INTRODUCCION

Las proteínas son las macromoléculas más abundantes en las células. Son la forma en
la que la información genética se expresa. A pesar de que las proteínas son diferentes
en las diferentes especies, todas están constituidas por los mismos 20 aminoácidos sólo
que en diferente orden. Las proteínas varían entre ellas porque tienen una secuencia de
aminoácidos diferente.

La estructura primaria de las proteínas es la que se debe a los encales covalentes de la

molécula. Esta definición comprende la secuencia de aminoácidos y puentes disulfuro.
Todas las propiedades de las proteínas están determinadas por la estructura primaria.
Las cadenas peptídicas forman arreglos unidos por puentes de hidrógenos. Los átomos
de oxígeno carbonílicos forman puentes de hidrógeno con los hidrógenos de la amida.
Puede presentarse un arreglo ordenado de puentes de hidrógeno; la hélice alfa y la hoja
plegada. Algunas partes de la proteína pueden estar plegadas y otras pueden estar en
hélice o incluso pueden estar al azar. La estructura terciaria es una conformación
tridimensional. La estructura cuaternaria es la asociación de dos o más cadenas
completas.

Hay muchas clases de proteínas de acuerdo a la función que cumplen. Muchas

proteínas cumplen con una función catalítica a estas se les conoce como enzimas.
También hay proteínas en el plasma que se unen y transportan diferentes sustancias, por
ejemplo la hemoglobina que se une al oxígeno y lo transporta en el torrente sanguíneo.
Existen otras proteínas que el organismo usa para almacenamiento de nutrientes. Hay
otras proteínas que tienen la capacidad de contraerse, cambiarse de forma y moverse.
Algunas proteínas intervienen en la defensa de los organismos como las
inmunoglobulinas. Algunas proteínas ayudan a regular la actividad fisiológica y
celular.

Las proteínas se pueden clasificar por su forma. Las proteínas globulares son cadenas
polipeptídicas dobladas en forma compacta. Éstas son solubles en agua y se difunden
fácil. Las proteínas fibrosas son insolubles, largas con cadenas polipeptídicas que se
extienden y no se doblan. Hay una clase de proteínas filamentosas que participan en los
eventos contráctiles.
Muchas proteínas contienen solamente aminoácidos y no contienen otros grupos
químicos. Estas son las proteínas simples. Sin embargo, hay otros tipos de proteínas
que contienen otro componente químico además de los aminoácidos. A estas proteínas
se les conoce como conjugadas. La parte que no es aminoácido se llama el grupo
prostético.

Las reacciones coloreadas en las proteínas se dan debido a la variedad de aminoácidos

que reaccionan con varios productos. Muchas de estas reacciones son importantes para
la detección y la estimación cuantitativa de proteínas y de sus aminoácidos
constituyentes.

MÉTODOS PARA LA CUALIFICACION Y

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: VENTAJAS E

INCONVENIENTES

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica

de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína
concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos
propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos

métodos se basan en:

A. La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV.

B. Formación de derivados químicos.

C. La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

  REACCIÓN DEL BIURET

Fundamento de la reacción

Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una
coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los
pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos amino de la unión peptídica.
Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.

Cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterización

cuali o cuantitativa de proteínas en una muestra problema) o identifica una sustancia en
particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbúmina en clara de huevo) se
debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En función de este objetivo se
seleccionará el método más indicado.

La reacción del Biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un
resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar
los resultados falsos positivos.

Un resultado negativo de la reacción del Biuret sobre una muestra problema no

necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir a) que no existan
proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas Biuret
positivas), b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan
que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo). Esto
puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la
muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de péptidos generados por una
reacción de hidrólisis ácida, los H+ del medio interferirán con la reacción del Biuret, ya
que ésta necesita de un medio alcalino para la formación del complejo con Cu++. En este
caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo
(en caso contrario obtendría un falso negativo como resultado) y c) Que existan
péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo
método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del
mismo es superior a cierto valor. Existen métodos mucho más sensibles que el Biuret.

 REACCIÓN DE BRADFORD

Fundamento de la reacción
El método involucra la unión de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB)
a las proteínas. La solución del colorante libre es de color rojizo (máxima absorción a
465 nm) y cambia al azul (máxima absorción a 595 nm). La unión es un proceso rápido
(aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-proteína se mantiene estable
hasta una hora después de producido.

Como en esta reacción el CBB se une específicamente a las proteínas, es un buen

método de caracterización (aunque no de identificación). La reacción se prefiere a otras
por su sensibilidad (mayor que la del Biuret), lo que significa que, para una misma
muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero
negativo con el reactivo del Biuret.

Dado que aún los materiales biológicos más sencillos poseen una composición química
compleja, siempre se debe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias (positivas
o negativas). También se debe tener en cuenta que no siempre son las mismas
sustancias las que interfieren en los distintos métodos. En el caso de extractos vegetales
es común encontrar sustancias como los fenoles que por lo general producen
interferencias en muchos de los métodos de caracterización de proteínas. La reacción de
Bradford es de elección en estos casos pues los mencionados compuestos no producen
interferencia.

 CONFECCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Una vez que se ha detectado la presencia de un componente es importante conocer la

cantidad del mismo presente en la muestra y en consecuencia se debe hallar una manera
de cuantificarlos. Para llevar a cabo el análisis cuantitativo es necesario efectuar una
curva de calibración. Para la confección de dicha curva se utilizan diluciones de una
proteína pura de concentración conocida. Sobre cada dilución se lleva a cabo la reacción
de Bradford y la curva de calibración se obtiene graficando los datos de absorbancia
correspondientes a cada una de las diluciones versus la concentración de proteína de las
mismas. El rango de detección de proteínas para el método es de 0,1 a 1 mg/ml, dentro
del cual la relación absorbancia-concentración se mantiene lineal.

 ENSAYOS DE ESTABILIDAD DE PROTEÍNAS EN DISPERSIÓN

ACUOSA

Las proteínas se mantienen dispersas gracias a interacciones con las moléculas de

solvente y de solutos presentes. Su estabilidad, al igual que sucede con otras
macromoléculas que forman dispersiones coloidales, se fundamenta en dos factores:
hidratación y carga eléctrica, que actúan contraponiéndose a la influencia de la
gravedad que tiende a producir la sedimentación de las partículas dispersas. En el
seminario de trabajos prácticos se discutirá en detalle de qué forma distintos agentes (pH,
agentes deshidratantes, solventes orgánicos, etc.) influyen sobre la estabilidad de las
proteínas.

 ELECTROFORESIS

Fundamento

Si se aplica un campo eléctrico a una solución que contiene una molécula con carga neta
(+ o -), ésta migrará a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamaño y su
forma. Esta técnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de
moléculas cargadas (proteínas, ácidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel,
cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidón o poliacrilamida).

La movilidad electroforética es la relación de la velocidad de la molécula (v) y el

potencial eléctrico (E). También es igual a la carga neta de la molécula (Z) dividida por
el coeficiente friccional (f), que es la resistencia que el gel opone al movimiento de la
partícula.

En la fórmula puede verse que a mayor carga eléctrica, mayor será la movilidad de la
molécula.

Un parámetro importante a considerar en la electroforesis de aminoácidos y proteínas es

su punto isoeléctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la
carga de la molécula. Cuando el pH es mayor que el pI la molécula tendrá carga
negativa; por el contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molécula será
 positiva. De esta manera, de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la
muestra se sembrará en uno u otro polo: si la molécula tiene carga negativa se sembrará
cerca del polo negativo (cátodo), con lo que migrará hacia el polo positivo (ánodo) y
viceversa.

Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus

rangos de sensibilidad

Método Rango de sensibilidad Coeficiente de extinción o Cálculo de

(g) la concentración
Métodos de
Absorción 100-3000 
280 = 1 mL/mg cm
A280 3-100 205 = 31 mL/mg cm
A205 100-3000 Proteína (mg/mL) = (1.55A280 –
A280 - A260 25-700
0.76A260)
5-180
A235 - A280 Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
2-45
A224 - A236 Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6
Métodos Derivados
Colorimétricos
Biuret 1000-10000 545 = 0.06 mL/mg cm
Lowry 25-100 a 500 nm Usar curva estándar
2-30 a 660 nm
Bradford 1-2 a1-15
750 nm 595 = 81 mL/mg cm
BCA(ácido 0.5- 10 Usar curva estándar
bicinconínico)
Métodos Derivados
Fluorimétricos
o-ftalaldehido 1-5 
excitación a 340 Usar curva estándar
nm

Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales

ventaja e inconvenientes
Método Ventajas Inconvenientes
Métodos de No se pierden las Interfieren muchos compuestos que absorben
Absorción muestras en el UV

Métodos Derivados
Colorimétricos
Biuret Bastante específico para Tiene poca sensibilidad
proteínas
Muestra pocas
interferencias
Lowry Es barato
Tiene bastante No todas las proteínas reaccionan igual
sensibilidad Muestra muchas interferencias como
detergentes no iónicos, sulfato amónico etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes
BCA(ácido Es el método más sensible
bicinconínico) Es el que muestra menos
interferencias
Métodos Derivados
Fluorimétricos
ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual