UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL

CAMPUS DE PATOS-PB
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

MONOGRAFIA

Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina

pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR).

Elane Maria Camboim Lustosa

2010
 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
CAMPUS DE PATOS-PB
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

MONOGRAFIA

Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose canina

pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR).

Elane Maria Camboim Lustosa

Graduanda

Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo

Orientadora

Patos, PB
Abril de 2010
 2

FICHA CATALOGADA NA BIBLIOTECA SETORIAL DO CAMPUS DE PATOS -

UFCG

L972a
2010 Lustosa, Elane Maria Camboim.
Avaliação do sangue total e suas frações no diagnóstico de erliquiose
canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR) /
Elane, Maria Camboim Lustosa. - Patos - PB: CSTR, UFCG, 2010.
41p.
Inclui bibliografia.
Orientadora: Márcia Almeida de Melo
Monografia (Graduação em Medicina Veterinária) – Centro de
Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande.
1 – Diagnóstico Laboratorial - Monografia. 2 – Erliquiose – cão. - I –
Título.

CDU: 616-074
 3

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
CAMPUS DE PATOS-PB
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

ELANE MARIA CAMBOIM LUSTOSA

Graduanda

Monografia submetida ao curso de Medicina Veterinária como requisito parcial para

obtenção do grau de Médica Veterinária

APROVADO EM ....../....../........ MÉDIA: ________

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Marcia Almeida de Melo

ORIENTADORA

Prof. Dr. Adriano Fernandes Ferreira

EXAMINADOR

Profª. Drª. Rosângela Maria Nunes da Silva

EXAMINADOR
 4

“A Deus, meu amor supremo, ao meu pai Diral (in

memorian) a quem eu amei e dediquei a minha
vida; a minha mãe Salete que tenho um amor
imensurável e ao meu noivo Abraão Lyncolly amor
da minha vida por tornar meus dias mais felizes,
dedico.”
 5

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo seu amor, proteção, misericórdia e bondade sobre mim desde que nasci, por
permitir que eu chegasse até aqui, me dando força para suportar as perdas da vida e os
obstáculos, não me deixando desistir nem enfraquecer, colocando-me em seus braços,
curando minhas feridas, sendo meu amigo nos momentos de aflição em que eu me senti
sozinha, colocando em meu caminho pessoas especiais para realizar em mim a sua obra. A
ti meu amado Deus, a minha eterna gratidão e adoração.

A meu pai (in memorian) pela sua dedicação a minha vida, por seu amor incondicional aos
seus filhos, por todos os esforços sem medida durante sua vida para a nossa criação, por
sua vontade de me ver vencer, por todos os ensinamentos deixados em minha memória.
Saudades!

À minha mãe por todo amor e dedicação que foram essenciais me servindo de base nos
momentos difíceis, contribuindo para o meu crescimento pessoal e por toda sua
preocupação em me ver feliz.

Aos meus irmãos Edvânia e Ewerton, meus cunhados Geovannio e Renata, por todo
carinho e atenção e força nesta caminhada, me estimulando a seguir em frente e não
desistir nas horas difíceis, a todos eles a minha gratidão.

Ao meu grande amor Abraão Lyncolly pela sua presença constante em todos os momentos
desde que nos conhecemos, sua dedicação, amor, carinho, cuidado, compreensão, exemplo,
que me ensinou o verdadeiro sentido do amor.

A minha família paterna, em especial minha avó Leca que é até hoje a minha referência, e
aos meus tios Edilbelto (in memorian), Edilênia, Edmone e Edilpia a quem devo meus
verdadeiros valores de vida.

A minha família materna: minha avó Maria José, meus tios Naldo, Antônio, Sebastião,
França, Fátima, em especial Lúcia, que sempre me apoiaram e torceram por mim.

À família do meu noivo Lyncolly que considero minha nova família: Diassis e
Auxiliadora, meus sogros, a quem tenho grande admiração, meus cunhados Adão, Andrei,
Jaciara e Juliermson seu esposo pela amizade, apoio e carinho que sempre tiveram por
mim.

A minha orientadora Profª Drª. Marcia Melo e ao seu esposo Prof. Dr. Paulo de Andrade e
ao Fauzinho (alegria do laboratório) por todos os ensinamentos profissionais e pessoais,
pela amizade, apoio, acolhimento, por terem acreditado na minha capacidade, e por todo
exemplo que são para mim. Vocês foram fundamentais em minha vida.

A Tereza Emanulle que foi peça fundamental, trabalhando comigo em todos os momentos
deste estudo, partilhando seus conhecimentos, sendo acima de tudo amiga, sem a sua
presença não seria possível à realização deste trabalho.
 6

A toda equipe do laboratório (Aline, Tereza, Expedito, Arthur, Kamila, Gilzane e

Maurina), pela amizade construída, pela troca de ensinamentos e por todos os dias em que
compartilhamos com alegria trabalhando juntos.

As todas as minhas primas em especial as mais presentes em minha vida Savanna e

Clarissa, obrigada por todo apoio e amizade que vocês têm a mim.

A todos os meus colegas de veterinária da turma 2010.1, a cada um em particular pela

convivência de cinco anos, formando uma nova família que será guardada no meu coração
para sempre, em especial Giulianna que sempre esteve em meu coração e a Gilzane ao
verdadeiro laço de amizade que surgiu entre nós, por tudo que ela me ensinou como pessoa
e o sentimento sincero que ela extraiu dentro de mim; a Andréa que sempre estudou
comigo desde ainda criança mantendo a mesma amizade e consideração; a Siduane e
Maurina que me conquistaram com suas amizades.

As minhas amigas Claúdia, Rachel, Karla, Nanita, Verônica, Katyany e Herta que desde
sempre estiveram presentes seja por um telefonema ou visita, nunca perdendo o contato,
estando nos momentos mais precisos, me escutando, me aconselhando, torcendo sempre
por mim.

A todos do Centro Médico Veterinário (Dr. Leonardo, sua esposa Sibele, Drª. Aline, Diná,
Rodrigo e Ramon), pela amizade, acolhimento, confiança e ensinamentos contribuindo
para a minha vida profissional.

A todos os professores da Medicina Veterinária que deixaram não só ensinamentos

profissionais, mas principalmente ensinamentos para vida.

A todos os funcionários que direta ou indiretamente foram essenciais nesta etapa da minha
vida, em especial Tereza e Damião.

Ao professor Sérgio pelo apoio na análise estatística, se disponibilizando em todas as vezes

que lhe procurava para tirar uma dúvida.

Aos professores Dr. Adriano Ferreira e Drª. Rosângela Maria que participaram da banca
examinadora, mesmo não tendo sido meus professores durante o curso teve maior respeito
e cuidado na avaliação do meu trabalho.

A todos que participaram desta etapa da minha vida direta e indiretamente me apoiando e
acreditando na minha capacidade.
 7

SUMÁRIO

Pág
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 14
2.1 Etiologia...................................................................................................... 14
2.2 Histórico...................................................................................................... 14
2.3 Taxonomia.................................................................................................. 15
2.4 Epidemiologia............................................................................................. 16
2.5 Principais espécies que acometem o cão..................................................... 17
2.5.1 Ehrlichia ewingii (EGC)............................................................... 17
2.5.2. Ehrlichia platys (ETC)................................................................ 18
2.5.3. Ehrlichia canis (EMC)................................................................ 18
2.6 Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis............. 19
2.7 Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia... 21
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 24
4.1 Local de Execução...................................................................................... 24
4.2 Amostras de Ehrlichias............................................................................... 24
4.3 Esfregaço Sanguíneo................................................................................... 25
4.4 Extração do DNA........................................................................................ 25
4.5 Nested PCR................................................................................................. 26
4.6 Análise Estatística....................................................................................... 27
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 28
7 CONCLUSÃO...................................................................................................... 33
8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA................................................................... 34
 8

LISTA DE FIGURAS

Pág
Figura 1 - Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães 22
positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma
platys..........................................................................................................................
Figura 2 - SepCell:LGC – Reagente para isolamento in vitro de linfócitos............. 25
Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose apresentando os resultados da nested 30
PCR para detecção do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis..................
 9

LISTA DE TABELAS

Pág
Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, 16
Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e
hospedeiros........................................................................................................................................
Tabela 2. Sequência de primers selecionados para amplificação do fragmento do 27
gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia, pela reação em cadeia da polimerase em
nested (nested PCR)...................................................................................................
Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações 28
sanguíneas das amostras do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais
de Erliquiose................................................................................................................
Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço 29
sanguíneo na detecção de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de
hemoparasitoses...........................................................................................................
Tabela 5. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de mononucleares 31
(M) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica............
Tabela 6. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de granulócitos 31
(G) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.............
Tabela 7. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e papa leucocitária 31
(PL) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica...........
Tabela 8. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e coágulo de sangue 32
(CS) no diagnóstico de Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica...........
 10

RESUMO

LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Avaliação do sangue total e suas frações no

diagnóstico de erliquiose canina pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested
PCR). Patos, UFCG. 2010, 41 p. (Monografia de conclusão do Curso de Medicina
Veterinária).

A erliquiose é uma hemoparasitose distribuída mundialmente e transmitida por carrapatos

aos cães. Em cães, tem como agentes etiológicos a Ehrlichia spp. e a Anaplasma platys,
que formam corpúsculos de inclusão denominados de mórulas. Em função do baixo custo,
a visualização das inclusões em esfregaço sanguíneo é utilizada como diagnóstico de
rotina, mas a sensibilidade é baixa. O sangue é utilizado como fonte de ácido
desoxirribonucléico (DNA) para a reação em cadeia da polimerase (PCR), mas apesar das
espécies infectarem várias células, não há avaliação do uso de frações celulares sanguíneas
na tentativa de aumentar a sensibilidade da técnica. Desta forma, este trabalho objetivou
avaliar o aumento da sensibilidade da nested PCR no diagnóstico de erliquiose canina com
DNA proveniente de diferentes frações sanguíneas. Foram utilizadas amostras de sangue
de 22 cães com sintomatologia clínica sugestiva de erliquiose, provenientes da rotina
médica dos Hospitais Veterinários da Universidade Federal Rural de Pernambuco
(UFRPE), da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e do Centro Médico Dr.
Leonardo Torres, localizados nos municípios de Recife (PE) e Patos (PB). O DNA foi
extraído de sangue total (ST), granulócitos (G), mononucleares (M), papa leucocitária (PL)
e coágulo sanguíneo (CS). A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela
nested PCR de ST foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram
negativas. Entre os 15 positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia canis e
apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. Entre as 14 (63,6%) amostras negativas no
esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram falso negativas, apresentando-se positivas na
nested PCR de ST. Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de
PCR, não sendo possível identificar a espécie. Quando o resultado do sangue total foi
comparado com os das frações de M e PL, a sensibilidade foi de 42,86% e de 21,43% e
33,33% com as frações de G e C, respectivamente. O sangue total é a melhor fonte de
DNA para o diagnóstico de Ehrlichia pela nested PCR. Ressalta-se que essa é a primeira
evidência molecular do envolvimento de Anaplasma platys em infecção de cães no Estado
da Paraíba.

Palavras-chaves: sangue, riquétsias, diagnóstico molecular, Nordeste, Brasil .

 11

ABSTRACT

LUSTOSA, ELANE MARIA CAMBOIM. Evaluation of blood cell fractions in the

diagnosis of canine ehrlichiosis by nested PCR (Polymerase Chain Reaction). Patos,
UFCG. 2010, 41 p. (Monograph of the Course of Veterinary Medicine).

Erlichiosis is a worldwide disease transmitted by ticks to dogs. The disease is caused by

Ehrlichia spp. and Anaplasma platys, which form inclusion bodies called morulae. Due to
the low cost, the identification of inclusion on blood smear is used as a routine diagnosis,
but the sensitivity is low. Blood is used as source of DNA for PCR, but despite leukocytes
be infected by different species, there is no evaluation about the use of blood cell fractions
in an attempt to increase the sensitivity. Thus, this study aimed to evaluate the nested PCR
sensitivity in the diagnosis of canine ehrlichiosis with DNA from different blood cell
fractions. The samples were collected from 22 dogs with ehrlichiosis suggestive signs. The
animals were treated at the Veterinary Teaching Hospitals, Universidade Federal Rural de
Pernambuco (UFRPE) and Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), and at the
Veterinary Medical Center Dr. Leonardo Torres, in Recife (PE) and Patos (PB). DNA was
extracted from whole blood (WB), granulocytes (G), mononuclear cells (M), buffy coat
(BCT) and blood clot (BCL). Ehrlichia and / or Anaplasma DNA was amplified in ST in
15/21 (71.4%) samples. Ehrlichia canis DNA was amplified in 7 (46.4%) animals and 1
(6.6%) for Anaplasma platys. Among 14 (63.6%) negative smears samples, 8 (57.15%)
were false negative, but presented positive results in ST nested PCR. There was no
amplification in the second PCR reaction in 7 (46.6%) samples. When whole blood result
was compared with M and BCT fractions, the sensitivities were 42.86% and 21.43%,
respectively, and 33.33% to G and C fractions. Whole blood (WB) is the best DNA source
for diagnosis of Ehrlichia by nested PCR. It is worth noting that this is the first molecular
evidence of the involvement of Anaplasma platys infection in dogs at the State of Paraiba.

Key words: blood, rickettsiae, molecular diagnostic, Northeast, Brazil.

 12

1 INTRODUÇÃO

A erliquiose é uma enfermidade infecciosa ocorrida em animais domésticos e

silvestres, podendo acometer o homem. Tem como agente etiológico a Ehrlichia spp.,
bactéria gram-negativa, intracelular obrigatória dos leucócitos ou trombócitos.
Trata-se de uma hemoparasitose distribuída no mundo inteiro, principalmente
em países tropicais e subtropicais, transmitida entre os cães com mais freqüência pelo
carrapato Rhipicephalus sanguineus.
A doença se caracteriza por diferentes alterações clínicas e hematológicas,
compreendendo as fases: aguda, subclínica e crônica. Sendo os sinais mais comuns febre,
apatia e anorexia, associados à trombocitopenia, anemia e leucopenia.
O diagnóstico definitivo da erliquiose tem sido baseado na combinação de
sinais clínicos, achados hematológicos e exames laboratoriais. O esfregaço de sangue e
papa leucocitária é a técnica mais utilizada na rotina clínica que identifica mórulas de
Ehrlichia. Essas espécies são de difícil detecção devido à curta parasitemia, que são vistas
com mais freqüência apenas no estágio agudo da doença, podendo induzir resultados falsos
negativos, além de parasitar diversos tipos de células, confundindo a espécie demonstrada,
mesmo tendo predileção por algumas espécies.
Outros métodos, como ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), reação de
imunofluorescência indireta (RIFI), western blothing, cultivo em células, reação em cadeia
da polimerase (PCR) e a reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR), têm sido
utilizados para detectar Ehrlichia spp..
A sorologia é bastante utilizada nos hospitais veterinários, porém testes
sorológicos podem apresentar resultados falsos positivos, devido à presença de anticorpos
que podem permanecer por muito tempo no organismo do animal, mesmo o agente tendo
sido eliminado.
A PCR tem apresentado maior sensibilidade e especificidade quando utilizada
como diagnóstico para Ehrlichia, pois permite determinar a presença de co-infecção por
duas ou mais espécies. No entanto a nested PCR tem melhorado a especificidade e a
eficiência da reação, pois a mesma diferencia as espécies de Ehrlichia spp..
Tecidos como sangue venoso e periférico, medula óssea, baço, fígado, rim e
linfonodos têm sido avaliados em vários estudos na perspectiva de descobrir a melhor
amostra para demonstrar Ehrlichia através de técnicas moleculares.
 13

Tendo em vista que não existem estudos anteriores que avaliem frações
sanguíneas qualificando a melhor fonte de ácido desoxirribonucléico (DNA) para se
diagnosticar as diferentes espécies de Ehrlichia, e que atualmente técnicas moleculares têm
sido mais eficientes no diagnóstico de erliquiose é que se realizou através deste trabalho
um estudo que avalia o sangue total e suas frações (sangue total, papa leucocitária,
granulócito e coágulo de sangue) pela nested PCR a fim de identificar em qual destas, o
DNA de Ehrlichia pode ser mais facilmente detectado, facilitando assim o diagnóstico da
doença, além de comparar a nested PCR ao esfregaço sanguíneo, confirmando a baixa
sensibilidade da segunda técnica vista em estudos anteriores.
 14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Etiologia

As erliquioses caninas figuram entre as mais graves doenças infecciosas que

acometem os cães, causadas por bactérias do gênero Ehrlichia, principalmente pela espécie
Ehrlichia canis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (DUMLER et al.,
2001).
Erlíquias são bactérias gram negativas, organismos cocóides a elipsoidais imóveis,
que podem ser encontradas isoladas ou em colônias denominadas mórulas. Parasitam
obrigatoriamente as células hematopoiéticas maduras ou imaturas, em especial as do
sistema fagocitário mononuclear, tais como monócitos e macrófagos e, para algumas
espécies, em células mielóides, como neutrófilos (DUMLER et al., 2001; BRITO, 2006).

2.2 Histórico

A primeira espécie Rickettsia canis foi descrita em um cão Pastor Alemão, na

Argélia, por Donatien e Lestoquard, em 1935, reclassificada como Ehrlichia canis, em
1945, por Mashkovsky. Primeiro caso de erliquiose canina descrito nas Américas, na
região das Antilhas Holandesas foi descrito em 1957, associado à Babesia canis
(ALMOSNY, 2002; MACHADO, 2004).
A década de 60 foi marcada por uma doença em cães de etiologia desconhecida
caracterizada por hemorragia severa, que recebeu vários nomes, entre eles o de
Pancitopenia tropical canina, abrangendo países como Singapura (1960), Estados Unidos
(1963 e 1969) e Inglaterra (1968); no entanto, esta enfermidade só foi estabelecida como
causada por Ehrlichia canis no final da mesma década (ALMOSNY, 2002; ETTINGER &
FELDMAN, 2004). Somente na década de 1980, com o reconhecimento da erliquiose
como possível doença zoonótica fatal, intensificou-se as pesquisas para caracterização do
organismo e definição da patofisiologia do agente (COHN, 2003; PADDOCK & CHILDS,
2003).
O primeiro caso de erliquiose canina no Brasil foi descrito em Belo Horizonte-MG,
por Costa et al., em 1973, e logo após em várias cidades como Rio de Janeiro-RJ, Santa
Maria-RS e Curitiba-PR (ALMOSNY, 2002). As espécies descritas no Brasil até o
 15

momento são Ehrlichia canis e Anaplasma platys (AGUIAR et al., 2007; RAMOS et al.,
2009).

2.3 Taxonomia

A erliquiose é uma doença causada por bactérias pertencentes à ordem

Rickettsiales, família Anaplasmataceae e gêneros Ehrlichia e Anaplasma (DUMLER et al.,
2001).
A diferenciação entre as espécies parasitas foi primeiramente baseada no tipo de
célula parasitada, distribuição geográfica e severidade da doença; mais tarde esta
classificação entrou em conflito com o esquema de genogrupos: através dos métodos
moleculares de identificação, três genogrupos foram caraterizados em Ehrlichia canis (I),
Ehrlichia phagocytophila (II) e Ehrlichia sennetsu (III). O genogrupo Ehrlichia canis
inclui Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e a Cowdria ruminantium;
o genogrupo Ehrlichia phagocytophila compreende erlíquias como a Ehrlichia equi,
Ehrlichia platys e o agente da erliquiose granulocítica humana; e o genogrupo Ehrlichia
sennetsu consiste em Ehrlichia risticii e Neorickettsia helminthoeca (ALMOSNY, 2002;
ETTINGER & FELDMAN, 2004).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de seqüenciamentos genéticos de
espécies encontradas em várias regiões do mundo permitiu novos agrupamentos e
classificações taxonômicas das erlíquias (DAGNONE et al., 2001). A classificação foi
então modificada reorganizando o gênero Ehrlichia em outros gêneros, tendo como base
análises do ácido desoxirribonucleico (DNA) dos parasitos (DUMLER et al., 2001).
Conforme a reclassificação realizada, o genogrupo 1 manteve o nome genérico
Ehrlichia, enquanto membros do genogrupo 2 mudaram de Ehrlichia para Anaplasma, e
membros do genogrupo 3 tornaram-se Neorickettsia (MACHADO, 2004).
As espécies dentro do gênero Ehrlichia foram divididas em formas monocíticas
(Ehrlichia canis, Ehrlichia risticii), granulocíticas (Ehrlichia ewingii e Ehrlichia equi) e
trombocíticas (Anaplasma platys), embora essa divisão demonstre limitações, pois a
infecção por uma espécie pode ocorrer em mais de um tipo celular (COHN, 2003).
A classificação definitiva das erlíquias foi baseada no sequenciamento do gene 16S
do RNA ribossômico (DAGNONE et al., 2001). Algumas espécies do gênero Ehrlichia,
 16

Anaplasma e Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros principais são
demonstradas na Tabela 1 de acordo com a classificação modificada.

Tabela 1. Esquema de classificação antiga e atual das principais espécies do gênero Ehrlichia, Anaplasma e
Neorickettsia com suas respectivas células alvos e hospedeiros.
Classificação antiga Classificação atual Células Alvo Hospedeiros
Principais
Genogrupo I
Ehrlichia canis Ehrlichia canis Mononucleares Caninos
Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia chaffeensis Mononucleares Humanos
Ehrlichia ewingii Ehrlichia ewingii Granulócitos Caninos
Cowdria ruminatium Ehrlichia ruminatium Endoteliais Ruminantes

Genogrupo II
Ehrlichia phagocytophila Anaplasma phagocytophila Granulócitos Ruminantes
Ehrlichia equi Anaplasma phagocytophila Granulócitos Equídeos
Erliquiose Granulocítia Anaplasma phagocytophila Granulócitos Humanos
Humana (EGH)
Ehrlichia platys Anaplasma platys Plaquetas Caninos

Genogrupo III
Ehrlichia sennetsu Neorickettsia sennetsu Mononucleares Humanos
Ehrlichia risticii Neorickettsia risticii Mononucleares Equídeos
Neorickettia helminthoeca Neorickettia helminthoeca Mononucleares Cães

Fonte: Dagnone et al. (2001); Dumler et al. (2001); Almosny (2002); Quinn et al. (2005); Silva et al. (2009).

2.4 Epidemiologia

As espécies de erlíquias, com exceção dos patógenos humanos Ehrlichia chaffensis

e Ehrlichia sennetsu, são patógenos de animais domésticos e selvagens (QUINN et al,
2005).
A erliquiose é relatada em grande parte das regiões tropicais e subtropicais de todo
o mundo, sua distribuição está relacionada à presença do carrapato vetor, Rhipicephalus
sanguíneus, o carrapato castanho do cão. Esta espécie é de grande importância por ser
cosmopolita, tendo como hospedeiros vertebrados mais comuns os membros da família
Canidae (cães, coiotes, raposa e chacal) (GROVES et al., 1975; DAGNONE et al., 2001;
ETTINGER & FELDMAN, 2004).
Cães de qualquer faixa etária podem ser infectados, porém algumas raças são mais
susceptíveis à doença, incluindo aquelas que vivem em áreas endêmicas e as que são
transportadas para estas regiões (NYINDO et al., 1980; RIKIHISA et al., 1994;
DAGNONE et al., 2001; MYLONAKIS et al., 2004).
 17

No Brasil, há relatos de várias espécies de carrapatos parasitando os cães, no

entanto, a ocorrência dessas espécies é resultante das características epidemiológicas
particulares de cada região e do ambiente em que são criados, pois a maioria dos carrapatos
encontrados em cães urbanos pertence à espécie Rhipicephalus sanguíneus. Já os cães
criados em áreas rurais ou suburbanas, podem ser infestados por várias espécies de
carrapatos, pertencentes ao gênero Amblyoma (LABRUNA & PEREIRA, 2001).
O gênero Ehrlichia atualmente compreende cinco espécies válidas: Ehrlichia
canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e Ehrlichia ruminantium
(DUMLER et al., 2001).

2.5 Principais espécies que acometem o cão

Três principais espécies estão envolvidas na ocorrência da erliquiose canina: a

Ehrlichia ewingii agente etiológico da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC), a
Anaplasma platys causador da Erliquiose Trombocítica Canina (ETC), e a Ehrlichia canis
determinante da Erliquiose Monocítica Canina (EMC) (HARVEY et al., 1978; FRENCH
et al., 1983; ALMOSNY, 2002).

2.5.1 Ehrlichia ewingii

Infecta granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) e é um dos dois agentes
erliquiais conhecidos por causar infecção granulocítica em cães. É supostamente
transmitida pelo carrapato Amblyomma americanus e certamente pelo Rhipicephalus
sanguineus (GOLDMAN et al., 1998; DAGNONE et al., 2001; ALMOSNY, 2002).
Foi relatada em 1985, como causadora da erliquiose granulocítica canina, após
a observação da mórula em granulócitos de cães com poliartrite aguda (ALMOSNY,
2002).
A EGC produz uma infecção subclínica causando febre, anormalidades
hematológicas (trombocitopenia, neutropenia e linfocitose) entre 18 e 24 dias de infecção,
além de causar claudicação e edema articular, podendo ser uma doença moderada a grave
(STOCKHAM et al., 1990; EGENVALL et al, 1997; ALMOSNY, 2002).
Através da análise da seqüência do gene 16S RNA ribossômico, a Ehrlichia
ewingii apresenta grande semelhança genética com o Anaplasma phagocytophilum agente
 18

da erliquiose granulocítica humana e com a Ehrlichia phagocytophila (ANDERSON et al.,

1991; CHEN et al., 1994; CHAE et al., 2000).
Testes laboratoriais revelaram a possibilidade de co-infecção de Ehrlichia
ewingii, Ehrlichia equi e Ehrlichia canis ou ocorrência de reação cruzada entre elas em
testes diagnósticos (STOCKHAM et al., 1990).

2.5.2 Anaplasma platys

O agente etiológico da erliquiose trombocítica canina é a Anaplasma platys
(HARVEY et al., 1978; FRENCH et al., 1983). De acordo com Hoskins (1991) Anaplasma
platys multiplica-se apenas em plaquetas de cães; no entanto Dagnone et al. (2001)
informou que essa Rickettsia infecta as plaquetas do cão, podendo eventualmente infectar
também os leucócitos.
Suspeita-se que Anaplasma platys seja transmitida entre cães, principalmente
pelo Rhipicephalus sanguineus, pois infecções concomitantes de Ehrlichia canis e
Ehrlichia platys são comuns (HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002; SANOGO et al.,
2003).
Os cães acometidos pela Anaplasma platys apresentam sinais clínicos após um
período de incubação de 8 a 15 dias, apresentando sinais digestivos e distúrbios
hemostáticos, (BEUAFILS, 1999 apud DAGNONE et al., 2001).
A ETC, também é conhecida como trombocitopenia cíclica canina por
apresentar trombocitopenia cíclica com parasitemia inicial, que tendem a ocorrer
periodicamente em intervalos de uma a duas semanas (DAGNONE, et al., 2001). Nos dias
em que ocorre plaquetopenia, as inclusões não são observadas; essa trombocitopenia tende
a agravar com a evolução do quadro e o número de plaquetas parasitadas diminui durante o
ciclo (HARVEY et al., 1978; HIBLLER et al., 1986; SWANGO et al., 1989; ALMOSNY,
2002).

2.5.3 Ehrlichia canis (EMC)

A Ehrlichia canis é o agente erliquial mais comum da erliquiose monocítica canina,
e a espécie que causa a doença com maior severidade parasitando monócitos (ALMOSNY,
2002). O risco de transmissão de Ehrlichia canis numa área pode ser estimado pela
prevalência de infecções ativas e passadas em cães (BOWMAN et al., 2009). A erliquiose
tem transmissão focal e a distribuição global varia de acordo com a densidade da
 19

população e a distribuição do carrapato vetor. A expansão das populações de carrapatos

pode introduzir a doença em áreas antes livres ou de endemicidade muito baixa
(NICHOLSON et al., 2010). A infeccção por Ehrlichia canis é prevalente em um grande
número de países em todo o mundo, em especial nas regiões temperadas e tropicais, com
índices de infecção entre cães variando de menos de 5% a quase 70% (STICH et al., 2008).
Com exceção de Ehrlichia canis, cães não são considerados reservatórios primários
para patógenos riquetsiais transmitidos por carrapatos. Ao contrário, cães e seres humanos
são hospedeiros acidentais e podem ser infectados através da picada de um ixodídeo
(NICHOLSON et al., 2010). A Ehrlichia canis é transmitida pelo carrapato no estágio
adulto ou de ninfa, que por sua vez se infectou em estágios anteriores, em outro cão ou em
algum animal silvestre. A transmissão transovariana garante a infecção das larvas, que é
mantida ao longo das mudanças estadiais (COMER et al., 2001).

2.6 Transmissão, clínica e patogenia da infecção por Ehrlichia canis

O parasitismo do carrapato Rhipicephalus sanguineus pela Ehrlichia canis é

garantido por transmissão transestadial, podendo a doença ser transmitida pelos três
estágios: larva, ninfa e adulto (GROVES et al., 1975; DAGNONE, 2001; BREMER et al.,
2005). As larvas e ninfas se infectam através da ingestão de leucócitos infectados em um
cão na fase aguda da doença (SMITH et al., 1976; LEWIS et al., 1977). No carrapato, as
erlíquias se disseminam por hemócitos do intestino para a glândula salivar e durante a
alimentação, os carrapatos inoculam a secreção salivar contaminada com erlíquias no
interior do ambiente de alimentação no hospedeiro (SMITH et al., 1976).
As erlíquias se replicam nos fagossomos das células mononucleares fagocíticas
do hospedeiro, propagando-se para o baço, fígado e linfonodos (McDADE, 1990),
evoluindo de corpúsculos elementares para corpúsculos iniciais até a formação de mórulas
(NYINDO et al., 1971). As células infectadas são transportadas especialmente ao pulmão,
rins e meninges, aderindo ao endotélio vascular e induzindo o aparecimento de vasculite e
infecção do tecido subendotelial (SIMPSON, 1974).
As manifestações mais comuns causadas por Ehrlichia canis são anemia,
leucopenia, trombocitopenia, febre e emaciação (BICHARD & SHERDING, 1998). Os
sinais clínicos variam com a severidade da infecção, a resposta imunológica do hospedeiro,
os órgãos atingidos, a espécie de erlíquia envolvida e a presença de co-infecção com outras
 20

erlíquias ou outros microorganismos transmitidos pelo mesmo vetor (DAGNONE et al.,

2001). A infecção por Ehrlichia canis pode progredir às fases aguda, subclínica e crônica
(QUINN et al, 2005).
A fase aguda é iniciada com um processo de hipertermia, após incubação de 5 a
15 dias, variando entre os animais a intensidade do pico febril, assim como também a
gravidade dos sinais (ALMOSNY, 2002). Nesta fase, os sinais clínicos são inespecíficos
incluindo febre, secreção ocular e nasal, anorexia, depressão, perda de peso,
linfadenopatia, vasculite, tremores musculares e poliartrite (BELLAH et al., 1986).
O quadro agudo da doença dura de duas a quatro semanas; ocorre bacteremia e
as principais alterações hematológicas são anemia, trombocitopenia e leucopenia
observada em poucos animais nessa fase (GREENE & HARVEY, 1984; ANDEREG &
PASSOS, 1999; ALMOSNY, 2002; NAKAGHI et al., 2008). A trombocitopenia que se
desenvolve durante essa fase é devido o decréscimo da meia vida das plaquetas circulantes,
que ocorre por alterações imunomediadas (ALMOSNY, 2002). Os cães infectados se
recuperam espontaneamente, podendo entrar numa fase assintomática ou subclínica,
permanecendo com o agente por longos períodos (HARRUS et al., 1997b).
Na fase subclínica, são observados elevados títulos de anticorpos, com
alterações hematológicas mais discretas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al.,
2008). Estudos relatam que cerca de 50% dos cães que desenvolvem a fase subclínica, a
anemia regride e a contagem de plaquetas retorna ao valor normal (ALMOSNY, 2002).
Algumas complicações podem ser encontradas nesta fase como depressão,
hemorragias, edema de membros, perda de apetite, palidez de mucosas, uveíte e cegueira
(WOODY & HOSKINS, 1991).
Cães imunocompetentes podem eliminar o parasita ou, ocasionalmente,
desenvolvem a fase crônica da doença, caracterizada por supressão medular, sangramentos
por mucosas e conjuntivas e alta letalidade (HARRUS et al., 1997b). O sistema imune do
hospedeiro não consegue debelar a infecção e apresenta alterações clínicas e laboratoriais
mais severas (ANDEREG & PASSOS, 1999; NAKAGHI et al., 2008).
Os sintomas mais comuns da doença crônica são depressão, apatia, perda de
peso crônica e emaciação, mucosas pálidas, febre, edema periférico, equimoses e epistaxe,
podendo ocorrer infecções secundárias como pneumonia, glomerulonefrite, insuficiência
renal, artrite, polimiosite e ataxia (HARRUS et al., 1997a).
 21

Os achados hematológicos na fase crônica são similares aos da fase aguda

sendo observados monocitose, linfocitose e trombocitopenia persistente associados à
anemia arregenerativa (ALMOSNY, 2002). A trombocitopenia é o achado mais freqüente
em cães experimentalmente e naturalmente infectados (OLIVEIRA et al., 2000;
NAKAGHI, et al. 2004), estando associada principalmente à fase crônica devido ao
decréscimo da hematopoiese, que ocorre por carência de megacariócitos (ALMOSNY,
2002). A leucopenia está presente na fase crônica e a pancitopenia pode ocorrer em casos
avançados desta fase, devido à hipoplasia de todas as células precursoras (MEINKOTH,
1989; HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 2002).

2.7 Principais métodos de diagnósticos utilizados na detecção de Ehrlichia.

A combinação de sinais clínicos e hematológicos é rotineiramente empregada

para levantar a suspeita diagnóstica de erliquiose, porém os sinais apresentados pelos
animais são confusos e variáveis, obrigando ao uso de exames laboratoriais para firmar um
diagnóstico definitivo (WANER et al., 2001; COHN, 2003).
Algumas técnicas têm sido utilizadas para um diagnóstico definitivo, como
pesquisa de inclusões em esfregaços sanguíneos e papas de leucócitos, cultivo celular,
sorologia pela imunofluorescência indireta (IFI), ensaio de imunoadsorção enzimática
(ELISA), western blotting e, mais recentemente, técnicas moleculares como a reação em
cadeia da polimerase (PCR) (IQBAL & RIKIHISA, 1994; TAKAHIRA et al., 2003;
DAGNONE et al., 2003; MYLONAKIS et al., 2004; MORAIS et al., 2004).
O método de rotina é feito normalmente pela demonstração microscópica direta
de inclusões intracitoplasmáticas, mais conhecidas como mórulas, em células
mononucleares sanguíneas, a partir de preparações coradas de esfregaço sanguíneo ou da
papa leucocitária (WOODY & HOSKINS, 1991). As espécies de erlíquias são encontradas
em granulócitos ou em plaquetas dos esfregaços sanguíneos de animais nos estágios
iniciais da doença. Aquelas espécies que têm por alvo monócitos estão presentes com
menor freqüência nos esfregaços sanguíneos (QUINN et al, 2005). A detecção de mórulas
de Ehrlichia canis não é freqüente; exceto durante a fase aguda da infecção, dificilmente as
mórulas são encontradas em esfregaços sanguíneos corados (HIBBLER et al., 1986;
OLIVEIRA at al., 2000; OLICHESKI et al., 2002; LEITE & RIBEIRO, 2003; NAKAGHI
et al., 2004; 2008; RAMOS et al., 2009). De fato, Mylonakis et al. (2003), comparando
 22

diagnóstico direto para Ehrlichia canis a partir de diferentes tecidos como sangue
periférico (SP) capa leucocitária (CL), aspirados de medula óssea (MO) e linfonodo (LN),
concluíram que o diagnóstico a partir de SP é o que apresenta a menor sensibilidade (8%)
quando comparado a CL (66%), MO (34%) e LN (60,9%), desencorajando a utilização
dessa técnica para diagnóstico. A técnica não é eficaz devido também à constante flutuação
da parasitemia durante o curso da enfermidade (ELIAS, 1992). Corpúsculos iniciais,
mórulas e inclusões intraplaquetárias sugestivos para Ehrlichia canis e/ou Anaplasma
platys podem ser vistos na Figura 1.

Figura 1. Fotomicrografias de esfregaços de papa leucocitária de sangue de cães

positivos na nested PCR para Ehrlichia canis e/ou PCR para Anaplasma platys.
Foto A morfologia compatível com corpúsculos iniciais, B com mórulas de
Ehrlichia canis, C com inclusões intraplaquetárias.
Fonte: D’agnone (2006).

As técnicas sorológicas podem ser empregadas como testes confirmatórios de

diagnóstico para infecções por rickettsias (EGENVALL et al., 1998; COHN, 2003);
entretanto, apesar de apresentarem alta sensibilidade, esses testes podem levar a resultados
falsos positivos, pois os anticorpos específicos podem permanecer por bastante tempo após
o tratamento e cura (RIKIHISA et al., 1994; NAKAGHI et al., 2008; AQUINO, 2009).
Existem reações cruzadas em exames sorológicos dentro do mesmo grupo, e
potencialmente entre genogrupos, dificultando a determinação inequívoca do agente
 23

etiológico. Os testes sorológicos também não são capazes de distinguir entre infecção
aguda e exposição prévia (RIKIHISA et al., 1994; SUKASAWAT et al., 2000).
Técnicas moleculares de diagnóstico reconhecidamente mais sensível, como a
PCR e a nested PCR, têm sido empregadas para o diagnóstico de Ehrlichia canis
(AGUIRRE et al, 2008; NAKAGHI et al. 2008; BANETH et al., 2009; KLEDMANEE et
al., 2009; MYLONAKIS et al., 2009; RAMOS et al., 2009).
A padronização da PCR é essencial para que esta possa ser usada como
diagnóstico seguro (ROTONDANO, 2007), pois se trata de uma reação que multiplica um
trecho específico do DNA utilizando primers que, por definição, são pequenos segmentos
de nucleotídeos capazes de se ligar em áreas conservadas de DNA do organismo testado,
amplificando uma região do mesmo e, dessa forma, permitindo sua identificação (COHN
et al., 2003). A nested PCR é uma segunda reação que utiliza o produto da amplificação da
primeira reação, obtendo assim, um produto menor que o da primeira amplificação. Uma
análise comparativa entre a PCR (gene dsb) e a nested PCR (16S RNA ribossômico),
realizada em amostras sangüíneas de cães infectados por Ehrlichia canis, demonstrou que
as duas técnicas são adequadas ao diagnóstico da EMC; no entanto, a nested PCR é até
agora a única capaz de diferenciar as espécies de Ehrlichia spp. (NAKAGHI et al., 2004).
A presença de DNA de Ehrlichia canis em cães infectados foi inicialmente
demonstrada pela PCR de sangue, medula óssea, baço, fígado, rim e linfonodos (IQBAL &
RIKIHISA, 1994; HARRUS et al., 1998; 2004; MYLONAKIS et al., 2004). Infecções
experimentais indicaram que o baço foi o local de maior probabilidade de encontrar
Ehrlichia canis durante a fase subclínica da EMC, apoiando a hipótese de que os
organismos são mais facilmente encontrados nos órgãos do que no sangue periférico.
Entretanto, o estudo não avaliou cães na fase aguda nem no início da fase sub-clínica, fases
estas em que se encontram em geral, os cães que recebem atendimento nos hospitais e
clínicas veterinárias (HARRUS et al., 1998; NEITZ & TOMAS, 1938)
No entanto, Gal et al. (2008) ressaltaram que informações comparativas sobre a
propagação e a presença de Ehrlichia canis por PCR em diferentes órgãos são limitadas e
que a comparação é difícil devido: a) diferenças na infecção natural e experimental, b)
diferentes fases da doença, c) metodologia de amostragem, d) natureza dos tecidos
avaliados.
 24

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local de Execução

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular do

Semiárido, da Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária no Centro de Saúde e
Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande, Campus Patos - PB.

4.2 Amostras de ehrlichias

Foram coletadas 24 amostras, oriundas dos Hospitais Veterinários da

Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), na cidade de Patos - PB e da
Universidade Rural de Pernambuco (UFRPE), na cidade do Recife – PE, além do Centro
Médico Veterinário Dr. Leonardo Torres – CMVLT, Patos – PB, a partir de cães com
sintomatologia, parasitologia e/ou hematologia positiva ou sugestiva para erliquiose ou
apenas com presença de carrapatos.
As amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica, obtendo de cada
animal 4 ml utilizando citrato de sódio (4%) e 1 ml sem o anticoagulante ambos para
extração do DNA.
As frações obtidas foram sangue total (ST), papa leucocitária (PL),
mononucleares (M), granulócitos (G), e coágulo de sangue (CS).
Para obtenção do ST e da PL foi utilizado uma parte da amostra com citrato,
sendo a PL centrifugada a 10000 rotações por 15 minutos; no restante da amostra com
anticoagulante foi adicionado reagente para isolamento in vitro de linfócitos1, segundo as
recomendações do fabricante, para obtenção de mononucleares e granulócitos(Figura 2). O
coágulo sanguíneo foi obtido a partir da amostra sem citrato.

1
Sep Cell®, LGC Biotecnologia
 25

Figura 2 - Reagente para isolamento in vitro de linfócitos.

Fonte: Sep Cell: LGC Biotecnologia.

4.3 Esfregaço Sanguíneo

Os esfregaços sanguíneos foram obtidos de amostras de 22 animais, corados

pelo Panótico rápido®2 e observados em microscópio (100X, objetiva de imersão em óleo)
para visualização de estruturas compatíveis com mórulas.

4.4 Extração do DNA

O DNA analisado foi extraído de amostras de ST (200µl), PL (50 µl), M (50

µl), G (100 µl) e CS (50 µl) utilizando-se um kit comercial3, seguindo as instruções do
fabricante.
Foram realizadas extrações de DNA em 21 amostras de ST, 20 de PL, 19 de M,
19 de G e 17 de CS, que foram utilizadas na nested PCR para a amplificação do fragmento
do gene 16S RNA ribossômico de Ehrlichia canis e Anaplasma platys.

2
LaborClin, Brasil
3
Invisorb ® Spin Blood kit Midi; INVITEK
 26

4.5 Nested PCR

A amplificação do DNA das amostras foi realizada no Laboratório de
Diagnóstico Molecular, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo,
Brasil, utilizando a técnica de nested PCR.
Para a primeira reação de PCR foi usado cerca de 0,5-1,0 µg do DNA genômico
e os pares de primers sense e antisense EHO descristos na Tabela 2 (BULLA et al., 2004).
Cada reação de PCR continha uma mistura de reação tampão 1X (50 µM KCl, 20 mM
Tris-HCl (pH 8,4), 0,1% Triton X-100), 1,75 mM de MgCl2, 0,2 mM dNTP's, 1 µM de
primers PCR, 0,625 U Taq DNA polimerase e água ultrapura autoclavada para um volume
final de 25 µL. O esquema de amplificação foi o seguinte: uma etapa inicial de
desnaturação a 94 °C por 10 minutos seguidos de 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 60
segundos, anelamento a 60 °C por 60 segundos e extensão a 72 °C por 60 segundos, com
uma etapa final a 72 °C por 4 minutos antes de cair para 4 °C.
A segunda reação de PCR foi idêntica ao primeiro PCR com exceção do DNA
molde e primers utilizados. O molde para a segunda reação de nested PCR foi uma alíquota
de 1,0 µL de reação positiva inicial e os primers utilizados também descristos na Tabela 2
foram os seguintes: EHCA sense / EHCA antisense específicos para Ehrlichia canis
(BULLA et al., 2004) e sense EHPL / EHPL antisense específico para Anaplasma platys
(João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal). Para cada lote de PCR, água ultra-pura
autoclavada foi utilizada como molde e agiu como um controle negativo. Também dentro
de cada execução da PCR, o DNA genômico de um caso confirmado de Ehrlichia canis e
Anaplasma platys foi utilizado como controle positivo. Após a conclusão da segunda etapa
da PCR, 10µl do produto da reação foi separado em gel de agarose a 1,5% com brometo de
etídio adicionados em Tris-Borato EDTA (TBE), a 90 volts por aproximadamente 1 hora,
para a visualização pela eletroforese.
 27

Tabela 2. Sequencia de primers selecionados para a amplificação do fragmento do gene 16S RNAr de
Ehrlichia pela nested PCR.
Primer Agente Seqüência de Primer Pares de De-a
etiológico 5’-3’ base (pb)
(pb)
EHO sense E. spp AGAACGAACGCTGGCGGCAAGCC*
478 pb 13 – 490
EHO antisense E. spp CGTATTACCGCGGCTGCTGGC*
EHCA sense E. canis CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGC*
EHCA E. canis TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT* 389 pb 58 – 446
antisense
EHPL sense A. platys TTTTTGTCGTAGCTTGCTATGATA**
384 pb 49 – 432
EHPL antisense A. platys TGTGGGTACCGTCATTATCTTCCCCA**
Fonte: *Bula et al., 2004/**João Pessoa Araújo Jr., comunicação pessoal.

4.6 Análise Estatística

Os resultados do esfregaço sanguíneo e nested PCR utilizando papa leucocitária

(PL), mononucleares (M), granulócitos (G) e coágulo sanguíneo (CS) foram comparados
com os resultados da nested PCR utilizando sangue total (ST), que foi considerado o teste
padrão-ouro. Foi calculado sensibilidade e indicador Kappa, utilizando o programa Dag
Stat (MACKINNON, 2000). O teste de hipótese foi feito com o teste de McNemar, com
um nível de significância de 5%. Os valores de referência do Kappa foram interpretados da
senguinte forma: (<0) nenhuma concordância, (0-0.19) concordância pobre, (0.20-039)
concordância fraca, (0.40-0.59) concordância moderada, (0.60-0.79) concordância
substancial, (0.80-1.00) concordância quase perfeita (LANDIS & KOCK, 1977)
 28

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas

estão detalhados na Tabela 3 para as 24 amostras coletadas.

Tabela 3. Resultados do esfregaço sanguíneo e da nested PCR das frações sanguíneas das amostras do ácido
desoxirribonucleico (DNA) dos cães com sinais de Erliquiose.
Nº de Esfregaço PCR PCR PCR PCR PCR
identicação sanguíneo Sangue total Granulócitos Mononucleares Papa de leucócitos Coágulo
do animal (E. spp.) (ST) (G) (M) (PL) sanguíneo
(C)
01 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *
02 Negativo Ehrlichiacanis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *
03 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo
04 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *
05 Negativo Negativo * * Negativo Negativo
06 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo *
07 Negativo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *
08 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
09 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo *
10 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis * Ehrlichia canis
11 Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis Ehrlichia canis *
12 Positivo Ehrlichia canis * * Ehrlichia canis/ Anaplasma
Anaplasma platys platys
13 Positivo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo
14 Negativo Anaplasma platys Negativo Negativo Negativo Anaplasma
platys
15 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
16 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo
17 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
18 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
19 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo
20 Positivo Ehrlichia spp. Negativo Negativo Negativo Negativo
21 Negativo Ehrlichia canis Negativo Ehrlichia canis Ehrlichia canis Negativo
22 * * * * * Negativo
23 * * * * * Ehrlichia canis
24 Positivo * * * * Ehrlichiacanis
* não foi feito

Na pesquisa feita em esfregaços sanguíneos, das 22 amostras analisadas 8

(36,3%) apresentaram mórulas ou inclusões para Ehrlichia, sendo a positividade
confirmada pela nested PCR de ST. Todos os animais positivos no esfregaço sanguíneo
amplificaram DNA para Erlichia ou Anaplasma em pelo menos uma fração das amostras
na nested PCR.
Vários autores relatam a baixa sensibilidade do diagnóstico pelo esfregaço
sanguíneo (NAKAGHI et al., 2008; RAMOS, 2009; UENO et al., 2009). Neste trabalho, a
sensibilidade foi baixa (46,6%), porém maior do que a observada por Meneses et al. (2008)
 29

em Salvador e região metropolitana (5,33% para Ehrlichia canis), por Ramos et al. (2009)
em Recife-PE (9% e 21% para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, respectivamente) e por
Nakaghi et al. (2008), em Jaboticabal, SP (3,3%). A alta sensibilidade da PCR foi relatada
por Mcbride et al. (1996) e Wen et al. (1997).
Das 14 (63,6%) amostras negativas no esfregaço sanguíneo, 8 (57,15%) foram
falso negativas, apresentando-se positivas na nested PCR de ST. Ramos et al. (2009)
observou uma proporção maior de falso negativos no exame direto em relação à nested
PCR para Ehrlichia canis e Anaplasma platys, concordando com os resultados encontrados
no presente trabalho. O teste Kappa indicou concordância fraca entre a presença de
mórulas em esfregaços sanguíneos e a nested PCR, mostrando uma diferença significativa
(p = 0,0133) para o esfregaço sanguíneo como demonstrado na Tabela 4. Todas as
amostras negativas na nested PCR de ST foram negativas no esfregaço sanguíneo, podendo
ser justificados pela subjetividade do exame direto, devido a curta duração de parasitemia e
da pouca sensibilidade da técnica como método de diagnóstico da infecção (MENESES, et
al., 2008).

Tabela 4. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e esfregaço sanguíneo na detecção de
Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica de hemoparasitoses.
Esfregaço sanguíneo
PCR (ST) Total
Positivo Negativo
Positivo 7 8 15
Negativo 0 6 6
Total 7 14 21
Qui - quadrado de McNemar (p = 0, 0133)
Kappa = 0, 3333

A amplificação do DNA de Ehrlichia e/ou Anaplasma pela nested PCR de ST

foi confirmada em 15/21 (71,4%) amostras, apenas 6/21 (28,5%) foram negativas, como
demonstradas na Figura 3.
Dos 15 animais positivos, em 7 (46,4%) foi amplificado DNA de Ehrlichia
canis e apenas 1 (6,6%) para Anaplasma platys. No estudo feito por Ramos et al. (2009),
32% (32/100) dos animais analisados pela nested PCR apresentavam-se infectados por
Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Esta última não é o principal agente etiológico de
erliquiose no Brasil, ao contrário do observado no Chile, que tem como agente etiológico
principal a Anaplasma platys (ABARCA et al., 2007).
 30

PM AMOSTRAS CP CN CN

500 pb
389 pb
400 pb

Figura 3. Eletroforese em gel de agarose (1,5%) apresentando os

resultados da nested PCR para detecção do gene 16S RNA
ribossômico de Ehrlichia canis. Caneleta 1: marcador de pares de
base (pb) 100pb; canaleta 2 a 5: amostras de DNA extraído a partir de
sangue total de animais com suspeita clínica de erliquiose; canaleta 6:
controle positivo; caneleta 7: controle negativo da reação de PCR;
caneleta 8: controle negativo da reação de nested.
Fonte: Laboratório de Diagnóstico Molecular – UNESP, campus de
Botucatu.

Em 7 (46,6%) amostras não houve amplificação na segunda reação de PCR, não

sendo possível identificar a espécie. Isto pode ter ocorrido em função da infecção destes
animais por outra espécie que não possa ser identificada com os primers utilizados para
Ehrlichia canis e Anaplasma platys, como a Ehrlichia chaffeensis, já que em cinco desses
animais havia mórulas no esfregaço de sangue.
Foram positivas para Ehrlichia canis 3/19 (15,8%) amostras de G, 6/19 (31,6%)
amostras de M, 6/20 (30%) amostras de PL e 3/17 (17,6%) amostras de CS.
Anaplasma platys foi confirmado apenas em 2/17 (11,7%) amostras de CS. Um
animal apresentou co-infecção de Ehrlichia canis e Anaplasma platys. Este resultado pode
ser justificado pelo fato de que a Anaplasma platys infecta preferencialmente plaquetas,
podendo sugerir que o CS é a melhor amostra para se identificar esta espécie.
Onze animais foram submetidos à PCR de todas as frações (ST, G, M, PL, CS), em
7 (76,6%) a espécie identificada foi Ehrlichia Canis, com 2 (18,1%) animais positivos por
 31

fração (ST, M e PL). Entre os 11 animais, em apenas 1 (9%) foi diagnosticada Anaplasma
platys nas frações de ST e CS.
Através do teste qui- quadrado de McNemar foi avaliado a sensibilidade diagnóstica
das frações (G, M, PL, CS) comparada ao ST. Quando os resultados do sangue total foram
comparados com os das frações de M e PL, a sensibilidade foi de 42,86% e com as frações
de G e CS foi de 21,43% e 33,33%, respectivamente.
Pelo teste kappa, as frações M, PL e CS apresentaram concordância fraca
comparado ao ST (Tabelas 5, 6, 7 e 8) e concordância pobre com a fração de G. Houve
significância estatística entre todos os testes.

Tabela 5. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de mononucleares (M) no diagnóstico de
Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.
PCR (M)
PCR (ST) Total
Positivo Negativo
Positivo 6 8 14
Negativo 0 5 5
Total 6 13 19
Qui - quadrado de McNemar (p = 0, 0133)
Kappa = 0, 2830

Tabela 6. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e de granulócitos (G) no diagnóstico de
Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.
PCR (G)
PCR (ST) Total
Positivo Negativo
Positivo 3 11 14
Negativo 0 5 5
Total 3 16 19
Qui - quadrado McNemar (p = 0,0026)
Kappa = 0, 1255

Tabela 7. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e papa leucocitária (PL) no diagnóstico de
Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.
PCR (PL)
PCR (ST) Total
Positivo Negativo
Positivo 6 8 14
Negativo 0 6 6
Total 6 14 20
Qui - quadrado McNemar (p = 0, 0133)
Kappa = 0, 3103
 32

Tabela 8. Comparação entre nested PCR de sangue total (ST) e coágulo de sangue (CS) no diagnóstico de
Ehrlichia e Anaplasma em cães com suspeita clínica.
PCR (CS)
PCR (ST) Total
Positivo Negativo
Positivo 3 6 9
Negativo 0 5 5
Total 3 11 14
Qui - quadrado McNemar (p = 0, 0412)
Kappa = 0, 2632

Estes resultados indicam uma maior sensibilidade diagnóstica da amostra de ST

em relação às outras frações analisadas. A sensibilidade foi superior aos resultados
encontrados por Nakaghi et al. (2008) que detectou pela mesma técnica 53,3% de amostras
positivas para Ehrlichia canis utilizando sangue circulante. A maior sensibilidade do
sangue total comparada às demais frações deve-se a presença de riquetsias livres no plasma
(LI & WINSLOW, 2003).
A co-infecção ocorrida em uma das amostras foi proveniente de Patos-PB, sendo o
primeiro relato de identificação por técnicas moleculares de Anaplasma platys no Estado
da Paraíba.
 33

7 CONCLUSÃO

O sangue total (ST) é a melhor fonte de ácido desoxirribonucleico (DNA) para o

diagnóstico de Ehrlichia pela reação em cadeia da polimerase em nested (nested PCR),
entretanto uma análise com um maior número de amostras ainda é necessária para avaliar
se o coágulo é mais sensível para identificar Anaplasma platys.
 34

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABARCA, K. et al. Anaplasma platys in Dogs, Chile. Emerging Infectious Diseases,

v.13, n.9, p.1392-1395, 2007.

AGUIAR D.M. et al. Diagnóstico sorológico de erliquiose canina com antígeno brasileiro
de Ehrlichia canis. Ciência Rural, v.37, n.3, p.796-802, 2007.

AGUIRRE E. et al. Comparison between different polymerase chain reaction methods for
the diagnosis of Ehrlichia canis infection. In: Annals of the New York Academy of
Sciences, v.1149, p.118-20, 2008.

ALMOSNY, N.R.P. Hemoparasitoses em Pequenos Animais Domésticos e como

zoonoses. Rio de janeiro: L.F. Livros, 2002. 135p.

ANDEREG, P.I.; PASSOS, L.M.F. Erliquiose canina: a revisão. Clínica Veterinária, v.4,
n.19, p.31-38, 1999.

ANDERSON, B.E. et al. Ehrlichia chaffeensis, a New Species Associated with Human
Ehrlichiosis. Journal of Clinical Microbiology, v.29, n.12, p.2838-2842, 1991.

AQUINO, F.S. Soroprevalência e fatores de risco associados à infecção por Ehrlichia

canis em cães do município de Patos. Estado da Paraíba. Trabalho de conclusão de
curso (Graduação em Medicina Veterinária) - Universidade Federal de Campina Grande,
2009.

BANETH G. et al. Longitudinal quantification of Ehrlichia canis in experimental infection

with comparison to natural infection.Veterinary Microbiology, v.136, n.3-4, p.321-5,
2009.

BELLAH, J.R.; SHULL, R.M.; SELCER, E.V.S. Ehrlichia canis-related polyarthritis in a

dog. Journal of American Veterinary Medicine Association, v.189, n.8, p.922-923,
1986.

BICHARD, J.S.; SHERDING, G.R. Clínica de pequenos animais. São Paulo: Roca,
1998.p.139-143.
 35

BOWMAN D. et al. Prevalence and geographic distribution of Dirofilaria immitis,

Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis, and Anaplasma phagocytophilum in dogs in the
United States: Results of a national clinic based serologic survey. Veterinary
Parasitology, v.160, p.138–148, 2009.

BULLA, C. et al. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection
with Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary Research,v.35, p.141–146, 2004.

BREMER, W. G. et al. Transstadial and intrastadial experimental transmission of

Ehrlichia canis by male Rhipicephalus sanguineus. Veterinary Parasitology, v.131, n.1-
2, p.95-105, 2005.

BRITO, C.C. Erlichiose canina – Aspectos clínicos e terapêuticos no hospital

veterinário/UFCG/Patos-PB. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Medicina
Veterinária) - Universidade Federal de Campina Grande, 2006.

CHAE, J-S. et al. Comparison of the nucleotide sequences of 16S rRNA, 444 Ep-ank, and
groeESL heat shock operon genes in naturally occuring Ehrlichia equi and human
granuloytic ehrlichiosis agent isolates from Northen California. Journal of Clinical
Microbiology, v.38, n.4, p.1364-1369, 2000.

CHEN, S.M. et al. Identification of a Granulocytotropic Ehrlichia Species as the Etiologic

Agent of Human Disease. Journal of Clinical Microbiology, v.32,n.3, p.589-595, 1994.

COHN, L.A. Ehrlichiosis and related infections. The Veterinary Clinics – Small Animal
Practice, v.33, p.863-884, 2003.

COMER JA et al. Urban zoonoses caused by Bartonella, Coxiella, Ehrlichia, and

Rickettsia species. Vector Borne Zoonotic Diseases. V.1, p.91–118, 2001.

DAGNONE, A.S.; MORAIS, A.H.S.; VIDOTTO, O. Erliquiose nos animais e no homem.

Ciências Agrárias, Londrina, v.22, n.2, p.191-201, 2001.

DAGNONE, A.S. et al. Ehrlichiosis in anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs

from a hospital population in South Brazil. Veterinary Parasitology, v.17, p.285-290,
2003.
 36

D’AGNONE, S.A. Caracterização molecular de espécies da família Anaplasmataceae

em leucócitos e plaquetas de cães de Jaboticabal-SP e de Campo Grande-MS. Tese
(Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias,
Jaboticabal, São –Paulo, 2006, 141p.

DUMLER, J.S. et al. Reorganization of Genera in the families Rickettsiaceae and

Anaplasmataceae in tha order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with
Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descripitions of six
new species combinations and designation of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective
synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Sistematic and
Evolutionary Microbiology, v.51, p.2145-2165, 2001.

EGENVALL, A.E.; HEDHAMMAR, A.A.; BJOERSDORFF, A.I. Clinical features and

serologic of 14 dogs affected by granulocytic ehrlichiosis in Sweden. Veterinary Record,
v.140, n.9, p.222-226, 1997.

EGENVALL, A. et al. Early manifestations of granulocytic ehrlichiosis in dogs inoculated

experimentally with a swedish Ehrlichia species isolate. Veterinary Record, v.143, p.412-
417, 1998.

ELIAS, E. Diagnosis of ehrlichiosis from the presence of inclusion bodies or morulae of E.

canis. Journal of Small Animal Practice, n.11, v.33, p.540-543, 1992.

ETTINGER, S.J. ; FELDMAN, E.C. Tratado de Medicina Interna Veterinária:

Moléstias do cão e do gato. 5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. p.2156.

FRENCH, T.W.; HARVEY, J.W. Serologic Diagnosis of infectious cyclic

thrombocytopenia in dogs using an indirect fluorescent antibody test. American Journal
of Veterinary Research , v.44, n.12, p.2407-2411, 1983.

GAL, A.L. et al.Detection of Ehrlichia canis by PCR in different tissues obtained

during necropsy from dogs surveyed for naturally occurring canine monocytic ehrlichiosis.
The Veterinary Journal, v.175, p.212–217, 2008.

GOLDMAN, E.E. et al. Granulocytic ehrlichiosis in dogs from North Caroline and
Virginia. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.12, n.2, p.61-70, 1998.

GREENE, C.E.; HARVEY, J.W. Canine Ehrlichiosis. In GREENE, C.E. (ed): Clinical
Microbiology and Infectious Diseases of the Dog and Cat, Philadelphia, W.B.
Saunders, 1984, p.545-561.
 37

GROVES, M.G.; DENNIS, G.L.; AMYX, H.L.; HUXSSOLL, O.L. Transmission of

Ehrlichia canis to Dogs by Thicks (Rhipicephalus sanguineus). American Journal of
Veterinary Research, v.36, n.07, p.937-940, 1975.

HARRUS, S.; BARK, H. et al. WARNER, T.E. Canine Monocytic Ehrlichiosis: An

Update. The Compedium Continuing Education, v.19, n. 4, p. 431-444, 1997 a.

HARRUS, S. et al. Canine monocytic ehrlichiosis: a retrospective study of 100 cases, and
an epidemiological investigation of prognostic indicators for the disease. Veterinary
Record, v. 141, n. 14, p. 360-363, 1997b.

HARRUS, S. et al. Investigation of splenic functions in canine monocytic ehrlichiosis.

Veterinary Immunology and Immunopathology, v.62, p.15-27, 1998.

HARVEY, J.W.; SIMPSON, C.F.; GASKIN, J.M. Cyclic Thrombocytopenia Induced by a

Rickettsia-Like Agent in Dogs. Journal Infectious Diseases, v.137, n.2, p.182-188, 1978.

HIBLLER, C.E. et al. Rickettsial infections in dogs part II: Ehrlichiosis and infectious
cyclic trombocytopenia. The Compendium Continuing Educcation, v.8, p.106-113,
1986.

HOSKINS, J.D. Ehrlichial Diseases of Dogs: Diagnosis and treatment. Canine Pratice,
v. 16, n.3, p.13-21, 1991.

IQBAL, Z.; RIKIHISA, Y. Aplication of the polymerase chain reaction for the detection of
Ehrlichia canis in tissues of dogs. Veterinary Microbiology, v. 42, p. 281-287, 1994.

KLEDMANEE, K. et al. Development of multiplex polymerase chain reaction for

detection of Ehrlichia canis, Babesia spp and Hepatozoon canis in canine blood. Southeast
Asian. Journal of Tropical Medicine and Public Health, v.40, n.1, p.35-9, 2009.

LABRUNA, M.B.; PEREIRA, M. C. Carrapatos em cães no Brasil. Clínica Veterinária,

n. 30, p. 24-32, 2001.

LANDIS, J.R.; KOCH, G.G. The measurement of observer agreement for categorical data.
Biometrics, v. 33, p. 159-174, 1977.
 38

LEITE, R.F.B.; RIBEIRO, S.C.A. Prevalência da erliquiose canina em Urberlândia MG.

In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 30º, Manaus,
2003. Anais... Manaus., 2003. 1 CD-ROM.

LEWIS, G.E. et al. The Brown Dog Tick Rhipicephalus sanguineus and the Dog as
Experimental Hosts of Ehrlichia canis. American Journal of Veterinary Research ,
v.38, n.12, p.1953-1955, 1977.

LI, S.J.; WINSLOW, M.G. Surival, Replication, and Antibody Susceptibility of Ehrlichia
chaffeensis outside of Host Cells. Infection and Immunity, v.71, n.8, p.4229–4237, 2003.

MACHADO, R.Z. Erliquiose Canina. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária,

v.13, supl.1, p.53-57, 2004.

MACKINNON, A. A spreadsheet for the calculation of comprehensive statistics for the

assessment of diagnostic tests and inter-rater agreement. Computer in Biology and
Medicine.,v.30, n.3, p.127-134, 2000.

McBRIDE, J.W. et al. Detection of Acute Ehrlichia canis Infection in Dogs. Journal of
Veterinary Diagnostic, v.8, p.441–447, 1996.

McDADE, J.E. Ehrlichiosis – a diseases of Animals and Humans. Journal Infectious

Diseases, v.161, p.609-617, 1990.

MEINKOTH, J.H. et al. Ehrlichiosis in a dog with seizires and nonregenerative anemia.
Journal of the American Veterinary Medical Association, v.195, n.12, p.1754-1755,
1989.

MENESES, S.D.I. et al. Perfil clínico-laboratorial da erliquiose monocítica canina em cães

de Salvador e região metropolitana, Bahia. Revista Brasileira Saúde Produção Animal.,
v.9, n.4, p.770-776, 2008.

MORAIS, H.A. et al. Diretrizes gerais para diagnóstico e manejo de cães infectados por
Ehrlichia spp. Clínica Veterinária, n.48, p.28-30, 2004.

MYLONAKIS, M.E. et al. Evaluation of cytology in the diagnosis of acute canine

monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a comparison between five methods. Veterinary
Microbiology, v.91, p.197-204, 2003.
 39

MYLONAKIS, M.E. et al. Chronic canine ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a retrospective

study of 19 natural cases. Journal of the American Animal Hospital Association, v.40,
n.3, p.174-184, 2004.

MYLONAKIS, M.E. et al. Evaluation of a serum-based PCR assay for the diagnosis of
canine monocytic ehrlichiosis. Veterinary Microbiology, v.138, p.390–393, 2009.

NAKAGHI, A.C.H. et al. Estudo comparativo entre a PCR baseada no gene dsb e a nested
PCR no diagnóstico de erliquiose canina. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
PARASITOLOGIA VETERINÁRIA E I SIMPÓSIO LATINO-AMERICANO DE
RIQUETSIOSES, 13º, Ouro Preto, MG, 2004. Anais... Ouro Preto, 2004.

NAKAGHI A.C.H. et al. Erliquiose canina: aspectos clínicos, hematológicos, sorológicos e

moleculares, Ciência Rural, v.38, p.766-770, 2008.

NEITZ, W.O., THOMAS, A.D. Rickettsiosis in the dog. Journal of South African
Veterinary Medical Association, v.9, p.166-174, 1938.

NICHOLSON, W.L. et al. The increasing recognition of rickettsial pathogens in dogs and
people.Trends in Parasitology, v.26, n.4, p.205-212, 2010.

NYINDO, M.B.A. et al. Tropical canine pancytopenia: in vitro cultivation of the causative
agent: Ehrlichia canis. American Journal Veterinary Research, v.32, n.2, p.1651-1658,
1971.

NYINDO, M. et al. Cell-mediated and humoral immune responses of German Shepherd

dogsand Beagles to experimenta infection with Ehrlichia canis. American Journal of
Veterinary Research, v.41, n.2, p.250-254, 1980.

OLICHESKI, A.T. et al. Freqüência de protozoários do gênero Babesia starcovici, 1983, e

de riquetsias do gênero Ehrlichia Ehrlich, 1888, em cães (Canis familiaris) no município
de Porto Alegre, RS, Brasil (resultados parciais). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
MEDICINA VETERINÁRIA, 29º, Gramado, 2002. Anais... Gramado, 2002.

OLIVEIRA, D. et al. Detecção de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães naturalmente

infectados, através do “DOT-ELISA”. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária,
v.9, n.1, p.1-6, 2000.
 40

PADDOCK, C.D., CHILDS, J.E. Ehrlichia chaffeensis: a Prototypical Emerging Pathogen.

Clinical Microbiology Reviews, v.16, n.1, p.37-64, 2003.

QUINN, P.J. et al. In: Rickettsiales. Microbiologia Veterinária e Doenças Infecciosas.

Porto Alegre: Artmed, 2005. p.206-214.

RAMOS C.A.N. et al. Comparação de nested-PCR com o diagnóstico direto na detecção

de Ehrlichia canis e Anaplasma platys em cães. Revista Brasileira de Parasitologia
Veterinária, V.18, Supl.1, p.58-62, 2009.

RIKIHISA, Y. et al. C-reactive protein and alpha 1-acid glycoprotein levels in dogs
infected with Ehrlichia canis. Journal of Clinical Microbiology, v.32, n.4, p.912-917,
1994.

ROTONDANO, F.E.T. Uso da bioinfomática para avaliação da especificidade de

iniciadores (primers) no diagnóstico da erliquiose canina pela reação em cadeia da
polimerase. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Medicina Veterinária) -
Universidade Federal de Campina Grande, 2007.

SANOGO, Y.O. et al. First evidence of Anaplasma platys in Rhipicephalus sanguineus

(Acari: Ixodida) collected from dogs in Africa. Onderstepoort. Journal Veterinary
Research, v.70, n.3, p.205-12, 2003.

SILVA, M.F.P. et al. Erlichioses. Veterinária e Zootecnia, v.16, n.2, p.290-302, 2009.

SIMPSON, C.F. Relationship of Ehrlichia canis – infected mononuclear cells to blood

vessels of lungs. Infection and Immunity, v.10, n.3, p.590-596, 1974.

SMITH, R.D. et al. Development of Ehrlichia canis, causative agent of canine ehrlichiosis,
in the tick Rhipicephalus sanguineus and its differentiation from a symbiotic Rickettsia.
American Journal of Veterinary Research, v.37, n.2, p.119-126, 1976.

STICH, R.W. et al. Host surveys, ixodid tick biology and transmission scenarios as related
to the tick-borne pathogen, Ehrlichia canis. Veterinary Parasitology, v.158, p.256–273,
2008.

STOCKHAM, D.A. et al. Experimental Transmission of Granulocytic Ehrlichial

Organisms in Dogs. Veterinary Clinical Pathology, v.19, n.4, p.99-104, 1990.
 41

SUKASAWAT, J.; HEGARTY, B.C.; BREITSCHWERDT, E.B. Seroprevalence of

Ehrlichia canis, Ehrlichia equi, and Ehrlichia ristici in sick dogs from North Carolina and
Virginia. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.14, p.50-55, 2000.

SWANGO, L.J. et al. Bacterial, Rickettsial, Protozoal and Miscelaneous infections. In:
Ettinger. S.J. (ed): Textbook of Veterinary Internal Medicine. Fhiladelphia, W.B. Saunders
Company, p. 265-297, 1989.

TAKAHIRA, R.K. et al. Detecção de anticorpos contra Ehrlichia platys e Ehrlichia canis
em cães. Nosso Clínico, v.32, p.34-38, 2003.

UENO, T.E.H. et al. Ehrlichia canis em cães atendidos em hospital veterinário

de Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária,
v.18, n.3, p.57-61, 2009.

WANER, T. et al. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with
special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia
canis. Veterinary Parasitology, v.95, p.1-15, 2001.

WEN, B. et al. Comparison of nested PCR with imunofluorescent antibody assay for
detection of Ehrlichia canis infection in dogs treated with doxycycline. Journal of
Clinical Microbiology, v.35, p.1852-1855, 1997.

WOODY, B.J.; HOSKINS, J.D. Ehrlichial disease of dogs. Veterinary Clinicals of North
America: Small animal pratice, v.21, n.1, p.45-98, 1991.
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