PROTEIN

A. Tujuan Percobaan :

1. Analisis Kualitatif Protein

Mempelajari beberapa reaksi uji yaitu uji millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji
Biuret, dan uji pengendapan terhadap protein.

2. Analisis Kuantitatif Protein

Menentukan kadar protein secara biuret.

B. Dasar Teori

Protein adalah suatu zat organik yang mengandung nitrogen. Oleh karena itu suatu
protein pasti tersusun atas unsur-unsur C, H, O, dan N. Beberapa diantaranya juga ada yang
mengandung Fe, S, P, dan Cu dalam jumlah yang relatif kecil.

Asam Amino

Dari rantainya sudah menunjukkan bahwa asam amino memiliki dua buah gugus
fungsional yaitu gugus karboksilat (-COOH) dan gugus amino (-NH3). Gugus amino
penyusun protein biasanya terdapat pada kedudukan atom (α pada asam amino, artinya gugus
amino terikat pada kedudukan atom (α bila ditinjau dari gugus fungsional –COOH). Asam
amino yang paling sederhana adalah glisin dengan struktur sebagai berikut:

CH2 COOH

NH2

Rumus umum dari molekul asam amino adalah:

 O

C
OH

NH2 C H

R
L asam amino

C
OH

H C NH2

R
D asam amino

Gugus R dalam rantai di atas banyak sekali macamnya, dapat berupa rantai lurus (alifatik),
inti siklus, ataupun heterosiklis, tersubstitusi ataupun tidak.

Asam amino yang terdapat di alam ternyata banyak sekali macamnya. Kurang lebih
70 macam telah diketahui, namun demikian sebagai penyusun protein hanya 20 macam.
Asam amino yang 20 macam ini disebut sebagai asam amino standar. Asam amino dapat
dikelompokkan dengan dasar yang berbeda sebagai berikut:

a. Berdasarkan jumlah gugus-gugus fungsionalnya : mono amino, mono karboksilat,

mono dikarboksilat, dan sebagainya.

b. Berdasarkan bentuk rantainya : alifatik, aromatik, heterosiklis, dan sebagainya.

c. Berdasarkan reaksinya dalam larutan : asam amino asam, asam amino basa, dan asam
amino netral.
 d. Berdasarkan sifat-sifat, gugus rantai sampingnya:

1) Asam-asam amino dengan rantai samping (R) non polar, yaitu: alanin, valin
leusin, isoleusin, phenilalanin, tryptophan, metionin, dan prolin.

2) Asam-asam amino dengan rantai samping (R) polar.

1. Gugus rantai samping (R) bersifat polar tidak bermuatan, yaitu tirosin,
glisin, serin, threonin, asparagin, glutamin, dan sistein.

2. Gugus rantai samping (R) bermuatan positif, yaitu : lisin, arginin, dan
histidin.

3. Gugus rantai samping (R) bermuatan negatif, yaitu : asam aspartat dan
asam glutamat.

Sifat- Sifat Asam Amino

a. Sifat fisika

Asam amino adalah zat yang mudah mengkristal, pada umunya larut dalam air, sedikit
atau tidak larut dalam alkohol dan tidak larut sama sekali di dalam eter. Titik lebur
asam amino biasanya di atas 200 0C bahkan ada yang diatas 300 0C. Banyak asam
amino yang mengalami perubahan bila dipanaskan sampai titik leburnya. Semua asam
amino mempunyai atom C asimetris, yaitu atom Cα yang mengikat gugus amino,
namun beberapa diantaranya mempunyai dua atom C asimetris, hingga asam-asam
amino umunya mempunyai isomer optis.

b. Sifat Kimia

Asam amino mengandung 2 macam gugus yang berlawanan sifatnya, yaitu gugus –
COOH yang bersifat asam (karena dapat melepaskan ion H+) dan gugus +NH 2 yang
bersifat basa (karena dapat menerima proton). Karena adanya kedua macam gugus
tersebut maka asam amino dapat bereaksi dengan asam maupun basa. Sifat yang
demikian disebut sifat amfoter. Berikut adalah reaksi asam amino terhadap asam
maupun basa:
 CH2 COONa
COOH
HCl

NaOH

NH2 NH2.HCl
+ H2O

Apabila kedua gugus tersebut terion, maka akan terbentuk suatu ion dengan dua
kutub. Ion yang demikian tersebut disebut ion zwitter mencapai harga maksimum dan
konsentrasi asam konjugasi sama dengan konsentrasi basa konjugasi, maka larutan ini
dapat menghantarkan arus listrik. Dalam keadaan ini larutan tidak mengalami
elektrolisis, berarati tidak terjadi perubahan ion-ion di dalam larutan dan pH larutan
selalu tetap. Pada saat pH yang demikian ini larutan tersebut dikatakan mencapai titik,
isoelektrik. Harga pH isoelektrik adalah rata-rata dari harga pK gugus karboksilat dan
gugus amonium.

Pembagian Protein
 Protein sederhana (protein tunggal)

1. Pembagian berdasarkan kelarutan atau bentuknya.

Walaupun bentuk dari struktur primer protein merupakan rantai linear, hampir
semua protein di alam dalam bentuk melipat menjadi bentuk yang lebih
kompak membentuk globular. Sedangkan yang lain membentuk konfigurasi
fibrous seperti kolagen.

2. Pembagian berdasarkan susunan molekulnya.

a) Protein sederhana (protein majemuk)

Protein sederhana ialah protein-protein yang apabila dihidrolisis hanya

menghasilkan asam-asam amino saja. Termasuk ke dalam golongan ini
adalah albumin, globulin, glutein, prolamin, albominoid, dan histon.

b) Protein majemuk

Protein majemuk adalah protein-protein yang mengandung gugusan

non protein yaitu senyawa-senyawa bukan asam amino yang termasuk
ke dalam golongan ini adalah kromoprotein, nukleoprotein,
glukoprotein, fosfoprotein, lipoprotein, dan metaloprotein.

c) Pembagian protein berdasarkan fungsinya.

Dikenal beberapa penggolongan protein berdasarkan fungsinya sebagai

berikut : protein enzim, protein kontraktil, protein transport, protein
nutrien, protein struktural, protein pertahanan, dan protein pengatur /
pengendali.

C. Alat dan Bahan

1. Analisis Kualitatif Asam Amino

Alat:

a. Tabung reaksi 10 buah

b. Rak tabung reaksi 2 buah
 c. Penjepit
d. Pembakar spritus
e. Gelas beker
f. Pegaduk
g. Mixer
h. Pipet tetes

Bahan:

a. Triptophan
b. Tirosin
c. Putih telur
d. Kasein
e. Susu
f. Reagen Millon
g. Reagen Hopkins-Cole
h. H2SO4 pekat
i. Larutan Ninhidrin
j. NaOH 2,5 N
k. CuSO4 0,01 M
l. Kristal Amonium Sulfat

2. Analisis Kualitatif Protein

Penentuan Kadar Protein secara Biuret

Alat:

a. Pipet ukur
b. Gelas ukur
c. Tabung reaksi
d. Vortex-mixer
e. Spektrofotometer UV-Vis
f. Stopwatch
 Bahan:

a. Reagen Biuret
b. Akuades
c. Susu

D. Cara Kerja

1. Analisis Kualitatif Asam Amino

a. Uji Millon
Menambahkan 5 tetes reagen Millon kedalam 3 mL larutan protein

Memanaskan campuran baik-baik. Jika reagen yang digunakan terlalu banyak, maka akan hilang pada pemanasan

b. Uji Hopkins-Cole

Memasukkan 2 mL larutan protein kedalam tabung reaksi

Menambahkan 2 mL reagen Hopkins-Cole

Menambahkan sedikit demi sedikit kira-kira 5 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung

Mengamati warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan. Putar perlahan-lahan tabung terebut sampai terbentuk cincin

c. Uji Ninhidrin
Menambahkan 0,5 mL larutan Ninhidrin 0,1 % kedalam 3 mL larutan protein, kemudian memanaskannya hingga mendidih

Mengulangi percobaan dengan menggunakan protein yang lain

d. Uji Biuret

Menambahkan 1 mol NaOH 2,5 N kedalam 3 mL larutan protein

Mengaduk sampai rata

Menambahkan setetes CuSO4 0,01 M, kemudian mengaduknya, jika tidak timbul warna violet, tambahkan lagi setetes atau 2

e. Pengendapan dengan Amonium Sulfat Jenuh

Menambahkan sedikit kristal amonium sulfat, kemudian mengaduknya hinngga melarut

Menambah sedikit amonium sulfat dan mengaduknya hingga melarut. Melakukan hingga amonium sulfat tidak larut lagi.
Menyaring endapan jika larutan sudah jenuh

Menguji kelarut dalam air. Kemudian menguji dengan reagen Millon dan filtratnya diuji dengan reagen Biuret

2. analisis kuantitatif

1. penentuan kadar protein secara biuret.

 Memipet ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan,protein yang mengandung 1 sampel
10 mg/ml

Menambahkan 4 ml reagen biuret, megocok dan mendiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Membaca serapannya pada

Untuk blanko memakai campuran I ml akuades dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selam 30 menit pada suhu kama

Membuat kurva baku dan tetapkan kadar protein larutan yang diberikan

E. Data Pengamatan

Uji Kualitatif Protein

1. Uji Biuret
Pengamatan
Sampel Kesimpulan
Jumlah Tetes Warna

Albumin 7 tetes Warna larutan ungu +

Susu 3 tetes Warna larutan biru -

Glisin 7 tetes Warna larutan biru -

Tyrosin 7 tetes Warna larutan biru -

Triptophan 12 tetes Warna larutan biru -

2. Uji Millon
Pengamatan
Sampel Sebelum Sesudah dipanaskan Kesimpulan
dipanaskan

Albumin Bening Bening -

 Susu Putih keruh Terdapat endapan
merah, larutan +
bening

Glisin Bening Tetap bening -

Tyrosin Bening Larutan berwarna

+
merah pekat

Triptophan Kuning keruh Larutan berwarna

-
coklat keruh

3. Uji Hopkins Cole

Pengamatan

Sebelum Setelah ditambah

Sampel Kesimpulan
ditambah asam asam sulfat pekat
sulfat pekat

Albumin Bening Tetap bening -

Susu Putih keruh Larutan kuning ada

+
endaoan coklat

Glisin Bening Ada 2 fasa, atas:

bening, bawah: +
hijau

Tyrosin Bening Tetap bening -

Triptophan Kuning bening Merah kehitaman +

4. Uji Ninhidrin
Pengamatan
Sampel Sebelum Setelah dipanaskan Kesimpulan
dipanaskan

Albumin Bening Kuning kecoklatan -

Susu Putih keruh Ungu keruh +

 Glisin Bening Tetap bening -

Tyrosin Bening Ungu bening +

Triptophan Bening Tetap, bening

-
kekuningan kekuningan

5. Uji Pengendapan dengan Amonium Sulfat Jenuh

Pengamatan
Sampel Larutan + uji Larutan + uji millon Kesimpulan
biuret

Albumin 5 tetes Endapan larut

Susu 6 tetes Endapan larut

Glisin 10 tetes Endapan sedikit

larut

Tyrosin 7 tetes Endapan merah

kecoklatan, sedikit
larut

Triptophan 9 tetes Endapan kuning

kecoklatan, sedikit
larut

Analisis Kuantitatif

Larutan standar (mg/ml) Absorbansi

1 0,049
2 0,050
3 0,095
4 0,102
5 0,119
Sampel 1 0,270
Sampel 2 0,248
F. Perhitungan

Larutan induk albumin : 10 mg/ml

Larutan standar :

 Volum 1 ml

V1 . M1 = V2 . M2

1 . 10 = 10 . M2

M2 = 1 mg/ml

 Volum 2 ml

V1 . M1 = V2 . M2

2 . 10 = 10 . M2

M2 = 2 mg/ml

 Volum 3 ml

V1 . M1 = V2 . M2

3 . 10 = 10 . M2

M2 = 3 mg/ml

 Volum 4 ml

V1 . M1 = V2 . M2

4 .10 = 10 . M2

M2 = 4 mg/ml
 Volum 5 ml

V1 . M1 = V2 . M2

5 . 10 = 10 . M2

M2 = 5 mg/ml

Berdasarkan kuva larutan standar, diperoleh persamaan :

y = 0,0254 + 0,0192x

 Sampel 1 diperoleh absorbansi sebesar 0,270 maka :

y = 0,0254 + 0,0192x

0,270 = 0,0254 + 0,0192x

y = 12,74 mg/ml

 Sampel 2 diperoleh absorbansi sebesar 0,248 maka :

y = 0,0254 + 0,0192x

0,248 = 0,0254 + 0,0192x

x = 11,59 mg/ml

12 ,74 +11,59
=12 , 165
Konsentrasi sampel = 2 mg/ml

Kadar protein dalam sampel = 12,165 mg/ml x faktor pengenceran

= 12,165 mg/ml x 50/1

= 608,25 mg/ml
 Grafik Hubungan antara Absorbansi
terhadap Konsentrasi

0.14
A b so rb an si

0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6
konsentrasi (mg/mL)

G. Pembahasan

Secara kualitatif, percobaan ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap
asam amino dan protein. Sedangkan secara kuantitatif, bertujuan untuk menentukan kadar
protein secara Biuret.

1. Analisis Kualitatif Protein

Pada berbagai uji kualitatif terhadap beberapa macam protein, senyawa mengacu pada
reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino. Beberapa
asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi
tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein. Uji yang dilakukan yaitu
uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji Biuret, dan uji pengendapan. Bahan uji
yang digunakan adalah triptophan, tirosin, albumin, susu, dan kasein.

a. Uji Millon
Prinsip dari uji Millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang
ternitrasi. Tirosin mempunyai asam amino yang mempunyai molekul fenol pada
gugus R-nya yang membentuk gaaram merkuri dengan pereaksi Millon. Reagen yang
digunakan adalah larutan merkuri dan ion merkuri dalam asam nitrat dan asam nitrit.
Warna merah yang terbentuk adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi.
Pereksi Millon melibatkan penambahan senyawa Hg kedalam protein sehingga pada
penambahan logam ini akan menghasilkan endapan putih dari senyawa merkuri.
Untuk protein yang mengandung tirosin pada penambahan pereaksi Millon
memberikan warna merah.

H3N+ C COO -

CH2
2

tirosin OH
H triptophan

Reaksi yang terjadi:

HO O CH2 CH2 CHCH COOH
COOH
+ Hg2+
Hg

NHNH
2 2

Dari hasil percobaan diperoleh bahwa susu dan tirosin memberikan hasil
positif dengan warna merah. Sedangkan albumin, glisin dan triptophan memberikan
hasil negatif. Maka dapat disimpulkan bahwa susu mengandung tirosin sebagai salah
satu asam amino penyusunnya. Triptophan tidak mempunyai fenol pada gugus R-nya,
maka tidak membentuk warna merah.

b. Uji Hopkins-Cole
Pereaksi Hopkins-Cole terbuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium
dalam air. Larutan protein yang mengandung triptophan dapat direaksikan dengan
pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Hal ini disebabkan,
triptophan dapat berkondensasi dengan sejumlah aldehida dengan bantuan asam kuat
membentuk senyawa yang berwarna. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-
Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan dibawah
larutan protein. Beberapa aat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas diantara
kedua cairan tersebut.

Reaksi warna protein ini menunjukkan positif apabila ditandai terbentuknya

cincin ungu pada bidang batas antara larutan protein dengan pereaksi. Pembentukkan
cincin ini dikarenakan terbentuknya kondensasi 2 inti indol dari triptophan dengan
aldehid. Aldehid disini diperoleh dari asam glioksalat. Kompleks berwarna yang
terentuk adalah:

H H
H
COOH
NH
R N
H

Asam 2,3,4,5-tetra β karbolin-4-karboksilat

Uji ini spesifik untuk protein yang mengandung triptophan. Dari hasil
percobaan, susu, glisin, dan triptophan memberikan hasil positif. Sedangkan albumin
dan tyrosin memberikan hasil negatif. Maka dapat disimpulkan bahwa susu dan glisin
mengandung triptophan.

c. Uji Ninhidrin
Apabila ninhidrin dioanaskan dengan asam amino, maka akan terbentuk
kompleks berwarna ungu. Dalam hal ini akibat terjadinya oksidasi, NH 3 dan CO2 akan
dilepaskan. Kemudian NH3 yang terbentuk bereaksi dengan hidrantin membentuk
kompleks berwarna ungu. Reaksinya adalah:
 NH2 O C O
H

C C +
+ OH
C C OH
R C H
R CH COOH
Hidrantin
C OH

O
O
+ NH3

H O NH2O
O
NH2

C C
C OH
H

+ C N C C
+ + NH3

C C OH
C

O O O
Ungu
 Protein yang mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam
amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna.
Pada uji ini susu dan tyrosin menunjukkan hasil positif. Sedangkan albumin, glisin
dan triptophan menunjukkan hasil negatif.

d. Uji Biuret
Reaksi ini umum untuk peptida dan protein. Reaksi positif dengan terjadinya
cincin ungu. Terjadinya cincin ungu terbentuk dari ikatan Cu dan N dan unsur H
terdapat pada peptida menghasilkan CuN yang terjadi dalam senyawa yang
mempunyai ikatan peptida lebih dari satu. Proses pembentukan ikatan peptida:

NH2NH2

C O
C O Ikatan peptida
NH
NH3 +
C NH2 O

NH2

Pada praktikum ini, susu, glisin, tirosin dan triptophan menunjukan hasil
negatif dengan indikasi terbentuknya warna biru adalah karena tidak adanya ikatan
peptida. Sedangkan pada albumin menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya
warna larutan ungu.

e. Uji Pengendapan dengan Amonium Sulfat Jenuh

Garam-garam anorganik mengendapkan protein karena kemampuan ion garam
terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein untuk mengikat air. Pada uji
pengendapan garam, semua bahan uji mampu terendapkan setelah penambahan
amonium sulfat hingga larutan jenuh. Hal ini terjadi karena amonium sulfat memiliki
kelarutan yang tinggi daripada protein. Sehingga pada saat penambahan amonium
sulfat, amonium sulfat akan melarut dalam air atau pelarutnya dan mendesak protein
 keluar, kembali dalam bentuk solidnya sehingga terbentuklah protein yang
diendapkan.

Filtrat yang tersisa pada pengujian ini, kemudian diuji kembali dengan cara biuret dan
menghasilkan warna biru. Warna biru yang terbentuk menunjukkan bahwa masih ada protein
dalam larutan yang belum terendapkan, ini juga berarti masih ada protein dalam larutan yang
belum terendapkan sempurna dengan penambahan garam amonium sulfat tersebut.

H. Kesimpulan

I. Analisis Kualitatif Protein

a. Uji Millon
Susu dan tirosin memberikan hasil positif, dengan ditandai dengan
terbentuknya warna merah. Albumin, glisin dan triptophan memberikan
hasil negatif. Uji ini positif untuk protein yang memiliki molekul fenol
pada gugus R-nya.

b. Uji Hopkins-Cole
Susu, glisin dan triptophan memberikan hasil positif, sedangkan
albumin dan tirosin memberikan hasil negatif. Uji ini positif untuk larutan
protein yang mengandung triptophan.

c. Uji Ninhidrin
Susu dan tirosin memberikan uji positif ditandai dengan terbentuknya
warna ungu, sedangkan albumin, glisin dan triptophan memberikan uji
negatif. Uji ini positif untuk protein yang mengandung sedikitnya satu
gugus karboksil dan gugus amino bebas.

d. Uji Biuret
Albumin memberikan hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna
ungu, sedangkan susu, glisin, tirosin, dan triptophan memberikan hasil
 negatif. Uji ini positif ountuk senyawa yang mempunyai ikatan peptida
lebih dari satu.

Daftar Pustaka

Murrey, Robert K. 2002. Biokimia. Jakarta: Harper Ecg

Pujiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Gultom, Togu. 2002. Biokimia. Yogyakarta: FMIPA UNY

Togu Gultom dan Eddy S. 2010. Petunjuk Praktikum Biokimia. Yogyakarta: FMIPA UNY