1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung

informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi

bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA

genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein

histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.

Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon (Kirsman, 2010).

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan

buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pemisahan DNA

dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan
 2

penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung

dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam

nucleus dan sitoplasma (Yuwono, 2008).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu

prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik

untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul

yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan

molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas

dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian

DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,

membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi.

Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA

murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan

dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus

menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan

dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah

untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA

(Rachmat, 2012).
 3

Tujuan Praktikum

Adapun tujuan praktikum ini untuk mengetahaui tentang isolasi DNA,

tahap-tahap isolasi DNA, dan metode-metode isolasi DNA.

Kegunaan Penulisan

Adapun kegunaan dari penulisan laporan ini adalah sebagai salah satu

syarat untuk dapat memenuhi komponen penilaian di Laboratorium Bioteknologi

Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan

menjadi sumber informasi bagi pihak yang membutuhkan.

 4

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-

tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan

presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara,

akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang

berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam

konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. DNA isolation is the

most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation

techniques which are developed were expensive. Arti: Isolasi DNA merupakan

tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA

yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.

(Listanto,1996)

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk

berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui

elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA

dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam

isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA

dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA

tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi DNA hewan pada

dasarnya memiliki prinsip yang sama ( Artama, 1991).

Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang penting

dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi

DNA sangat mempengaruhi hasil yang diperoleh. Analisis tingkat molekuler

 5

dengan DNA sebagai objeknya diawali dengan proses isolasi DNA, selanjutnya

diikuti analisis molekuler, seperti PCR (Polymerase Chain Reaction), RLFP

(Restricted Fragment Lenght Polymorphis), dan RAPD (Restricted Amplified

Polymorphisms) (Fatchiyah, 2011).

Macam-macam Metode Isolasi DNA 1.Teknik Random Amplified

Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan

pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer

tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.Primer tunggal ini

biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang

memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan

sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase

G+C 50-60% 2. Metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)

merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman

yang banyak mengandung polisakarida dansenyawa polifenol Menghasilkan pita

DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena

adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping

deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA

dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita

RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl

alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan,

karena sifat toksik phenol. 4. SaltingOut Menggunakan garam konsentrasi tinggi

(NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk

denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding

 6

dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel ,

Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel Silica gel dapat

mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi

recovery DNA kurang 7. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan suatu

teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah

spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang

digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal

yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip

dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif

(Giri, 2004)
 7

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Praktikum

Adapun kegiatan praktikum ini dilaksankan di Jalan Serdang No. 131

Perbaungan, Provinsi Sumatera Utara pada Tanggal 3 Maret 2021 Hari Rabu pada

pukul 10.00 – selesai.

Alat Dan Bahan Praktikum

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Alat-alat yang

diperkenalkan pada praktikum isolasi DNA yaitu laptop, handphone , pulpen,

kertas. Alat labnya ialah laminar air flor, autoklaf, cawan petri, botol kultur, rak

kultur, pisau scalpel, timbangan analitik, enkas, kulkas, oven, hotplate dan stirer,

phmeter, lampu floresence, hygro meter, keranjang, ac, handsprayer, bunsen,

spritus, pinset. Sementara alat pada praktikum lab genetika molekuler ialah

sentri fuge, tube, waterbath, tabung nitrogen cair, ultra low freezer, automed

extraction and purification system, real time pcr system, hotplate, komputer,

geldocumenter, powersupply, bakelektroforesis, vortex, sp ektrofotometer, cuvete,

thermocycler, mikropipet, pcrhood, tips, termometer, loading dye, ladder go taq,

mortal alu.

Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah literatur

sebagai bahan pembelajaran, buku penuntun sebagai acuan praktikum, materi

pembahasan untuk petunjuk pengerjaan laporan, serta paket data dan wifi untuk

mencari sumber informasi. Bahan yang digunakan pada lab kultur ialah agar, zpt,

larutan stok ms, aquades, dithane, detergent, klorox, twen 20, alkohol, naoh dan

hcl. Sementara bahan pada lab genetika molekuler ialah edta, buffer taeagrose,

buffer te, ctab, PVPP.

 8

Prosedur Praktikum

1. Dikumpulkan seluruh praktikan untuk di beri pengarahan

2. Dipahami materi judul praktikum

3. Dicatat hal-hal penting dari materi praktikum

4. Dijawab soal kuis yang di berikan

5. Dibuat laporan praktikum sesuai judul dan format yang di berikan.

 9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

GAMBAR KETERANGAN

Disemprot alat dan bahan

menggunakan alcohol agar steril

Dibuang tulang daun

Dipotong daun secara melintang dan

dimasukkan pada mortal

Ditambahkan nitrogen cair pada

mortar yang berisi potongan daun

Digerus daun searah jarum jam

sampai halus
 10

Ditambahkan PVPP 0,1 gr sebagai

antioksidan

Dimasukkan CTAB 1 ml dan

β- mercaptoethanol 10 µl kedalam

tube 2ml dan di inkubasi pada

waterbath yang bersuhu 65oC selama

30 menit

Dimasukkan daun yang telah digerus

tadi kedalam tube yang berisi CTAB

dan β- mercaptoethanol yang telah

diinkubasi

Dikocok hingga homogen

Dilakukan inkubasi selama 30 menit

 11

Dilakukan pengocokkan saat

inkubasi setiap 10 menit

Ditambahkan 1ml KIAA

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge

selama 10 menit

Didapatkan hasil centrifuge selama

10 menit

Dipisahkan supernatan

menggunakan mikropipet dan

dimasukkan ke dalam tube baru

 12

Ditambahkan KIAA kedalam tube

yang berisi supernatan hasil

centrifuge 10 menit

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge

selama 7 menit

Setelah dikeluarkan dari centrifuge,

ditambahkan KIAA 1ml

Dihomogenkan menggunakan vortex

Dimasukkan kedalam centrifuge

selama 5 menit dan setelah di

sentrifge di tambah isopropanol dan

diinkubasi selama 1 malam

 13

Didapatkan hasil setelah diinkubasi

selama 1 malam

Disentrifuge hasil tsb selama 7 menit

Dipisahkan supernatan (pelet yg

berwarna kuning ditinggalkan di

tube utk tetap diamati)

Dikering anginkan

Ditambah buffer TE 100 µl dan

etanol absolut 1 ml

Disentrifuge selama 5 meni

 14

Dibuang larutan bening (buffer TE

dan etanol) dan tetap ditinggalkan

pelet pada tube utk diamati

Ditambah buffer TE 100 µl dan

etanol absolut 1 ml. Disentrifuge

selama 10 menit

Dibuang larutan bening (buffer TE

dan etanol) dan tetap ditinggalkan

pelet pada tube utk diamati

Ditambah buffer TE 100 µl

Disimpan di binder
 15

PEMBAHASAN

Isolasi DNA memiliki tahapan-tahapan dalam melakukan kegiatan isolasi

DNA, isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap

jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda. Hal ini sesuai

dengan literatur Listanto (1996) yang menyatakan bahwa Isolasi DNA

merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:

preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada

setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini

dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi

yang dapat menghambat pemurnian DNA. DNA isolation is the most important

step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are

developed were expensive. Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam

analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan

sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.

Kegiatan isolasi DNA memiliki 3 prinsip utama dalam melakukan

kegiatan isolasi DNA dan DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi.

Hal ini sesuai dengan literatur Artama (1991) yang menyatakan bahwa Molekul

DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam

keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi

DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti

protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni

penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti

selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA
 16

buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi DNA hewan pada dasarnya memiliki

prinsip yang sama.

Dalam kegiatan isolasi DNA di perlukan konsentrasi, yang sangat

mempengaruhi hasil yang diperoleh. Hal ini sesuai dengan literatur Fatchiyah

(2011) yang menyatakan bahwa Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid)

merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian

dan konsentrasi dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang diperoleh.

Analisis tingkat molekuler dengan DNA sebagai objeknya diawali dengan proses

isolasi DNA, selanjutnya diikuti analisis molekuler, seperti PCR (Polymerase

Chain Reaction), RLFP (Restricted Fragment Lenght Polymorphis), dan RAPD

(Restricted Amplified Polymorphisms).

Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi DNA sangat

mempengaruhi hasil yang diperoleh. Isolasi DNA juga memiliki metode-metode

untuk melakukan kegiatan isolasi DNA. Hal ini sesuai dengan literatur Prasetyo

(2008) yang menyatakan bahwa Macam-macam Metode Isolasi DNA 1.Teknik

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme

DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang

menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara

acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu

anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus

pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa

dengan persentase G+C 50-60% 2. Metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium

Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi

DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dansenyawa

 17

polifenol Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan

DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan

(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode

CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di

bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi.

Metode-metode isolasi DNA ini ada yang bagus ada jugak yang tidak

seperti Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl

alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan,

karena sifat toksik phenol. Hal ini sesuai dengan literatur Giri (2004) yang

menyatakan bahwa Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-

choloroformisoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir

ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol. 4. SaltingOut Menggunakan garam

konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan

Proteinase K untuk denaturasi protein. 5. Guanidine isothiocyanate Metode ini

lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk

lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein. 6. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI),

Cepat, tetapi recovery DNA kurang 7. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro

pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer

yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai

tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut

mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
 18

KESIMPULAN

1. Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui

tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA

dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.

2. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran

(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti

selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

3. Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang

penting dan Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi DNA

sangat mempengaruhi hasil yang diperoleh.

4. Macam-macam Metode Isolasi DNA:

1.Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

2. Metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)

3. SaltingOut Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M)

4. PCR (Polymerase Chain Reaction)

5. Phenol:chloroform Mengunakan senyawa Phenol-

choloroformisoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi

DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

 19

DAFTAR PUSTAKA

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.

UGM. Yogyakarta.

Fatchiyah, 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.

Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.

Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Listanto, 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural

Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung
transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi
Tanaman Pangan. Bogor

Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas
L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.