ACARA VI.

PEMBUATAN SEL KOMPETEN

Dasar Teori:

Transformasi adalah teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri,
misalnya bakteri E. coli. Dalam proses transformasi, sebelum dilakukan transformasi harus
membuat sel kompeten terlebih dahulu. Sel Kompeten (Competent Cells, CC, C-Cells) adalah
sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh
kemampuan untuk mengambil DNA asing. Sel kompeten juga dapat diartikan sebagai bakteri
yang telah diberi perlakuan fisik (elektroporasi) atau kimia yang meningkatkan
kemampuannya untuk menerima DNA rekombinan. Bakteri tersebut akan mengalami
perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Dinding sel bakteri akan bersifat permiabel
dan dapat dilewati molekul DNA. Tujuan pembuatan sel kompeten yaitu untuk memudahkan
plasmid masuk ke dalam sel inang.

Pembuatan sel kompeten penting untuk dilakukan dalam transformasi gen karena
tidak semua bakteri dapat menjadi objek dari transformasi, hanya sel kompeten bakteri yang
dapat digunakan. Pembuatan kompeten sel dapat dilakukan dengan metode penambahan
CaCl2 atau dengan penambahan DMSO/metode TSS. Sel kompeten harus di panen pada Log-
fase dan disimpan pada temperatur dingin (-80ºC), karena akan menurunkan kualitas
kompeten sel jika dibiarkan dalam temperatur ruang.

Salah satu metode sederhana untuk membuat sel menjadi kompeten (siap untuk
ditransformasi) dengan cara merendam sel bakteri ke dalam larutan garam dalam kondisi
dingin, contohnya kalsium klorida (CaCl2). Larutan garam ini dapat mengikat DNA dan
komponen lipopolisakarida dari dinding sel bakteri yang bermuatan negatif, sehinga DNA
terikat dengan dinding sel bakteri. Selain itu, larutan lain yang dapat digunakan untuk
pembuatan sel kompeten adalah polietilene glikol.

Tujuan Praktikum:

Tujuan praktikum pada acara Pembuatan Sel Kompeten yaitu:

1) Mahasiswa dapat memahami pengertian sel kompeten.

 2) Mahasiswa dapat memahami cara membuat sel kompeten dengan menggunakan
metode penambahan CaCl2.

Metode Praktikum:

Alat:

 Inkubator shaker
 Waterbath
 Facon Tube 15 ml
 Erlenmeyer
 Mikrotube
 Sentrifugator

Bahan:

 Kultur sel Eschericia coli DH5-

 Media LB (Luria bertani) cair
 Media LB (Luria bertani) padat
 Gliserol 10%
 CaCl2

A. Pembuatan Media LB Cair

Komposisi dalam 100 mL Akuades
 NaCl 1% 1 gr
 Trypton 1% 1 gr
 Yeast 0,5% 0,5 gr
 Bacteriologycal Agar 2% 2 gr

Semua bahan di larutkan kedalam akuades 500 mL menggunakan erlemeyer 1 L,

cek kondisi pH media sampai keadaan netral (pH 7), jika asam, dapat
ditambahkan NaOH secara berlahan –lahan. Media siap di sterilisasikan dengan
Autoclaf. Sebelum dituang kedalam petridisk, media dipastikan dalam kondisi
hangat–hangat kuku(55 0C). Jika Media diberi kandungan antibiotik ampicilin
100 μL/mL. Maka dapat ditambahkan ampicilin 500 μL dan media siap
didistribusikan ke dalam petridisk.
 B. Pembuatan Sel Kompeten dengan Metode CaCl2
1. Kultul sel bakteri E. coli DH5α kedalam 5 ml media LB cair selama 24 jam (over
night) pada Waterbath shaker dengan suhu 37 0C.
2. Ambil sebanyak 250 μl dan pindahkan kedalam media LB cair yang baru 50 ml.
3. Inkubasi selama 2 –3 jam hingga OD (optical Density) mencapai OD 0,5 atau 0,6
pada inkubator shaker dengan suhu 370C. (karena sel berada di log tengah dan siap
menjadi kompeten)
4. Sebanyak 50 ml kultur bakteri E. coli DH5α dimasukan ke dalam facon tube
5. Sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
6.Supernatan dibuang, letakkan facon tube yang berisi pelet di es kemudian dan pelet
yang tertinggal dalam mikrotub diresuspensi dengan 15 mL TFB (CaCl2).
7. Inkubasi kembali dalam ice box selama 4 jam
8. Sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4 0C.
9.Supernatan dibuang dan pelet yang tertinggal ditambahkan 4 ml CaCl2 15%
gliserol, kemudian inkubasi dalam ice box
10. Pindahkan kultur sel ke eppendorf kecil sebanyak 200 μl. Sel E. coli DH5α siap
digunakan untuk transformasi

Cara Kerja:

1. Buka link video:

 https://www.youtube.com/watch?v=H4X-5Bg0bE8 (How to Make Chemically
Competent E. coli)
2. Amati cara pembuatan sel kompeten pada video tersebut

Pembahasan Laporan:

1) Jelaskan pengertian sel kompeten!

2) Jelaskan prinsip metode pembuatan sel kompeten dengan CaCl2!
3) Jelaskan fungsi bahan yang digunakan untuk membuat sel kompeten!