Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Teknik Pewarnaan Ziehl-Neelsen Dapat

Mendiagnosis Paragonimiasis
saya nther Slesak1,2*, Saythong inthalad1,3, phadsana Basy3, dalafon Keomanivong3,
Ounheaun Phoutsavath3, Somchaivang Khampoui1, Aude Grosrenaud1, Vincent Amstutz1,
Hubert Barennes4, Yves Buisson4, Peter Odermatt5,6
1 Melayani Persaudaraan d'Entraide, Vientiane, Laos orang-orang Demokratis Republik (Laos PDR), 2 Tropenklinik Paul-Lechler-Krankenhaus, Tu¨ pesta, Jerman, 3
Luang Provinsi NamthaRumah Sakit, Luang Namtha, Republik Demokratik Rakyat Laos (Lao PDR), 4 Institut de la Francophonie pour la Me´decine Tropicale,
Vientiane, Republik Demokratik Rakyat Laos (Lao PDR), 5 Institut Tropis dan Kesehatan Masyarakat Swiss, Basel, Swiss, 6 Universitas Basel, Basel, Swiss

Abstrak
Latar belakang:Kami mengevaluasi teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZNS) untuk diagnosis paragonimiasis di Laos danmembandingkan m

Metodologi:Kami menerapkan pendekatan berikut: Kami (1) memeriksa dahak kasus indeks paragonimiasis dengan pemeriksaan langsun

Temuan Utama:paragonimustelur terlihat jelas pada sampel sputum WF dan ZNS dari kasus indeks. Mereka tampak kecoklatan-kemeraha

Kesimpulan / Signifikansi:paragonimustelur dapat dengan mudah dideteksi dalam ZNS slide dahak yang banyak digunakan saat ini. ZNSte

Kutipan: Slesak G, Inthalad S, Basy P, Keomanivong D, Phoutsavath O, dkk. (2011) Teknik Pewarnaan Ziehl-Neelsen Dapat Mendiagnosis Paragonimiasis. PLoS NeglTrop Dis 5(5
Editor: Banchob Sripa, Universitas Khon Kaen, Thailand
Diterima 28 September 2010; Diterima 14 April 2011; Diterbitkan 17 Mei 2011
Hak cipta:©2011 Slesak dkk. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah persyaratan Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distrib
Pendanaan: Investigasi khusus didanai oleh LSM Service Fraternel d'Entraide (SFE). Pewarnaan ZN standar dilakukan dan didanai dalam Program TB Nasional Laos yang didukun
Kepentingan yang Bersaing: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada kepentingan yang bersaing.
* Surel:
pengantar gejala yang mirip dengan tuberkulosis paru (TB), sering salah
didiagnosis dan diperlakukan sebagai TB sputum-negatif [2-5].
Paragonimiasis adalah trematodiasis bawaan makanandan Diagnosis standar di daerah endemik bergantung pada
zoonosis hadir di banyaknegara, terutama di Asia tropis dimana pemeriksaan dahak dengan mikroskop langsung dahak segar (wet
293 juta orang diperkirakan berisiko terinfeksi [1]. Menyebabkan film mount, WF) dan teknik konsentrasi seperti teknik konsentrasi
www.plosntds.org 1 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048
formalin-eter (FECT), serta pemeriksaan sampel tinja [3,6-9].
Pada tahun 1960, Sadun dan Buck melaporkan dari penelitian
mereka di Korea Selatan bahwa hanya puing-puing telur
Paragonimus yang ditemukan pada slide sputum yang diwarnai
Ziehl-Neelsen (ZNS) [7]. Sejak itu, telur Paragonimus
www.plosntds.org
diagnosis berdasarkan dahak ZNS telah ditinggalkan [4,5,9].
Sementara itu, bagaimanapun, ada banyak modifikasi dari teknik
ZNS [10], terutama penggunaan penghilang warna yang berbeda
seperti asam sulfat [11] dan asam klorida-alkohol
[9,12].Selanjutnya, durasi aplikasi panas yang berbeda selama
proses pewarnaan karbol-fuchsin telah diperkenalkan dan
diselidiki, mulai dari satu periode beberapa detik - seperti dalam
praktik saat ini [9,13] - hingga pemanasan terus menerus dari
slide selama beberapa menit. menit (misalnya 5 menit seperti
yang dijelaskan pada tahun 1976) [12]. Namun belum diketahui
modifikasi ZNS mana yang digunakan oleh Sadun dan Buck [7].
Selain itu, teknik WF memiliki potensi penularan TB, dan dengan
demikian menimbulkan bahaya keamanan hayati yang jelas.
Selanjutnya, kontrol kualitas WF selanjutnya yang andal tidak
dapat dilakukan setelah slide mengering. Dalam prakteknya
seringkali hanya
2 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis

Paragonimusdari pasien suspek TB. Slide ini disimpan di

Ringkasan Penulis
Cacing paru-paru (paragonimus) infeksi menyebabkan
gejala yang samatom untuk TB paru dan merupakan
diagnosis banding penting di daerah endemik.
Diagnosis standar adalah pemeriksaan mikroskopis
film basah (WF) dari sampel dahak. Selama lima
puluh tahun terakhir, noda Ziehl-Neelsen (ZNS)
diyakini dapat menghancurkanparagonimustelur.
Namun, penyelidikan kami terhadap slide ZNS yang
disimpan dan perbandingan prospektif kami dari film
basah, ZNS, dan teknik konsentrasi formalin-eterdahak
pasien batuk kronis di Laos menunjukkan bahwa
(1) mirip dengan film basah dan FECT,paragonimustelur
adalahhampir tidak terfragmentasi oleh ZNS; dan (2)
ZNS memiliki sensitivitas nominal yang lebih tinggi
untuk mendeteksiparagonimustelur dari WF dengan
biaya terendah. Pemeriksaan bagian sputum
berdarahmengungkapkan lebih banyak telur;
sementara di sisi lain, ZNS dengan pemanasan terus
menerus dari slide mengurangi jumlah telur
dibandingkan dengan teknik pemanasan saat ini.
Selanjutnya, ZNS juga harus diselidiki dengan lensa
106 untukparagonimus telur, di dalam tambahan ke
itu 1006 lensa untuk TBC,kemengurangi kesalahan

dipertimbangkan setelah pemeriksaan TB negatif pada saat

sampel dahak biasanya dibuang.
Republik Demokratik Rakyat Laos (Laos, Laos) adalah endemik
paragonimiasis dan TB [3,4,14-17]. Pada Mei 2009, seorang
petani lokal diperiksa di rumah sakit provinsi Luang Namtha (LN),
Laos Utara, dengan riwayat batuk dan hemoptisis selama empat
tahun. Analisis mikroskopis mengungkapkan jumlah telur
Paragonimus yang luar biasa tinggi pada pemeriksaan dahak
langsung, juga terdeteksi dengan jelas pada slide ZNS. Konfirmasi
mengejutkan dari analisis film basah oleh slide ZNS inilah yang
mendorong minat kami untuk mengevaluasi kembali sensitivitas
teknik ZNS saat ini untuk diagnosis paragonimiasis.
ItuTujuan dari penelitian kami adalah untuk mengevaluasi
prosedur ZNS sebagai alat diagnostik untuk paragonimiasis
dalam sampel sputum dibandingkan dengan berbagai teknik
diagnostik yang digunakan saat ini, yaitu WF dan FECT, dan untuk
membandingkan modifikasi historis dan terkini yang berbeda
dari teknik ZNS untuk mendeteksi Telur paragonimus.

Metode
Pemeriksaan kasus indeks paragonimiasis
Pada bulan Agustus 2009, kasus indeks paragonimiasis
didiagnosis melalui pemeriksaan dahak WF di RS Provinsi Luang
Namtha, Laos Utara. Dua sampel dahak diperiksa dengan empat
teknik diagnostik yang berbeda: (i) standar WF (2 slide WF, 1
slide per dahak) menggunakan perbesaran 406 dan 1006[9];
(ii) ZNS [11,13] (2 ZNS slide, 1 slide per sputum), dimana sampel
diperiksa dengan perbesaran 406, 1006, dan 10006; (iii)
pewarnaan auramine (2 slide AS, 1 slide per sputum)
menggunakan mikroskop fluoresensi dengan perbesaran 6006
[18];
(iv) pemeriksaan sampel dahak tambahan dengan dan tanpa
teknik konsentrasi pemutih, metode yang lebih baru yang akhir-
akhir ini disarankan untuk meningkatkan tingkat deteksi TB di
Laos [13].

Pemeriksaan slide bernoda Ziehl-Neelsen yang

diarsipkan
Kami memeriksa kembali slide ZNS untuk keberadaan telur

www.plosntds.o 3 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
laboratorium program tuberkulosis provinsi provinsi LN, Laos
Utara, dan provinsi Attapeu, Laos Selatan. Analisis dilakukan
oleh seorang teknisi/dokter laboratorium terlatih menggunakan
perbesaran 1006. Slide positif diperiksa ulang oleh teknisi
laboratorium kedua dan didokumentasikan foto.

Validitas teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk

mendeteksi
paragonimustelur
Kami mengumpulkan sampel dahak yang diambil pada dua
hari berturut-turut dari pasien dengan batuk kronis (.dua
minggu) di provinsi LN, dari September 2009 hingga April 2010,
menurut pedoman TB Laos [11]. Termasuk adalah pasien dari
desa kasus indeks (Phonthong), dan dari desa lain di mana
pasien sebelumnya terdeteksi atau diduga paragonimiasis.
Selanjutnya, kami mendaftarkan pasien batuk kronis dari rumah
sakit provinsi LN, dan rumah sakit distrik Vieng Phoukha dan
Muang Sing.
Satu slide dari setiap sampel dahak diperiksa menggunakan
WF, ZNS dan FECT. Dua teknisi laboratorium independen di
rumah sakit provinsi LN memeriksa setiap slide secara buta.
Teknisi tidak mengetahui identitas pasien dan hasil pemeriksaan
sebelumnya (slide berkode). Selain itu, mereka bekerja di
ruangan terpisah tanpa kemungkinan untuk berkomunikasi.
Slide diberi nomor acak dan disimpan dalam kotak tertutup
tanpa indikasi lebih lanjut sambil diberikan satu per satu kepada
teknisi. Jumlah telur Paragonimus yang terdeteksi per slide
dicatat dalam buklet terpisah. Salah satu dari kami (GS)
memastikan bahwa prosedur menyilaukan dihormati. Setelah
slide sumbang yang tidak menyilaukan diperiksa ulang, hasilnya
dikonfirmasi oleh teknisi laboratorium ketiga, dan telur yang
terdeteksi didokumentasikan.
Dari sampel sputum bernoda darah dengan bagian tidak
berdarah yang jelas, dibuat dua set slide WF dan ZNS; satu dari
bagian sputum yang berdarah dan satu dari bagian sputum yang
tidak berdarah (Gambar 1A).
Lebih banyak sampel dahak dimintadari telur Paragonimus-
positifpasien dan set sebanyak mungkin dilakukan dari: 1 film
basah, 1 ZNS menggunakan asam sulfat sebagai penghilang
warna [11,13], dan 1 ZNS menggunakan asam klorida-etanol
sebagai penghilang warna [9]. Selain itu, subsampel dahak
diproses menggunakan prosedur ZNS historis dengan
pemanasan terus menerus selama proses pewarnaan karbol-
fuchsin [12] (Gambar 1B).

Pernyataan etika
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika Nasional untuk
Penelitian Kesehatan, Kementerian Kesehatan, Vientiane, Laos
(No. 272/NECHR). Semua pasien diberi konseling dan diberikan
persetujuan tertulis sebelum pendaftaran. Dalam kasus deteksi
telur BTA atau Paragonimus, pasien dijelaskan temuannya dan
diobati sesuai dengan pedoman TB Laos [9,11]. Pasien dengan
dahak negatif dirujuk ke rumah sakit provinsi untuk diagnosis
dan pengobatan lebih lanjut. Semua pasien paragonimiasis
diobati dengan praziquantel (75 mg/kg/hari selama 3 hari)
sesuai standar internasional [4,14,16]. Pasien TB dirawat sesuai
dengan pedoman Program Pengendalian TB Nasional [11].

Prosedur laboratorium
Prosedur laboratorium dilakukan sesuai standar.Untuk
pemeriksaan langsung, sputum dipindahkan pada slide
mikroskopis, ditutup dengan cover slide, dan diperiksa dengan
perbesaran 1006 (106 objektif) [9]. Standar ''pewarnaan panas''
ZNS dilakukan sesuai dengan pedoman TB Laos

www.plosntds.o 4 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis

www.plosntds.o 5 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048


Gambar 1. Bagan alur studi penyelidikan prospektif teknik Ziehl-Neelsen. Pelajari diagram alir evaluasi teknik Ziehl-Neelsen untuk
mendiagnosisparagonimussp. telur di Luang Namtha, Laos, menggunakan sampel dahak pasien batuk kronis (A).Perbandingan prosedur
pewarnaan Ziehl-Neelsen yang berbeda dalam sampel positif telur (B).
doi:10.1371/journal.pntd.0001048.g001
[11] dengan asam sulfat sebagai penghilang warna dan hanya
dipanaskan sebentar (sampai mulai menguap) pada awal
pewarnaan karbol-fuchsin [13]. Slide ZNS lainnya terus
dipanaskan dan terus dikukus selama total lima menit dari proses
pewarnaan karbol-fuchsin [12]. Teknik ZNS lain yang digunakan
(bukan asam sulfat) alkohol asam untuk menghilangkan warna
slide [9]. Semua slide ZNS diperiksa dengan perbesaran 1006 (106
objektif) untuk telur Paragonimus dan dengan perbesaran 10006
(1006 objektif dengan minyak) untuk mengidentifikasi basil tahan
asam (BTA). Untuk FECT, sputum dihomogenkan dengan NaCl
0,9%, ditambahkan formalin 10%, dicampur dan disentrifugasi.
Supernatan dibuang, ditambahkan NaCl 0,9% dan eter, dicampur,
disentrifugasi, dan sedimen diperiksa seperti untuk pemeriksaan
langsung [9]. Pewarnaan auramin dan metode pemutih dilakukan
seperti yang dijelaskan oleh Trusov et al. [18] dan Ongkhammy
dkk. [13], masing-masing. Jumlah telur Paragonimus yang normal
dan terfragmentasi diidentifikasi dan dicatat per slide.
Analisis biaya
Perhitungan biaya rata-rata per slide termasuk biaya operasi
(waktu kerja, bahan kimia, bahan sekali pakai, listrik) tetapi tidak
biaya modal (peralatan laboratorium seperti centrifuge, vortex
mixer untuk FECT) dengan asumsi ketersediaannya di
laboratorium yang menawarkan ZNS. Waktu kerja diperkirakan
berdasarkan prosedur operasi standar yang digunakan; waktu
untuk mikroskop diasumsikan sama untuk semua teknik dan
tergantung pada pengalaman pemeriksa dan oleh karena itu
tidak disertakan. Biaya tahunan dihitung untuk jumlah sekitar
1000 sampel dahak yang diperiksa untuk TB di rumah sakit
provinsi LN dengan mempertimbangkan penghematan waktu
untuk pengujian sampel berkelompok.
Manajemen dan analisis data
Data dimasukkan dalam EpiData (versi 3.1, Asosiasi EpiData,
Odense, Denmark). Semua catatan diperiksa silang dengan
lembar data asli. Analisis statistik dilakukan dengan GraphPad
Instat dan QuickCalcs (GraphPad Software, California, USA).
Kesepakatan antara dua pembacaan dinilai dengan koefisien
Kappa (k) Cohen. Variabel kategori berpasangan dibandingkan
dengan menggunakan uji McNemar. Uji ranksum Wilcoxon dan
uji Friedman dilakukan untuk perbandingan dua dan tiga variabel
kontinu. Interval kepercayaan 95% (95% CI) dihitung untuk data
kontinu dan kategorikal. Diagnostik ''standar emas'' untuk
Paragonimus spp. infeksi didefinisikan sebagai deteksi setidaknya
satu Paragonimus spp. telur dalam salah satu pemeriksaan (tiga
teknik) per sampel dahak. Sensitivitas dan nilai prediksi negatif
(NPV),
Hasil
Pengamatan sputum kasus indeks
Pada slide sputum ZNS, telur Paragonimus muncul dalam
warna kecoklatan sampai kemerahan dengan sering satu atau
dua garis dalam cembung atau cekung menyerupai American
football kempes. Ciri-ciri khusus Paragonimus spp. telur terlihat
jelas seperti operculum dan bahu, dinding tebal dan bentuk tiga
dimensi (Gambar 2A-C). Slide bernoda auramine
www.plosntds.o
Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
menunjukkan telur yang jauh lebih sedikit tetapi serupa (7 dan 6
versus ZNS 47 dan 67, dan WF 146 dan 162 telur, Gambar 2D).
Fitur khusus Paragonimus terlihat jelas. Teknik konsentrasi
pemutih sebagian besar mengubah telur Paragonimus dalam
mikroskop langsung (Gambar 2E). Namun, semua telur tetap
dapat diidentifikasi dengan jelas dan 25 dari 117 telur yang
diamati (21,4%) tidak berubah. Telur yang tersisa entah kosong,
terfragmentasi atau memiliki opercula terbuka.
Ketika teknik konsentrasi pemutih dikombinasikan dengan ZNS
atau pewarnaan auramin, slide yang diwarnai lebih lanjut dengan
ZNS hanya mengungkapkan 4 telur. Ketika diwarnai lebih lanjut
dengan pewarnaan auramine, tidak ada satu telur pun yang
terdeteksi.
Pemeriksaan slide ZNS yang diarsipkan
Pada bulan Juni dan Juli 2009, kami memeriksa 211 slide ZNS
yang diproduksi antara Januari dan Maret 2009 untuk
mengetahui keberadaan telur Paragonimus. Para pasien
semuanya berasal dari lima kabupaten di provinsi Attapeu. Kami
mengidentifikasi telur Paragonimus dalam empat dari 211 slide
(1,9%). Slide milik empat pasien yang berbeda di mana diagnosis
paragonimiasis belum pernah dilakukan sebelumnya.
Pada Februari 2010, kami memeriksa, 52 slide ZNS yang
diproduksi antara Oktober dan Desember 2009 di rumah sakit
distrik Muang Sing, provinsi LN. Dalam dua slide ini (3,8%) kami
menemukan telur Paragonimus. Kedua slide milik pasien
paragonimiasis yang sudah didiagnosis.
Validitas teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk
mendeteksi
paragonimustelur dan mendiagnosis paragonimiasis
Kami mengidentifikasi 43 pasien dengan batuk kronis yang
kami daftarkan dalam penelitian ini (Gambar 1A). Secara total,
seratus sampel dahak diperoleh (rata-rata 2,3 sampel per pasien;
kisaran: 1-6). Lima belas sampel dahak mengandung darah
makroskopik. Dalam sepuluh sampel ini, bagian berdarah dapat
dibedakan dengan jelas dari bagian tidak berdarah yang
dilakukan set slide WF dan ZNS tambahan. Tiga belas dari seratus
sampel dari enam pasien memiliki telur Paragonimus setidaknya
dalam satu slide. Satu pasien tambahan dengan paragonimiasis
hanya didiagnosis pada sampel yang diperiksa di luar penelitian
tetapi tidak pada 2 sampel yang disertakan.
Usia, jenis kelamin, dan gejala pasien tidak berbeda kecuali
konsumsi kepiting mentah atau kurang matang sebelumnya (3
dari 7 pasien positif Paragonimus, 42,9%, vs 3 dari 36
Paragonimus
negatif pasien, 8.3%, p = 0,045, Meja 1).
Hasilpada validitas teknik diagnostik yang berbeda untuk
mengidentifikasi telur Paragonimus ditunjukkan pada Tabel 2.
Sensitivitas terendah di WF dan tertinggi di FECT.
Rerata jumlah telur Paragonimus per slide (eps) di WF (2,23
eps), ZNS (1,95 eps) dan FECT (4,95 eps) tidak berbeda secara
statistik (p = 0,34). Tingkat rata-rata setidaknya sebagian telur
terfragmentasi sangat bervariasi dari 18,3% (kisaran 0–50%) di
WF, 10,7% (0–100%) di FECT, dan 12,5% (0–100%) di ZNS
tetapi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p = 0,13).
Biaya operasional rata-rata per slide dihitung untuk bahan
habis pakai masing-masing sebesar 0,09 US$ dan 0,65 US$ untuk
WF dan FECT. Biaya tambahan untuk waktu kerja masing-masing
adalah 0,01 US$ (2 menit), dan 0,14 US$ (21 menit) untuk WF
6 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
dan FECT. Tidak ada biaya tambahan yang terjadi pada prosedur
pewarnaan ZNS. Secara keseluruhan, biaya tambahan tahunan
sebesar 100 US$ (25 jam) dan 692 US$ (200 jam) terjadi masing-
masing untuk WF dan FECT.
Lima belas sampel dahak mengandung darah makroskopik, di
antaranya:10 memiliki bagian berdarah dan tidak berdarah
(Gambar 1A). Delapan dari

www.plosntds.o 7 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis

Gambar 2. Penampilan mikroskopis dariparagonimustelur setelah teknik pewarnaan yang berbeda. Berwarna kecoklatan sampai
kemerahanparagonimustelur di dalam Ziehl-Neelsen bernoda dahak (106 objektif, 1006 pembesaran)(SEBUAH dan B). paragonimus telur di
dalam itu Ziehl-Neelsen bernoda dahak dengan 1006 objektif (10006 pembesaran) (C). auramin noda diperiksa oleh fluoresensi mikroskopi
dengan 606 objektif (6006 pembesaran)(D). Basah

www.plosntds.o 8 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis

slide setelah teknik konsentrasi pemutih (E); dari kiri ke kanan:paragonimustelur yang kosong, satu yang tampak tidak berubah, dan satu
telur tanpa operculum diperiksa dengan objektif 106 (perbesaran 1006).
doi:10.1371/journal.pntd.0001048.g002

sepuluh sampel ini milik pasien yang didiagnosis dengan paragon- penularan TB yang sudah ada di antara pekerja laboratorium di
imiasis. Slide yang dilakukan dari bagian berdarah sampel pasien negara berpenghasilan rendah yang tidak memiliki tindakan
paragonimiasis (8 WF, 8 ZNS) menunjukkan jumlah rata-rata pengendalian yang tepat.
telur yang lebih tinggi daripada dari daerah tanpa darah (3,3 eps,
kisaran 0–10 eps, 95%CI 1,3–5,4 versus 0,7 eps, kisaran 0–5 eps,
95%CI 0–1.4,
p = 0,016).
Perbandingan teknik ZNS yang berbeda dengan sampel
dahak tambahan (Gambar 1B, n = 27) mengungkapkan lebih
banyak telur per slide dalam ZNS standar (41,9 eps, 95% CI
5,5-78,3) dibandingkan denganteknik menggunakan
pemanasan terus menerus selama proses pewarnaan karbol-
fuchsin (29,3 eps, 95% CI 4,1–54.4, masing-masing n = 23, p =
0,01). Jumlah telur per slide yang terdeteksi dengan dua
penghilang warna yang berbeda tidak berbeda secara statistik
(asam sulfat:
24,7 eps, 95% CI 4,0–45,4 versus asam-alkohol: 29,7 eps, 95% CI
2,1–57,3, masing-masing n = 41, p = 0,51). Tingkat telur
terfragmentasi tidak berbeda antara teknik ZNS yang berbeda
(ZNS standar 1,3% (13 dari 964 telur) versus ZNS dengan
pemanasan terus menerus 1,9% (13 dari 673 telur, n = 23, p =
0,44); ZNS standar 1,5% (15 dari 1011 telur) versus ZNS dengan
penghilang warna alkohol asam 1,9% (23 dari 1217 telur, n = 41,
p = 0,52)).

Diskusi
Studi kami menunjukkan bahwa teknik ZNS yang saat ini
banyak digunakan untuk diagnosis AFB mampu mendeteksi telur
Paragonimus. Selanjutnya, kami memberikan bukti bahwa
sensitivitasnya bahkan mungkin lebih tinggi daripada teknik WF
yang merupakan teknik referensi parasitologis saat ini untuk
paragonimiasis dan kami menemukan bahwa FECT tampaknya
lebih unggul daripada WF untuk diagnosis paragonimiasis.
Namun, biaya yang terkait dengan teknik terakhir menyoroti
kelemahan FECT karena bahan teknis khusus dan waktu
tambahan diperlukan. Selain validitas dan biaya, masalah
keamanan harus dipertimbangkan. Prosedur kerja WF membuat
staf laboratorium terpapar agen yang berpotensi menular, yaitu
BTA. FECT mencakup pemanfaatan eter yang merupakan bahaya
tambahan yang tidak dapat diabaikan di laboratorium yang
menggunakan api terbuka untuk teknik ZNS.
Sadun dkk. 1960 [7] menjelaskan bahwa pada 20% kasus yang
didiagnosis secara mikroskopis dengan telur paragonimiasis paru
ditemukan hanya setelah banyak pemeriksaan langsung; dalam
satu kasus hanya setelah sampel yang diperiksa ke-27.
Pengulangan tes parasitologi langsung telah berhasil digunakan
untuk diagnosis infeksi trematoda lainnya; pemeriksaan slide
kedua dan ketiga telah meningkatkan kepositifan telur
Schistosoma mansoni dari 64,8 menjadi
74,3 dan 83,8% [19]. Hal ini menunjukkan bahwa pemeriksaan
sampel dahak lebih lanjut dengan teknik ZNS, yang menurut
pedoman TB nasional, bagaimanapun perlu dilakukan, mungkin
jauh lebih hemat biaya dan lebih tepat daripada berinvestasi
dalam metode yang lebih canggih seperti FECT. dengan tingkat
deteksi yang mungkin sedikit lebih tinggi.
Saat ini, pemeriksaan mikroskopis WF yang sederhana dan
murah masih menjadi pemeriksaan standar untuk paragonimiasis
di sebagian besar negara berkembang termasuk Laos [3,4,9,14-
16]. Namun, teknik ini memiliki beberapa kelemahan
dibandingkan dengan teknik ZNS: pertama, pemrosesan bahan
yang berpotensi menular dapat lebih meningkatkan risiko

www.plosntds.o 9 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
[20]. Kedua, kontrol kualitas oleh teknisi laboratorium lain sulit
karena slide cepat kering dan tidak dapat disimpan dan dibaca
ulang. Terakhir, dalam pekerjaan rutin di pelayanan kesehatan
paragonimiasis hanya dipertimbangkan bila pemeriksaan TB
negatif. Pada titik ini sampel dahak sudah dibuang, dan slide
lebih lanjut untuk diagnosis tidak dapat ditegakkan lagi.
Sebaliknya, slide ZNS direkam dan disimpan untuk kontrol
kualitas eksternal sesuai dengan kebijakan TB dan dapat ditinjau
nanti, tanpa masalah keamanan. Diagnosis yang berhasil dari
beberapa pasien dengan pemeriksaan ulang slide ZNS yang
diarsipkan menunjukkan bahwa telur Paragonimus diawetkan
pada slide ZNS. Pada tahap ini kita tidak tahu sampai kapan
telur-telur ini tetap terlihat. Namun, setiap telur yang
diidentifikasi dan kasus paragonimiasis yang terdeteksi
memberikan informasi tentang fokus penularan yang ada dan
tindak lanjut berbasis masyarakat dapat diluncurkan. Metode
ini berpotensi untuk diterapkan dalam penelitian epidemiologi
paragonimiasis, misalnya pendugaan prevalensi infeksi,
identifikasi daerah endemik dan lain-lain. Pemeriksaan serologis
menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi tetapi biasanya tidak
tersedia di negara berkembang. Lebih-lebih lagi, mereka
cenderung melebih-lebihkan tingkat infeksi karena
kemungkinan antibodi persisten dan reaksi silang dengan infeksi
cacing lainnya [21]. Diagnosis pasti paragonimiasis masih
dilakukan dengan ditemukannya telur cacing paru dalam
sputum, feses, atau jaringan toraks [21,22].
Lendir di ZNS dan pewarnaan auramin pada dahak
membantu menjaga telur tetap menempel pada kaca objek.
Selama teknik konsentrasi pemutih, lendir dan serat
diselesaikan [13]. Ini mungkin menjelaskan mengapa slide yang
diproses dengan ZNS setelah pemutihan hanya menghasilkan
sedikit telur Paragonimus.
Kami memulihkan jumlah telur yang lebih tinggi dari berdarah
dibandingkan denganbagian spesimen sputum yang tidak
berdarah. Ini terbukti menjadi cara sederhana untuk
meningkatkan kemungkinan pretest seperti yang disarankan
dalam buku teks umum [23]. Paru-paru yang terinfeksi
Paragonimus mengandung daerah nodular dengan nekrosis dan
banyak telur. Jaringan granulasi kaya perfusi yang berdekatan
adalah dasar untuk pneumonia hemoragik [6,24]. Pada daerah
endemik yang berpotensi paragonimiasis sebaiknya dilakukan
pemeriksaan langsung dari bagian sputum yang berdarah.
Satu pasien memiliki koinfeksi TB dan Paragonimus yang
menyoroti pentingnya prosedur diagnostik yang benar untuk
kedua penyakit. Integrasi pemeriksaan ZNS rutin untuk telur
Paragonimus dapat membantu menghindari kesalahan
diagnosis TB sputum-negatif karena Paragonimiasis [2-5] di
daerah endemik dan berkontribusi pada diagnosis koinfeksi
yang benar. Sedangkan untuk TB, diagnosis paragonimiasis
memerlukan pemeriksaan dahak berulang [7]. Dengan
demikian, teknik ZNS mewakili prosedur diagnostik umum yang
ideal.
Namun, mengapa Sadun dan Buck [7] hanya menemukan
puing-puing telur Paragonimus di ZNS? Teknik ZNS telah
berkembang selama beberapa dekade terakhir [9,10,12] yang
mungkin menjadi salah satu alasan mengapa telur Paragonimus
saat ini memang dapat ditemukan. Kami mendeteksi jumlah
telur yang jauh lebih rendah dalam slide yang terus menerus
dipanaskan selama proses pewarnaan karbol-fuchsin. Terbukti,
panas yang ekstensif dapat merusak protein dinding telur. Jenis
penghilang warna tidak mempengaruhi deteksi telur. Mungkin
ada faktor lain selama transportasi spesimen seperti paparan
sinar matahari, panas, dan goncangan yang bisa mengubah
telur dalam kasus Sadun dan Buck [7], sementara alasan lebih
lanjut mungkin dikaitkan dengan perbedaan spesies
Paragonimus. Korea endemik terutama untuk P. westermani
[25] sedangkan di Laos P. heterotremus adalah spesies utama
[3,
www.plosntds.o 1 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048
 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis

Tabel 1. Karakteristik peserta penelitian (n = 43) dari provinsi Luang Namtha, Laos.

paragonimustelur positif (n = 7)a paragonimustelur negatif (n = 36)

N (%) N (%)

Perempuan 4 (57.1) 15 (41.7)

Usia dalam tahun (95% CI) 32.6 (11.7–53.4) 41.2 (36,1–46,5)
Jumlah Desa 7 11
Jumlah Kecamatan 3 4
sputum BTA positif 1 (14.3) 2 (5.6)
Riwayat yang Dilaporkan:
Durasi batuk dalam bulan (95%CI) 29.1 (7.4–50.9) 19,5 (12,3–26,7)
Darah dalam dahak (ya) 6 (85.7) 22 (61.1)
Sputum kecoklatan (ya) 3 (42,9) 16 (44,4)
Episode demam (ya) 0 13 (36.1)
Keringat malam (ya) 2 (28,6) 11 (30.6)
Penurunan berat badan (ya) 3 (42,9) 22 (61.1)
Kehilangan nafsu makan (ya) 4 (57.1) 17 (47.2)
Konsumsi darikepiting mentah atau 3 (42,9) 3 (8.3)
kurang matang (ya) b

a: Termasuk 1 pasien yang 2 sampel sputumnya negatif tetapi memiliki telur Paragonimus dalam sampel yang diperiksa di luar penelitian.
B:
P = 0,045, semua lainnya
variabelhal.0,05. BTA: Basil tahan
asam.
doi:10.1371/journal.pntd.0001048.t001

Studi kami dibatasi oleh ukuran sampel yang agak rendah dan diagnosis untuk TB adalah kanker paru-paru yang bagaimanapun
dengan demikian perbedaan antara teknik diagnostik mungkin tetap menantang untuk rangkaian terbatas sumber daya [28] dan
diremehkan. Mungkin ada pasien paragonimiasis yang salah tidak dimasukkan karena di Laos diagnosis patohistologis
diklasifikasikan karena jumlah telur yang dikeluarkan rendah terbatas pada beberapa rumah sakit pusat dan sayangnya
atau bervariasi yang memerlukan pemeriksaan beberapa sampel pengobatan spesifik belum tersedia.
atau paragonimiasis ektopik [4,7,8] yang mungkin melemahkan Kesimpulannya, penelitian saat ini, berbeda dengan laporan
hasil kami. Kami tidak memasukkan sampel feses dalam sebelumnya, mendokumentasikan kegunaan dan validitas teknik
penyelidikan kami juga tidak menyelidiki lebih lanjut mikroskop ZNS untuk mendeteksi telur Paragonimus. Tampaknya memiliki
fluoresensi, konsentrasi pemutih, dan teknik ZNS dingin. Kami sensitivitas superior terhadap pemeriksaan mikroskopis WF
tidak menyelidiki bagaimana waktu dapat memengaruhi telur standar dan memiliki efektivitas biaya terbaik. Selanjutnya,
Paragonimus yang diperbaiki dalam slide ZNS yang disimpan. pemeriksaan ZNS untuk paragonimiasis tidak membawa risiko
Kami tidak mencatat waktu kerja individu yang digunakan per keamanan hayati dan memungkinkan kontrol kualitas pasca-tes
slide dan karena itu tidak dapat memberikan varians. Karena yang lebih baik. Selain penggunaannya untuk diagnosis TB, kami
mikroskop bergantung pada pengalaman pemeriksa, awalnya juga merekomendasikan pemeriksaan rutin untuk telur
mungkin dibutuhkan sedikit lebih lama ketika mikroskop ZNS Paragonimus setiap slide dengan lensa 106 (perbesaran 1006) di
perbesaran rendah diperkenalkan. wilayah geografis di mana paragonimiasis mungkin endemik.
Analisis efektivitas biaya kami tidak memperhitungkan biaya Integrasinya ke dalam prosedur diagnostik TB standar dapat
kapita dan kemungkinan perbedaan dalam tahun hidup yang membantu mengurangi kesalahan diagnosis TB sputum-negatif
disesuaikan dengan kualitas (QALYs) karena peningkatan risiko karena paragonimiasis dan dapat berkontribusi untuk
penularan TB di antara teknisi laboratorium yang keduanya menggambarkan daerah endemik untuk infeksi parasit yang
selanjutnya akan meningkatkan minimalisasi biaya oleh ZNS. terabaikan ini.
Diferensial penting lainnya

Tabel 2. Perbandingan statistik dari teknik diagnostik yang berbeda.

Kepekaan NPV Statistik Kappa

% (t/n) % (t/n) Nilai-P (McNemar's uji) (95%CI)

Formalin-EterKonsentrasi (n 84.6 (11/13) 97.8 (87/89) 0,48 0,89 (0,74–1,04)

= 100)
Ziehl-Neelsen (n = 100) 76,9 (10/13) 96,7 (87/90) 0,25 0,73 (0,47–0,99)
Film 61.5 (8/13) 94.6 (87/92) 0,074 1.00
basah
(n= 100)

www.plosntds.o 1 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048

 Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
NPV: nilai prediksi negatif.
CI: selang kepercayaan.
Sensitivitas dan nilai prediktif negatif (NPV) pemeriksaan satu slide untuk deteksi telur Paragonimus dalam sampel dahak (n = 100) pasien dengan kronis batuk.
doi:10.1371/journal.pntd.0001048.t002

www.plosntds.o 1 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048


ucapan terima kasih
Kami sangat berterima kasih kepada teknisi laboratorium Phoukham
Lorkhounkeo, Sounalin Amphengphai, Sonthiya Vixayphone, Lathi
Vilaysak dari Rumah Sakit Provinsi LN atas pewarnaan dan pemeriksaan
slide. Kami berterima kasih kepada tim SFE, yaitu Fongsi Cheualuangthan,
Phavalin Khounpanya, dan Malaythong Kounlavong atas kontribusi
organisasi dan entri data. Kami berterima kasih kepada Rose-Marie
Slesak karena telah memeriksa ulang entri data. Kami berterima kasih
kepada Somphou Sayasone atas nasihatnya yang berharga mengenai
teknik konsentrasi formalin-eter dan Marianne Brocqueville untuk
Referensi
1. Keizer J, Utzinger J (2009) trematodiases bawaan makanan. Clin Microbiol
Wahyu 22: 466–483.
2. Narain K, Devi KR, Mahanta J (2004) Paru paragonimiasis dan smear- TB
paru negatif: dilema diagnostik. Int J Tuberc Lung Dis 8: 621–622.
3. Odermatt P, Habe S, Manichanh S, Tran DS, Duong V, dkk. (2007)
Paragonimiasis dan inang perantaranya dalam fokus penularan di Republik
Demokratik Rakyat Laos. Acta Trop 103: 108–115.
4. Strobel M, Veasna D, Saykham M, Wei Z, Tran DS, dkk. (2005) La
paragoniomose pleuropulmonaire. Med Mal Infeksi 35: 476–481.
5. Belizario V, Guan M, Borja L, Ortega A, Leonardia W (1997) Paru-
paruparagonimiasisdan TBC di Sorsogon, Filipina. Kesehatan Masyarakat J Trop
Med Asia Tenggara 28 (Suppl 1): 37–45.
6. Bercovitz Z (1937) Studi klinis pada penyakit cacing paru-paru manusia
(hemoptisis endemik) yang disebabkan oleh infestasi Paragonimus
westermani. Am J Trop Med 17: 101-122.
7. Sadun EH, Buck AA (1960) Paragonimiasis di Korea Selatan - studi
imunodiagnostik, epidemiologi, klinis, roentgenologi dan terapeutik. Am J Trop
Med Hyg 9: 562–599.
8. Singh TS, Mutum SS, Razaque MA (1986) Paragonimiasis paru: gambaran
klinis, diagnosis dan pengobatan 39 kasus di Manipur. Trans R Soc Trop
Med Hyg 80: 967–971.
9. WHO (2003) Manual teknik dasar untuk laboratorium kesehatan. Edisi kedua.
Jenewa: WHO.
10. Uskup PJ, Neumann G (1970) Sejarah pewarnaan Ziehl-Neelsen. Tuberkel 51:
196-206.
11. Program Pengendalian Tuberkulosis Nasional (2004) Pengendalian
Tuberkulosis di Laos. Petunjuk Teknis 2003. Vientiane: Pusat Tuberkulosis
Nasional. Tersedia:http://www.directoryofngos.org/ngo_publications/ TB
%20Teknis%20Pedoman.pdf. Diakses pada 27 Maret 2011
12. Smithwick R (1976) Manual Laboratorium untuk Mikroskopi Cepat Asam. Edisi
kedua.Atlanta: CDC. Tersedia:http://www.scacm.org/divc/CDC%20TB
%20Manuals/Smithwick%20AFB%20Mikroskopi%201976.pdf.Diaksespada27Maret2011
13. Ongkhammy S, Amstutz V, Barennes H, Buisson Y (2009) Metode
pemutihmeningkatkan deteksi tuberkulosis paru di Laos. Int J Tuberc Lung Dis
13: 1124-1129.
14. Odermatt P, Nanthaphone S, Barennes H, Chanthavysouk K, Tran DS, dkk.
(2007) Meningkatkan tingkat deteksi kasus tuberkulosis dengan informan
awam
www.plosntds.o
Pewarnaan Ziehl-Neelsen untuk Diagnosis
dukungan teknis. Akhirnya, kami berterima kasih kepada Paul N. Newton
atas dukungannya dengan noda auramine dan Daniel Anderegg untuk
pengeditan bahasa Inggrisnya.
Kontribusi Penulis
Merancang dan merancang eksperimen: GS SI PB DK OP AG VA HB
YB PO. Melakukan percobaan: GS SI PB DK SK AG. Analisis data: GS
PO. Kontribusi reagen/bahan/alat analisis: GS PB DK SK AG.
Menulis makalah: GS SI HB PO.
kuesioner: pengalaman dari Republik Demokratik Rakyat Laos. Organ
Kesehatan Dunia Banteng 85: 727–731.
15. Odermatt P, Veasna D, Zhang W, Vannavong N, Phrommala S, Habe S et al
(2009) Identifikasi cepat fokus paragonimiasis oleh informan awam di Republik
Demokratik Rakyat Laos. PLoS Negl Trop Dis 3(9): e521.
16. Vidamaly S, Choumlivong K, Keolouangkhot V, Vannavong N, Kanpittaya
J,dkk. (2009) Paragonimiasis: penyebab umum efusi pleura persisten di Laos.
Trans R Soc Trop Med Hyg 103: 1019–1023.
17. Yahiro S, Habe S, Duong V, Odermatt P, Barennes H, dkk. (2008) Identifikasi
agen penyebab paragonimiasis manusia di Republik Demokratik Rakyat Laos. J
Parasitol 94: 1176-1177.
18. Trusov A, Bumgarner R, Valijev R, Chestnova R, Talevski S, dkk.
(2009)Perbandingan lampiran fluorescent LED Lumin, mikroskop fluorescent
dan Ziehl-Neelsen untuk diagnosis AFB. Int J Tuberc Lung Dis 13: 836–841.
19. Ruppel A, Idris MA, Sulaiman SM, Hilali AMH (1990) Schistosoma mansoni
diagnostik antigen (Sm 31/32): studi sero-epidemiologi di Sudan. Trop Med
Parasitol 41: 127-130.
20. Joshi R, Reingold AL, Menzies D, Pai M (2006) Tuberkulosis di antara petugas
kesehatan di negara berpenghasilan rendah dan menengah: tinjauan
sistematis. PLoS Med 3: e494.
21. Yoonuan T, Vanvanitchai Y, Dekumyoy P, Komalamisra C, Kojima S, dkk. (2008)
Prevalensi paragonimiasis di Provinsi Saraburi, Thailand, diukur dalam jarak 20
tahun. Kesehatan Masyarakat J Trop Med Asia Tenggara 39: 593–600.
22. Kuzucu A (2006) Penyakit parasit pada saluran pernapasan. Curr Opin Pulm
Med 12: 212–221.
23. Garcia LS (2001) Diagnostik Medis Parasitologi. Washington DC: ASM Press.
24. Boe´ DM, Schwarz MI (2007) Seorang pria 31 tahun dengan batuk kronis dan
hemoptisis. Dada 132: 721–726.
25. Cho SY, Kong Y, Kang SY (1997) Epidemiologi paragonimiasis di Korea.
Kesehatan Masyarakat J Trop Med Asia Tenggara 28 (Suppl 1): 32–36.
26. Blair D, Xu ZB, Agatsuma T (1999) Paragonimiasis dan genus Paragonimus. Adv
Parasitol 42: 113–222.
27. Dekumyoy P, Waikagul J, Eom KS (1998) Cacing paru-paru manusia
Paragonimus heterotremus: diagnosis banding antara infeksi Paragonimus
heterotremus dan Paragonimus westermani oleh EITB. Kesehatan Trop Med
Int 3: 52–56.
28. Macbeth FR, Abratt RP, Cho KH, Stephens RJ, Jeremic B (2007) Kanker paru-
parumanajemen dipengaturan sumber daya yang terbatas: pedoman untuk
perawatan yang baik yang tepat. Radiother Oncol 82: 123–31.
1 Mei 2011 | Jilid 5 | Edisi 5 | e1048