TUGAS 3

MEMBUAT DEGENERATE PRIMER

Membuat degenerate primer dari protein spermidine:

1. Buka server NCBI kemudian tulis nama protein yang ingin kita buat degenerate
primernya (pada gambar dilingkaran merah). Lalu klik Search/ tekan Enter pada
keyboard untuk memulai pencarian.
2. Pilih salah satu sekuen protein yang akan kita buat degenerate primernya

1
2

3. Setelah muncul tampilan dari data-data sekuen protein yang kita pilih selanjutnya Klik
runBLAST

3
4. Selanjutnya ubah pilihan Blast dengan meng-klik Blastp kemudian BLAST

5. Didapatkan hasil sebagai berikut, yang merupakan data-data alignment dari sekuen
protein yang kita miliki. Berdasarkan data yang ada, kita dapat mengetahui :
a. Putative conserved domains
b. Color key dari skor Alignment yang memperlihatkan homologi dari sekuen kita
dengan data sekuen yang ada di database.
c. Sequence producing Signnificant Alignments, yang memperlihatkan persentase
kemiripan atau tingkat similaritas antara sekuen yang kita miliki dengan beberapa
sekuen aasam amino yang ada di data base NCBI/GenBank.
6. kemudian klik Klik Accession Number sebanyak-banyaknya (lingkaran hitam).
 5.a

5.b

5.c

7. Setelah muncul tampilan identitas dari sekuen accession yang kita pilih, selanjutnya klik
FASTA (contoh diambil dari accession number baris pertama)
 7

8. Copy sekuen protein dari tiap accession yang kita buka (minimal 8 accession) untuk di
kumpulkan dan diproses selanjutnya dengan menggunakan beberapa program berbeda.

Berikut ini 25 sekuen nukleotida yang kita pilih dari Accession number. Berdasarkan
tingkat similaritasnya yang tinggi. Kemudian dicari conserve sequence dan dipilih menjadi
forward dan reverse primer.
spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrooxidans]
>gi|497252899|ref|WP_009567116.1| spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrooxidans]
MSTELWYTERYEEHGAALSLKIREVLHREQSPYQNIEIFETEQFGTLMTLDGLVMVTDR
DNFLYHEMMSH
PALFTHPAPKRVLIIGGGDCGTLREVLRHREVEEAVQVELDERVTRVAERFFPELCENNQ
DPRARFHFTD
GITWIKEAEAGRYDVIIIDSTDPVGPAAGLFATDFYAACHHALADQGVLVAQSESPLLHA
DLIRQCQSRM
TEAGFDAVNSLYFPQFCYPSGWWSATLGRKGLAMDAFRIDAARAFTGTRYYHAAMQQ
AAQVAPAFLLP
spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270]
GenBank: ACK79548.1
>gi|218518962|gb|ACK79548.1| spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC
23270]
MTHSGNGWTGISGPPFSFARIFRRIPADTPPSPLREAVMSTELWYTERYEEHGAALSLKIR
EVLHREQSP
YQNIEIFETEQFGTLMTLDGLVMVTDRDNFLYHEMMSHPALFTHPAPKRVLIIGGGDCG
TLREVLRHREV
EEAVQVELDERVTRVAERFFPELCENNQDPRARFHFTDGITWIKEAEAGRYDVIIIDSTDP
VGPAAGLFA
TDFYAACHHALADQGVLVAQSESPLLHADLIRQCQSRMTEAGFDAVNSLYFPQFCYPS
GWWSATLGRKGL
AMDAFRIDAARAFTGTRYYHAAMQQAAQVAPAFLLP

spermidine synthase [Acidithiobacillus thiooxidans]

NCBI Reference Sequence: WP_010640600.1
>gi|498326444|ref|WP_010640600.1| spermidine synthase [Acidithiobacillus thiooxidans]
MSTELWYTERYEEHGASLSLKIREVLHREQSPYQTIEIFETEHFGTLMTLDGLVMVTDRD
NYLYHEMMSH
PALFTHPAPKRVLIIGGGDCGTLREVLRHPEVEEATQVELDERVTRVAERFFPELCEKNH
DPRAHFHFTD
GIAWIKEAPAGRYDVIIVDSTDPVGPAAGLFATDFYAACHHALAEQGVLVAQSESPLLH
ADLIRQCQSRM
AEAGFEAVNSVYFPQFCYPSGWWSGTLGRKGLSMDAFRAEDAKAFTGTHYYHAGMQ
QAAQVAPAFLLG

spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrivorans]

NCBI Reference Sequence: WP_035190728.1
>gi|737205814|ref|WP_035190728.1| spermidine synthase [Acidithiobacillus ferrivorans]
MSTELWYTERYEEHGAALSLKIREVLHREQSPYQSIEIFETEQFGTLMTLDGLVMVTDR
DNFLYHEMMSH
PALFTHPAPKRVLIIGGGDCGTLREVLRHREVEEVVQVELDERVTRVAERFFPELCENNN
DPRAHFHFTD
GIAWVTEAEAGRYDVIIVDSTDPVGPAAGLFATDFYAACHQALADQGVLVAQSESPLL
HADLIRQCQQRM
TEAGFDAVNSVYFPQFCYPSGWWSGTLGRKGLAMDAFRADEAKAFSGTHYYHAGMQ
QAAQVAPAFLLP

spermidine synthase [Acidithiobacillus caldus]

NCBI Reference Sequence: WP_014003545.1
>gi|503769469|ref|WP_014003545.1| spermidine synthase [Acidithiobacillus caldus]
MRTELWYSERYEEHGAALSLKVTGVLHREQSPYQEIEIFETEHFGTLMTLDGLVMLTDR
DNFLYHEMMSH
PALFSHPKPARVLIIGGGDCGTLREVLRHPEVERVDQVELDERVTRVAERFFPELCAKND
DPRAHFFFED
GIAWVGRAEAGSYDVIIVDSTDPVGPAAGLFSEEFYSACLRALGEPGILVAQTESPLLHA
PLIRQCQERM
GAAGFDAVNSLYFPQFCYPSGWWSATLGRRGLALDSFRRKDAEAMTGLRYYHADLHA
AAQVPPAFLLPSA

spermidine synthase [Nitrosococcus halophilus]

NCBI Reference Sequence: WP_013034273.1
>gi|502799297|ref|WP_013034273.1| spermidine synthase [Nitrosococcus halophilus]
MQLDPKTWFTEVCQEGGLAFSLAIKEKLHEETTPYQHIEIYQTEAFGRLMVIDGFIMLSE
RDNFFYHEMM
AHSALFTHPHPRRVLIIGGGDCGTLREVLKHDRVKEVRQVEIDERVTRLAEKYFPELCES
NDDPRAHFHF
GDGLRFVAEAPANSVDVIIIDSTDPIGPAEGLFQAPFYSDCRRLLGDKGVLVHQSESPLIH
LDLLNKMRA
EMKKGGFPQVRTLTYPQCVYPSGWWSATLAGDSLSSFREQEAAAKTFSTRYYNVDIHR
ASLAVPEFLR
spermidine synthase [Thermithiobacillus tepidarius]
NCBI Reference Sequence: WP_028989004.1
>gi|655940782|ref|WP_028989004.1| spermidine synthase [Thermithiobacillus tepidarius]
MSTELWYSERWEEGRSAISLKVLEVLHREQSPYQTIEIFRTESFGTLMTLDGLVMVTDR
DNFVYHEMMSH
PALFSHPDPKRVLIIGGGDCGTLREVLKHPGVRHVDMVELDERVTRVAEQFFPELCEAN
GDPRAHFHFQD
GIQWVADAPAGSYDVIIIDSTDPVGPAAGLFSAQFYGNCLRALGERGVVVGQSESPLFH
AELIRSVRARL
REAGASDVATLHFPQCTYPSGWWSATLGGKGVKLEEFRHADAAAKSFATRYYNAALH
RGALAMPEFLRD

MULTISPECIES: spermidine synthase [sulfur-oxidizing symbionts]

NCBI Reference Sequence: WP_006475176.1
>gi|493521049|ref|WP_006475176.1| MULTISPECIES: spermidine synthase [sulfur-oxidizing
symbionts]
MADNEQWFTEKCEEGGNAFGLRIKGKLHEEQSRYQKIEVYETTDWGNLMVLDGYTMV
SSLDNFLYHEMMV
HPALFIHPAPQRVAIIGGGDCGTLREVLKHPEVEQVTQIDIDERVTRVSEQFFPELCESNQ
DPRAELLFI
DGIEWMQQAKAGSLDIIIVDSTDPIGPGEVLFSADFYRACQRALADGGLMIQQSESPLIH
QLIIQRMYRN
LHDSGFSDVKSLFFPQPIYPSGWWSATLGRKGAAIEGFREQDVAQRSFETRYYNSDIHRA
AFAVPEFFRK
ILEPQS

Spermidine synthase [Acidithiobacillus caldus ATCC 51756]

>gi|640842509|gb|AIA56394.1| Spermidine synthase [Acidithiobacillus caldus ATCC 51756]
MGRLFFFRWAAHNRCRLPPRGVPMRTELWYSERYEEHGAALSLKVTGVLHREQSPYQE
IEIFETEHFGTL
MTLDGLVMLTDRDNFLYHEMMSHPALFSHPKPARVLIIGGGDCGTLREVLRHPEVERV
DQVELDERVTRV
AERFFPELCAKNDDPRAHFFFEDGIAWVGRAVAGSYDVIIVDSTDPVGPAAGLFSEEFYS
ACLRALGEPG
ILVAQTESPLLHAPLIRQCQERMGAAGFDAVNSLYFPQFCYPSGWWSATLGRRGLALDS
FRRKDAEAMTG
LRYYHADLHAAAQVPPAFLLPSA

spermidine synthase [endosymbiont of Riftia pachyptila (vent Ph05)]

>gi|344223591|gb|EGV50040.1| spermidine synthase [endosymbiont of Riftia pachyptila (vent
Ph05)]
MGGMSCQIRVVERAMADNEQWFTEKCEEGGNAFGLRIKGKLHEEQSRYQKIEVYETTD
WGNLMVLDGYTM
VSSLDNFLYHEMMVHPALFIHPAPQRVAIIGGGDCGTLREVLKHPEVEQVTQIDIDERVT
RVSEQFFPEL
CESNQDPRAELLFIDGIEWMQQAKAGSLDIIIVDSTDPIGPGEVLFSADFYRACQRALAD
GGLMIQQSES
PLIHQLIIQRMYRNLHDSGFSDVKSLFFPQPIYPSGWWSATLGRKGAAIEGFREQDVAQR
SFETRYYNSD
IHRAAFAVPEFFRKILEPQS

spermidine synthase SpeE [Methyloglobulus morosus]

>gi|558565510|ref|WP_023495662.1| spermidine synthase SpeE [Methyloglobulus morosus]
MNPSEWFTEEHAGAGSAFSLKIKRKLHEEQSPFQHHEIYETETFGNLMILDGCTMVSTR
DNFLYHEMMSH
PALYTHPNPKKVWIIGGGDCGTLREALKHPSVEEAVQIDIDERVTRLAEVYFPELCESNN
DPRADLKFID
GIKWIKDAAPNSVDIIIVDSTDPVGPAEGLFNEAFYRGCHACLTDNGILVQQSESPLLHLE
LLKDMRNAM
SAAGFTSLQTLYFPQCIYPSGWWSATMASKSALNGFREQDSANKSFATEYYNVDIHRGA
LAQPEFVKRAF
AI
spermidine synthase [Hahella chejuensis]
>gi|499719368|ref|WP_011400102.1| spermidine synthase [Hahella chejuensis]
MSEQIPGWFTEIFQDQGTGFSLKVKSKLHEEQSQYQKIEIFETETFGNLMVLDGCVMLTD
RDNFLYHEMM
THPALFTHHAPKKVVIVGGGDCGTLKEVLKHPGVEEAWQVEIDERVTRVAEKYFPDLC
TANNDPRANFFF
GDGIKWIADAPLESIDLIIVDSTDPVGPAEGLFAVDFYRNCFMALREGGMIVQQTESPLL
HTSSIIKKVH
DDMRQAGFDGVRTLPFPQPVYPTGWWSCTMAGKGKKLEFFREEDAAERPFVTRYYNA
EVHKAALALPEFM
KNELDLD
spermidine synthase [Methylomarinum vadi]
>gi|670485762|ref|WP_031434014.1| spermidine synthase [Methylomarinum vadi]
MLDATQWFTEQWLPDGSAFSLKIKRKLHEEQSDFQHLEIYETENFGNLMVIDGCVMLTS
RDNFFYHEMMS
HPALFTHPDPKKVWIIGGGDCGTLKEVLKHPGVEEVVQIDIDERVTRLAEQYFPELCESN
DDPRAQLKFI
DGIKWVKDAEPGSVDLIIVDSTDPVGPAEGLFSKDFYRDCHRSLSEHGMVIQQSESALY
HLKLLGEMREA
MSAAGFGHLQTLFFPQCVYPSGWWSATIAGKSDLSAFREQDAADKSFATVYYNSDIHK
ASLAQPEFFKQA
MGAK
spermidine synthase [Marinobacter excellens]
>gi|764485866|ref|WP_044387897.1| spermidine synthase [Marinobacter excellens]
MTALNEGWFTEVFQDQGTAFSLQVKAKLHEEQTPFQKLEIYQTETFGNLMVLDGCVML
TTRDNFLYHEMM
THPALFTHKNPKKVVIVGGGDCGTLKEVLKHPDVEEAWQVEIDERVTRMSEKYFPELC
DANDDPRANFFF
GDGIAWMREVEPGSVDLIIIDSTDPVGPAEGLFALDFYRDAMAALREGGIIVQQSESPLL
HTETIIKNIH
SDMYKAGFGHVQTLPFPQPVYPTGWWSCTMGSKHNPLKYFREDDANNRPFVTRYYNA
GVHHGALAMPQFM
VDALEDEVRPEEG
spermidine synthase [Methylobacter tundripaludum]
>gi|652888547|ref|WP_027148339.1| spermidine synthase [Methylobacter tundripaludum]
MNPTEWFTEQHSDAGSAFSLKIKQKLHEEQSEFQHLEIYETETFGNLMIIDGCTMVSTRD
NFFYHEMMSH
PALFTHPDPKRVWIIGGGDCGTLREVLKHPSVEQAVQIDIDERVTRLAEIYFPELCESNND
PRADLKFID
GIKWVKDAEPNSVDIIIVDSTDPVGPALGLFSEEFYRDCFACLSENGMVVQQSESPLYHM
KLIGEMRDAM
SNAGLSHLQTLFFPQCLYPSGWWSATIASKGDLSKFRESDSANKPFDTTYYNVDIHKAA
LAQPEFVKKAF
NL
spermidine synthase [Marichromatium purpuratum]
>gi|491364169|ref|WP_005222081.1| spermidine synthase [Marichromatium purpuratum]
MLDPNQWFSEVVATDGSAFSLKMRARVHEEQTPYQRIEIYDTEGFGHLMVIDGCTMLS
TRDNFLYHEMMS
HPALFTHAAPRRVCIIGGGDCGTLREVLRHDGVESAVQIDIDERVTRLAERYFPELTEAN
ADPRAQLLFE
DGVRWIREAAPASLDLIIVDSTDPVGPAEGLFTRDFFADCERVLAPGGILIQQSESPLYHT
QLLRDMHQA
LREGGFDTTQTLCFPQPIYPSGWWSATMAGKGVALDRFRLEDARAKPFATRYYNAEIH
QGALAQPEFLRR
ALAATD
>gi|759391214|ref|WP_043116423.1| spermidine synthase [Solemya velum gill symbiont]
MLDRNWFSEAMDGTGSAISLKITGKLHEETSNYQKIEVYETTEWGNLMVIDDCTMVST
RDNFLYHEMMSH
PALFTHPAPKNVAIIGGGDCGTLREVLKHTEVEHATQIDIDERVTRVSEIYFPELCESNND
PRAELLFID
GIKWMQEAQPGSLDVIIVDSTDPVGPGKVLFSAAFYKACFEALGEDGVMVQQSESPLLH
EELIRCMSADM
HKAGFFATRLLSFPQPIYPSGWWSATMAGKGGLDTFRADAARERSFETRYYNEGIHLGA
LATPQFLHDL
>gi|494359041|ref|WP_007194088.1| spermidine synthase [Thiocapsa marina]
MLDPNTWFSEVADADGAAFSLRISSKLHEEQSPYQHIEIYETEGFGHLMVIDGCTMLSTR
DNFLYHEMMS
HPALFTHPDPKRVCIIGGGDCGTLREVLKHPGVEQAVQIDIDERVTRLSEMFFPELTASN
GDPRAHLLFE
DGVRWIQEADAGSLDIIIVDSTDPVGPAVGLFTSDFYADCRRALGAGGILVQQSESPLYH
MRILTEMHTA
MRSAGFRDTRTLLFPQPIYPSGWWSATMAGTDLTLGDFRAEDAARKAFDTHYYNSEIH
RAALAQPEFFRR
ALAEIAD
>gi|494265862|ref|WP_007154281.1| spermidine synthase [Marinobacter algicola]
MTALNDGWFTEVFQDQGTAFSLQVKKKLHEEQTEFQKLEIWETETFGNLMVLDGCVM
LTTRDNFLYHEMM
THPALFTHKDPKKVVIVGGGDCGTLKEVLKHPGVEEAWQVEIDERVTRLSEQYFPELCE
SNADPRANFFF
GDGIQWIRDAVPGSLDVIIIDSTDPVGPAEGLFALDFYRDCMIALRDGGVIVQQSESPLLH
TNTIIKTIH
DDMKKAGFDHVRTLPFPQPVYPTGWWSCTMAGKEKPVVYFREEDADQRPFVTRYYNA
DIHRGALAMPQFM
VDALEDEVMSSER
>gi|752684679|ref|WP_041332626.1| spermidine synthase [Marinobacter salarius]
MTALNDGWFTEVFQDQGTAFSLQVKKKLHEEQTEFQKLEIWETETFGNLMVLDGCVM
LTTRDNFLYHEMM
THPALFTHKDPKKVVIVGGGDCGTLKEVLKHPGVEEAWQVEIDERVTRLSEQYFPELCE
SNTDPRANFFF
GDGIQWIRDAVPGSLDVIIIDSTDPVGPAEGLFALDFYRDCMIALRDGGILVQQSESPLLH
TNTIIKTIH
DDMKKAGFDHVRTLPFPQPVYPTGWWSCTMAGKEKPVVYFREEDADQRPFVTRYYNA
DIHRGALAMPQFM
VDALEDEVMSSER
>gi|653308354|ref|WP_027485361.1| spermidine synthase [Rhodanobacter sp. OR87]
MSQQPTSNETSWFTEAHQASGSSIGFRTEQLLHAEKTPFQTIEIHQTTDWGKLMVIDGCV
MLTSRDNFLY
HEMMTHPALFTHARAKRVVIIGGGDCGTLREVLKHEEVEHAVQVEIDERVTRLAEQYF
PELCEANGDPRA
ELRFIDGIKYMAEAEPDSLDLIIVDSTDPVGPAEGLFNAAFYASCYKALRHGGLLVQQSE
SPLAHLELIK
SMRSAMRTSGFSAVKTLPFPQPCYPTGWWSCTMARKGGDLSGFRERGASAKNFPTRYY
NAEIHKAALAQP
EFMREALGD
>gi|496438574|ref|WP_009147419.1| spermidine synthase [Thiorhodovibrio sp. 970]
MLNPEEWFTEIVEDSGSAFSLRIKSKVHEEQTPYQSIEVYDTDGFGQLMVIDGFTMLSSR
DNFLYHEMLA
HPVLFTHQAPRHVAIIGGGDCGTLREVLKHQEVEVAVQIDIDERVTRVAEQFFPELTESN
QDPRASLLFE
DGIAWIRNVENASLDVIIIDSTDPVGPAEGLFTADFYRDCLAALAPGGLLVQQSESPLYH
MEIIRGMYAD
LTSAGFADRRTLFFPQAIYPSGWWSATMAAKDSSLDDWRREAAEARGFATKYYNAAM
HQAALAAPQFFLD
AMAEAPPPV
>gi|817166122|ref|WP_046521414.1| spermidine synthase [Rheinheimera sp. IITR-13]
MSGDNKWFTEIFAASGSAFGLAISKKLDEVQSPFQHIEMFETTHFGNLMVIDGVIMLSSR
DNFLYHEMLS
HPVLFTHPNPKQVVIIGGGDCGTLREVLKHPDIEQVTQIDIDEQVTRMAEKYFPELCESN
NDPRATLKFA
DGIAYMRDAAPGSLDVVIVDSTDPIGPGEGLFNRAFYESCLKALRPGGILVQQSESPLIH
MPLLKAMRDA
MSEAGFADLQSLLFPQMVYPSGWWTCTLARKDAKFDGFRVEAAQNPAFETQYYNAEV
HQAAMALPNFVKK
AFS
>gi|518296332|ref|WP_019466540.1| spermidine synthase [Dyella japonica]
MSQHPSWFTEAHQASGSSIGYRVEKLLHAEKTPFQTIEIYQTTDWGNLMVIDGCVMLTS
RDNFLYHEMMT
HPALFTHARAKRVVIIGGGDCGTLREVLKHEEVEHAVQVEIDERVTRLAEQYFPELCDS
NNDPRAELLFI
DGIKYMAEAEPESLDLIIVDSTDPVGPAEGLFNAAFYASCYKALRHGGILVQQSESPIAH
LELIKSMRSA
MRTAGFSAVKTLPFPQPCYPTGWWSCTMVRKGGDLAGFRERGALSKNFPTRYYNADIH
KAALAQPEFMRE
ALGE
>gi|655259776|ref|WP_028670269.1| spermidine synthase [Saccharospirillum impatiens]
MPENESWFTEVWSPEGSAFSLEVTAKLHEEQSAFQHIEIYQTRHWGKLMVLDGCYMVT
DKDNFLYHEMMT
HPALFTHPNPKKVLIIGGGDCGTLREVLRHPGVEQAWQVEIDERVTRLSELHFPELCEAN
NDPRASLLFE
DGIAWIKNCQPGDLDLIIVDSTDPVGPAAGLFNREFFSHCLRALGDGGLLVQQSESPLFH
TDNLIAEMIG
ELRAAGFQSHHTLPFPQPVYPSGWWSCTMASKGLTVTDFREQDAADKPFATRYYNADI
HRAALAVPEFMK
PLYR
9. Langkah selanjutnya setelah mengumpulkan 25 jenis sekuen protein yang berbeda yang
diambil dari Accession number kemudian membuka server Multalin dan memasukkan
keseluruhan sekuen-sekuen tersebut kedalam kolom yang tersedia lalu klik Start
Multalin

10. Hasilnya akan didapatkan urutan asam amino yang conserve dari beberapa accession
number yang kita pilih sebelumnya. warna merah menunjukkan homologi dari tiap
sekuen dan region inilah yang nantinya kita gunakan untuk mendesain forward maupun
reverse primer.
 Berdasarkan hasil alignment diatas maka dapat ditentukan sekuen yang akan digunakan
sebagai degenerate primer. Degenerate primer sendiri umumnya digunakan untuk
menggandakan DNA didalam situasi hanya pada sekuen protein dari sebuah gen yang sudah
diketahui, atau dimana tujuan untuk mengisolasi gen yang mirip dari beberapa varietas.
Berdasarkan beberapa pengujian (kemampuan primer mengenali sekuen yang kita miliki serta
nilai Tm dan GC kontenya) maka dipilih sekuen asam amino berikut sebagai primer :
forward primer : GGGDCGT (GGNGGNGGNGAYTGYGGNACN)
Reverse primer : DSTDP (GAYWSNACNGAYCCN-nanti dibalik)

11. UJI VALIDASI PRIMER

Sekuen spermidine siyntase yang kita gunakan sebagai sampel selanjutnya di-tblastn
kemudian dirun menggunakan multalin dengan memasukkan primer yang kita miliki.
Adapun langkah-langkahnya sebagai berikut :
a. Membuka server NCBI untuk memilih sekuen protein yang akan kita gunakan dalam
validasi primer. Diawali dengan meng-klik Accession number diawal hingga akan
muncul tampilan seperti dibawah ini. Kemudian klik Run BLAST

b. Setelah muncul tampilan dari software blast selanjutnya ubah menjadi tblastn
kemudian klik Blast utuk mendapatkan alignment dari sekuen protein yang kita pilih.

c. Setelah keluar hasil alignmentnya kemudian pilih salah satu satu Accession number
yang nantinya akan kita gunakan untuk menguji primer yang kita design.
d. Akan muncul data-data dari accession yang kita pilih,kemudian klik FASTA dan
mengkopi sekuen nukleotidanya ()
e. Mengkopi sekuen nukleotida

f. Setelah mengkopi sekuen nukleotida dari NCBI kemudian membuka website

MULTALIN selanjutnya isi kolom dengan nukleotida yang telah dikopi dari NCBI.
Dibawah sekuen nukleotida tersebut kemudian dituliskan :
>Forward
GGGDCGT (GGAGGATGAGATTGGCGAGCT)
>Reverse (lalu enter)
IIIDSTD (GATAATCAGCTCCCATTTCGG)
Kemudian klik Start Multalin

g. Hasil pengujian dengan multalin disimpulkan bahwa primer yang kita design cukup
baik digunakan. Untuk forward primer sangat baik karena berdasarkan uji ini dapat
dilihat bahwa primer dapat menempel lebih dari 90% dan hanya ada 1 basa yang tidak
match. Sementara itu untuk reverse primer cukup baik karena semua match
 12. Mengecek nilai Tm untuk Forward dan reverse primer
a. Mengecek nilai Tm forward primer

Berdasarakan data diatas diketahui bahwa forward primer mengandung GC content

sebanyak 57.1 %. Nilai persentase ini lumayan tinggi tapi masih dalam batas normal karena
range GC content yang baik untuk mendesign primer yaitu antara 40 – 60%. Sementara itu untuk
nilai melting temperaturnya (Tm) sudah cukup baik yaitu 56.3 oC sebagaimana diketahui bahwa
range untuk nilai Tm yaitu antara 52 -58 oC..
 b. Mengecek nilai Tm Reverse primer (http://www.biophp.org)

Berdasarkan data dari reverse primer diatas diketahui bahwa nilai persen GC content dan
nilai Tm nya masih dalam batas standar sehingga primer ini cukup baik digunakan. Karena
perbedaan Tm antara forward dan reverse primer maksimal 5 oC.
.