalui aliran
sitometri. Data mewakili sarana ± SE dari tiga percobaan independen. * p < 0,05; ** p < 0,01

menyarankan keseimbangan antara mTOR dan bentuk fosforilasi dalam sel, yang konsisten dengan hasil penelitian

kami sebelumnya [ 8 - 10 ]. Hasil ini mengungkapkan bahwa GRP78 secara positif mengatur biosintesis susu dan

proliferasi sel melalui jalur pensinyalan mTOR atau SREBP-1c atau cyclin D1.

Diskusi
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memastikan pentingnya GRP78 dalam biosintesis susu dan dalam
proliferasi BMEC. mTOR, cyclin D1 dan SREBP-1c semuanya merupakan molekul pemberi sinyal penting untuk
biosintesis susu dan proliferasi sel, dengan mTOR bertindak sebagai hub pusat. Peningkatan ekspresi GRP78
terbukti meningkatkan kadar p-mTOR, cyclin D1 dan SREBP-1c, sehingga meningkatkan biosintesis komponen
susu dan proliferasi BMEC. Sepengetahuan kami, ini adalah laporan pertama GRP78 terlibat dalam biosintesis
susu dan proliferasi sel melalui jalur pensinyalan mTOR.

Beberapa hormon (termasuk estrogen dan prolaktin) dapat merangsang perkembangan kelenjar susu dan
biosintesis susu [ 26 ]. Melalui reseptor estrogen α ( UGD α), estrogen dapat memicu aktivasi UPR yang cepat,
sehingga meningkatkan ekspresi GRP78 [ 27 - 29 ]. Protein GRP78 sebelumnya terbukti diregulasi dalam
pengobatan prolaktin
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 8 dari 12

Gambar 3 Ekspresi GRP78 yang berlebihan mendorong biosintesis susu dan proliferasi sel. Sebuah Analisis Western blot GRP78 dan β- kasein
dalam BMEC yang ditransfeksi dengan vektor pcDNA3.1-GRP78. Sel yang ditransfeksi dengan vektor kosong (pcDNA3.1) digunakan
sebagai kontrol negatif. b dan c Perubahan lipat relatif dari tingkat protein (protein / β- aktin) dari GRP78 ( b) dan β- kasein ( c) ditentukan
melalui western blotting dan dihitung menggunakan pemindaian grayscale. d Kandungan Trigliserida (TG) dalam media kultur. e Isi laktosa
dalam media kultur. f Nomor sel diukur menggunakan penghitung sel. g, h dan saya Transisi siklus sel diukur ( g) dan dianalisis ( h dan saya)
melalui aliran sitometri. Data mewakili sarana ± SE dari tiga percobaan independen. * p < 0,05; ** p < 0,01

MEC mouse [ 23 ]. Data kami konsisten dengan laporan sebelumnya, juga menunjukkan bahwa estrogen dan
prolaktin secara positif mempengaruhi ekspresi GRP78.
Mekanisme molekuler di mana hormon menstimulasi ekspresi GRP78 sebagian besar masih belum diketahui.

Penelitian sebelumnya telah menemukan bahwa estrogen memicu ekspresi GRP78 melalui pensinyalan

phosphoinositide 3-kinase (PI3K) [ 30 ]. Yang lain telah mengamati bahwa GRP78 permukaan-sel adalah reseptor

multi-fungsi yang dapat membentuk kompleks dengan PI3K sebagai pengatur jalur pensinyalan PI3K / Akt untuk

menjalankan fungsinya [ 19 ]. Bagaimana PI3K terlibat dalam ekspresi dan fungsi GRP78 yang distimulasi hormon

memerlukan penelitian lebih lanjut.

Asam amino berfungsi tidak hanya sebagai komponen untuk sintesis protein, tetapi juga sebagai molekul
pemberi sinyal yang mengatur biosintesis susu melalui aktivasi jalur pensinyalan mTOR [ 31 , 32 ]. Kami
mengamati bahwa ekspresi GRP78 meningkat setelah stimulasi metionin dan leusin, meskipun efeknya jauh
lebih kecil daripada efek estrogen dan prolaktin.

Saat ini tidak jelas bagaimana asam amino merangsang ekspresi GRP78. Laporan sebelumnya telah
menunjukkan bahwa asam amino mengaktifkan jalur pensinyalan mTOR melalui ekspresi reseptor berpasangan
protein G (GPCR) dan PI3K tertentu [ 33 , 34 ]. Temuan kami mendukung hipotesis bahwa asam amino mungkin
mengatur ekspresi GRP78 melalui pensinyalan GPCR-PI3K.

mTOR adalah kinase penting yang mengatur berbagai fungsi sel, seperti perkembangan siklus sel, proliferasi
sel, dan sintesis protein dan lemak [ 35 , 36 ]. mTOR mengatur
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 9 dari 12

Gambar 4 GRP78 adalah pengatur positif dari jalur pensinyalan mTOR. Sebuah BMEC ditransfeksi dengan vektor pcDNA3.1-GRP78 atau GRP78siRNA.
Sel yang ditransfeksi dengan vektor kosong (pcDNA3.1) atau siRNA berebut digunakan sebagai kontrol negatif. Kadar protein yang ditunjukkan dideteksi
menggunakan analisis western blotting. β- aktin berfungsi sebagai kontrol pemuatan. b Perubahan lipat relatif pada tingkat protein GRP78 (protein / β- aktin) di
( Sebuah) diukur menggunakan pemindaian grayscale. c dan d Perubahan lipat relatif dari tingkat protein yang ditunjukkan (protein / β- aktin) diukur
menggunakan pemindaian skala abu-abu setelah ekspresi berlebih ( c) atau membungkam ( d) dari GRP78

banyak target hilir, termasuk S6K1, 4EBP1, SREBP-1c dan cyclin D1, untuk mengaktifkan biosintesis susu dan

proliferasi sel [ 37 , 38 ]. Studi fungsi gen kami menunjukkan bahwa GRP78 dapat secara positif mengatur molekul

pensinyalan seperti mTOR, cyclin D1 dan SREBP-1c. Namun, mekanisme molekuler di mana GRP78 mengatur

pensinyalan mTOR masih belum diketahui. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menemukan bahwa asam

amino dan hormon dapat merangsang pensinyalan mTOR melalui NF- κ Aktivasi B1 [ 26 ]. Apakah GRP78

mengaktifkan pensinyalan mTOR langsung di sitoplasma atau melaluiNF- κ Aktivasi transkripsional yang dimediasi B1

membutuhkan studi lebih lanjut.

Menarik bahwa GRP78, yang dapat memicu UPR, dapat secara positif mengatur sintesis komponen susu,
proliferasi sel dan jalur pensinyalan yang sesuai. Peran dan mekanisme molekuler yang mendasari UPR dalam
ekspresi GRP78 yang dirangsang oleh asam amino dan hormon serta pensinyalan mTOR yang distimulasi
GRP78 dan homeostasis sel masih belum diketahui. Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa UPR dan
GRP78 dapat diinduksi oleh X-box binding protein 1 (XBP1) dan ATF6 [ 39 , 40 ], dan bahwa GRP78 dapat
membersihkan protein pemicu stres yang tidak terlipat untuk memulihkan homeostasis ER dan faktor inisiasi
eukariotik2 α ( eIF2 α) ekspresi dan sintesis protein [ 41 , 42 ]. Jadi, kami berspekulasi bahwa asam amino dan
hormon tertentu, termasuk yang diuji, mungkin merangsang ekspresi GRP78 melalui aktivasi XBP1 dan ATF6,
dan bahwa GRP78 mungkin berfungsi melalui UPR dan eIF2. α ekspresi. Laporan sebelumnya juga menunjukkan
bahwa mTOR dapat menghambat ekspresi GRP78 [ 43 , 44 ], menunjukkan bahwa hubungan antara GRP78 dan
mTOR mungkin dua arah daripada lurus.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 10 dari 12

Kesimpulan
Hasil kami menunjukkan bahwa GRP78 adalah pengatur positif utama biosintesis susu dan proliferasi BMEC. Itu

ditemukan untuk menanggapi rangsangan ekstraseluler, seperti asam amino dan hormon, dan untuk mengaktifkan

pensinyalan mTOR, yang mengarah ke biosintesis susu dan peningkatan proliferasi sel. Jalur pensinyalan yang terkait

dengan ekspresi dan fungsi GRP78 membutuhkan penelitian lebih lanjut.

Singkatan
ATF6: Mengaktifkan faktor transkripsi 6; CDS: Pengodean urutan DNA; CK 18: Sitokeratin 18; DMEF: Dulbecco ' s dimodifikasi Eagle ' s media; ECL:
chemiluminescence yang ditingkatkan; ER: Retikulum endoplasma; GPCR: Reseptor berpasangan protein G; GRP78: Protein yang diatur glukosa 78; HRP:
Peroksidase lobak; IRE1: Enzim 1 yang membutuhkan inositol; MEC: sel epitel mamalia; mTOR: Target mamalia dari rapamycin; PERK: Protein kinase R-like
ER kinase; PI3K: Phosphoinositide 3kinase; SREBP-1c: Sterol regulator element-binding protein 1c; TBS: Saline dengan buffer tris; UPR: Respons protein
tidak terlipat

Ucapan Terima Kasih

Tak dapat diterapkan.

Penulis ' kontribusi

YL dan YWC menyusun dan merancang eksperimen. XMW menyumbangkan reagen, bahan, dan alat analisis. ZZ dan YBY melakukan eksperimen.
WSX menganalisis data. DCY menulis koran itu. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.

Penulis ' informasi

Tak dapat diterapkan.

Pendanaan

Studi ini didukung oleh Open Research Fund for Key Laboratory of Dairy Science dari Northeast Agricultural University (kontrak
no.klds-18-002).

Ketersediaan data dan bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini dan file informasi tambahannya.

Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi

Tak dapat diterapkan.

Persetujuan untuk publikasi

Tak dapat diterapkan.

Minat yang bersaing

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.

Detail penulis
1 Laboratorium Kunci Departemen Pendidikan Ilmu Perah, Provinsi Heilongjiang, Cina. 2 Universitas HaiNan, Provinsi Hainan, Cina.

Diterima: 4 Mei 2019 Diterima: 24 September 2019

Referensi
1. Gifford JB, Hill R. GRP78 mempengaruhi kemoresistensi dan prognosis pada Kanker. Target Obat Curr. 2018; 19 (6): 701 - 8. Chen S, Wu J, Jiao K, Wu Q, Ma J,
2. Chen D, dkk. MicroRNA-495-3p menghambat resistensi multidrug dengan memodulasi autophagy melalui sumbu GRP78 / mTOR pada kanker lambung.
Kematian Sel Dis. 2018; 9 (11): 1070.
3. Masak KL, Shajahan AN, Wärri A, Jin L, Hilakivi-ClarkeL A, Clarke R. Protein yang diatur glukosa 78 mengontrol crosstalk antara apoptosis dan
autophagy untuk menentukan respons antiestrogen. Res kanker. 2012; 72 (13): 3337 - 49.
4. King LS, Berg M, Chevalier A, Carey A, Elguindi EC, Blond SY. Isolasi, ekspresi, dan karakterisasi mutan BiP / GRP78 tidak beracun yang berfungsi penuh.
Protein Ekspr Purif. 2001; 22 (1): 148 - 58.
5. Verfaillie T, Garg AD, Agostinis P. Menargetkan stres ER diinduksi apoptosis dan dalam penyebab peradangan. Cancer Lett. 2013; 332 (2): 249 - 64.

6. Osorio JS, Lohakare J, Bionaz M. Biosintesis lemak susu, protein, dan laktosa: peran regulasi transkripsi dan pasca transkripsi.
Physiol Genomics. 2016; 48 (4): 231 - 56.
7. Zhen Z, Zhang M, Yuan X, Qu B, Yu Y, Gao X, dkk. DEAD-box helicase6 (DDX6) adalah regulator negatif baru untuk biosintesis susu dan
proliferasi sel epitel susu sapi. In Vitro Cell Dev berbagai Anim. 2018; 54 (1): 52 - 60.

8. Li X, Li P, Wang L, Zhang M, Gao X. Lisin meningkatkan stimulasi asam lemak pada sintesis lemak susu melalui pensinyalan GPRC6API3K-FABP5
dalam sel epitel susu sapi. J Agric Food Chem. 2019; 67 (25): 7005 - 15.
9. Li L, Liu L, Qu B, Li X, Gao X, Zhang M. Twinfilin1meningkatkan bio-sintesis susu dan proliferasi sel epitel susu sapi melalui jalur
pensinyalan mTOR. Biochem Biophys Res Commun. 2017; 492 (3): 289 - 94.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 11 dari 12

10. Nakajima S, Hiramatsu N, Hayakawa K, Saito Y, Kato H, Huang T, dkk. Pengikatan selektif BiP / GRP78 menumpulkan aktivasi NF- κ B melalui
cabang ATF6 dari UPR: keterlibatan C / EBP β dan defosforilasi yang bergantung pada mTOR dari Akt. Mol Sel Biol. 2011; 31 (8): 1710 - 8.

11. Li N, Zhao F, Wei C, Liang M, Zhang N, Wang C, dkk. Fungsi SREBP1 dalam sintesis lemak susu sel epitel susu sapi perah. Int J
Mol Sci. 2014; 15 (9): 16998 - 7013.
12. Ma L, Corl BA. Regulasi transkripsi sintesis lipid dalam sel epitel susu sapi oleh protein pengikat elemen pengatur sterol. J Dairy
Sci. 2012; 95 (7): 3743 - 55.
13. Baldin V, Lukas J, Marcote MJ, Pagano M, Draetta G. Cyclin D1 adalah protein inti yang diperlukan untuk perkembangan siklus sel di G1. Genes Dev. 1993; 7 (5): 812 - 21.

14. Norrmén C, Figlia G, Lebrun-Julien F, Pereira JA, Trötzmüller M, Köfeler HC, dkk. mTORC1 mengontrol mielinisasi PNS di sepanjang mTORC1-RXR γ- SREBP-lipid
biosintesis sumbu di sel Schwann. Rep. Sel 2014; 9 (2): 646 - 60. Gürke J, Schindler M, Pendzialek SM, Thieme R, Grybel KJ, Heller R, dkk.
15.
Diabetes ibu mempromosikan mTORC1 sinyal arus hilir inapbitpreimplantasi embrio. Reproduksi. 2016; 151 (5): 465 - 76. Zhang MH, Chen DY,
16. Zhen Z, Ao JX, Yuan XH, Gao XJ. AnnexinA2 secara positif mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel epitel susu sapi melalui jalur pensinyalan
mTOR. J Sel Physiol. 2018; 233 (3): 2464 - 75. Casas C. GRP78 di Pusat Perlindungan Kanker dan Saraf Stadiumin. Neurosci depan. 2017; 11:
17. 177.
18. Wey S, Luo B, Tseng CC, Ni M, Zhou H, Fu Y, dkk. Knock out GRP78 / BiP yang terinduksi dalam sistem hematopoietik menekan leukemogenesis Pten-null
dan pensinyalan onkogenik AKT. Darah. 2012; 119 (3): 817 - 25. Misra Inggris, Pizzo SV. Diaktifkan α 2-makroglobulin mengikat permukaan sel GRP78
19. menginduksi fosforilasi T-loop Akt1 oleh PDK1 dalam hubungannya dengan raptor. PLoS One. 2014; 9 (2): e88373.

20. Chae YC, Caino MC, Lisanti S, Ghosh JC, Dohi T, Danial NN, dkk. Pengendalian bioenergetika tumor dan pensinyalan stres kelangsungan hidup dengan mitokondria
HSP90s. Sel Kanker. 2012; 22 (3): 331 - 44.

21. Wärri A, Cook KL, Hu R, Jin L, Zwart A, Soto-Pantoja DR, dkk. Autophagy dan unfolded protein response (UPR) mengatur involusi kelenjar susu dengan menahan
perubahan ireversibel yang digerakkan oleh gapoptosis. Kematian Sel Dis. 2018; 4:40. Clarke R, Cook KL, Hu R, Facey CO, Tavassoly I, Schwartz JL, dkk.
22.
Tekanan retikulum endoplasma, respon protein yang tidak terlipat, autofagi, dan pengaturan sel payudara yang terintegrasi. CancerRes. 2012; 72 (6): 1321 - 31.

23. Beaton A, Wilkins RJ, Wheeler TT. Perubahan terkait laktasi dan responsif prolaktin dalam sintesis protein dalam sel susu tikus. Sel Jaringan.
1997; 29 (5): 509 - 16.
24. Ao J, Wei C, Si Y, Luo C, Lv W, Lin Y, dkk. Tudor-SN mengatur biosintesis susu dan proliferasi sel epitel susu sapi. Int J Mol Sci. 2015;
16 (12): 29936 - 47.
25. Cui Y, Liu Z, Sun X, Hou X, Qu B, Zhao F, dkk. Titik protein responsif hormon tiroid14 meningkatkan lipogenesis dalam sel epitel susu sapi. In
Vitro Cell Dev berbagai Anim. 2015; 51 (6): 586 - 94. Huang X, Zang Y, Zhang M, Yuan X, Li M, Gao X. Faktor nuklir κ B1 Isakey regulator untuk
26. aktivasi transkripsi dari biosintesis susu dalam sel epitel susu sapi. Biol Sel DNA. 2017; 36 (4): 295 - 302.

27. Park S, Zhao YC, Yoon SY, Xu JM, Liao L, Lydon J, dkk. Represor aktivitas reseptor estrogen (REA) sangat penting untuk morfo genesis kelenjar
susu dan aktivitas fungsional: studi pada tikus knockout bersyarat. Endokrinologi. 2011; 152 (1): 4336 - 49.

28. Andruska N, Zheng X, Yang X, Helferich WG, Shapiro DJ. Aktivasi estrogen antisipatif dari respons protein yang tidak terlipat terkait dengan proliferasi sel dan
kelangsungan hidup yang buruk pada reseptor estrogen α- kanker payudara positif. Onkogen. 2015; 34 (29): 3760 - 9.

29. Luvsandagva B, Nakamura K, Kitahara Y, Aoki H, Murata T, Ikeda S, dkk. GRP78 yang diinduksi oleh estrogen berperan dalam sensitivitas kemo pada kanker
endometrium. Gynecol Oncol. 2012; 126 (1): 132 - 9.

30. Su Q, Wang Y, Yang X, Li XD, Qi YF, He XJ, dkk. Penghambatan apoptosis stres retikulum endoplasma oleh estrogen melindungi sel endotel vena
umbilikalis manusia melalui PI3Kinase - Jalur pensinyalan akt. J Cell Biochem. 2017; 118 (12): 4568 - 74.

31. Li S, Hosseini A, Danes M, Jacometo C, Liu J, Loor JJ. Rasio asam amino esensial dan mTOR mempengaruhi kerja genenet lipogenik dan
ekspresi miRNA pada sel epitel susu sapi. J Anim Sci Biotechnol. 2016; 7:44.
32. Luo C, Qi H, Huang X, Li M, Zhang L, Lin Y, dkk. GlyRS adalah mediator baru biosintesis susu yang diinduksi asam amino dalam sel epitel susu
sapi. J Sel Physiol. 2019; 234 (3): 2973 - 83.
33. Rueda P, Harley E, Lu Y, Stewart GD, Fabb S, Diepenhorst N, dkk. Murine GPRC6A memediasi respons seluler terhadap asam amino-L, tetapi tidak untuk
varian osteocalcin. PLoS One. 2016; 11 (1): e0146846.

34. Conigrave AD, Hampson DR. Reseptor gabungan CG-protein kelas penginderaan asam amino spektrum luas: mekanisme molekuler, signifikansi
fisiologis, dan pilihan untuk pengembangan obat. PharmacolTher. 2010; 127 (3): 252 - 60. Gao HN, Hu H, Zheng N, Wang JQ. Leusin dan histidinein
35. secara dependen mengatur sintesis protein susu dalam sel epitel susu sapi melalui jalur pensinyalan mTOR. J Zhe jiang Univ SciB. 2015; 16 (6):
560 - 72.
36. Wagner R, Stübiger G, Veigel D, Wuczkowski M, Lanzerstorfer P, Weghuber J, dkk. Penekanan multi-level pada reseptorPI3K-mTORC1 oleh penghambat sintase
asam lemak sangat penting untuk kemanjurannya melawan sel kanker ovarium. Oncotarget. 2017; 8 (7): 11600 - 13.

37. Li S, Ogawa W, Emi A, Hayashi K, Senga Y, Nomura K, dkk. Peran S6K1 dalam regulasi ekspresi SREBP-1 di hati. Biochem Biophys Res Commun.
2011; 412 (2): 197 - 202.
38. Yecies JL, Zhang HH, Menon S, Liu S, Yecies D, Lipovsky AI, dkk. Akt menstimulasi SREBP-1c hati dan lipogenesis melalui jalur paralel
bergantung mTORC1 dan independen. Metab Sel. 2011; 14 (1): 21 - 32.
39. Shang J, Lehrman MA. Perselisihan sinyal UPR oleh ATF6 dan Ire1p-XBP1 dengan level transkrip target. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 317
(2): 390 - 6.
40. Walter F, O'Brien A, Concannon CG, Düssmann H, Prehn JHM. Sinyal stres ER sebagai faktor transkripsi pengaktif6 α
(ATF6) -tergantung "off-switch". J berbagai Chem. 2018; 293 (47): 18270 - 84.
41. Yin H, Zhao L, Jiang X, Li S, Huo H, Chen H. DEV menginduksi autophagy melalui stres retikulum endoplasma terkait respon protein terbuka.
PLoSOne. 2017; 12 (12): e0189704.
42. Xu B, Shan M, Wang F, Deng Y, Liu W, Feng S, dkk. Tekanan retikulum endoplasma menandakan keterlibatan dalam kerusakan sel saraf yang diinduksi mangan
dalam kultur irisan otak organotipik. Toxicol Lett. 2013; 222 (3): 239 - 46.
Liu dkk. Surat Biologi Seluler & Molekuler (2019) 24:57 Halaman 12 dari 12

43. Wan H, Wang Q, Chen X, Zeng Q, Shao Y, Fang H, dkk. WDR45 berkontribusi pada degenerasi tubuh melalui
regulasiERhomeostasisandneuronaldeath. Autophagy. 2019; 23: 1 - 17.
44. Yang H, Wen Y, Zhang M, Liu Q, Zhang H, Zhang J, dkk. mTORC1 mengoordinasikan pensinyalan autofagi dan apoptosis pada kondrosit artikular pada
sendi temporomandibular osteoartritik. Autophagy. 2019; 21: 1 - 18.

Penerbit ' s Catatan

Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.