Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para

peneliti bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip umum kerja PCR adalah
menggandakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Sejak ditemukan pertama kali
mesin PCR (nama lainnya Thermal Cycler) oleh Karry Mullis pada tahun 1984, kini hampir
semua kegiatan di bidang biologi molekuler, genetika, kedokteran hingga forensik tidak lepas
dari PCR. Wajar  jika The Royal Swedish Academy of Sciences mengganjar Mullis dengan
Hadiah nobel pada tahun 1993.
Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA,
baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria
(mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk mendapat potongan DNA, diperlukan Primer yang
berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang akan digandakan. Primer biasanya
berpasangan, yaitu Primer forward untuk menandai ujung depan untai DNA dan Primer
Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Karena DNA terdiri dari 2 untai pilinan ganda
(double strand), maka DNA Primer forward bekerja pada strand yang satu sementara Primer
Reverse bekerja pada untai pilinan yang satunya.

Untuk melakukan penggandaan, dibutuhkan bahan baku DNA buatan, namanya dNTP. Masih
ingat 4 jenis ribosa DNA kan?  yups .... Adenine, Guanine, Cytosin dan Thymine. Nah... untuk
PCR diperlukan dNTPa untuk Adenine, dNTPg, dNTPc dan dNTPt untuk masing-masing gula
ribosa. Biasanya campuran dNTP-dNTP ini dalam istilah bahasa Inggris cukup disingkat dNTP's.

Untuk merakit untai DNA buatan dari dNTPs ini, dibutuhkan bantuan enzyme Taq polymerase.
Enzyme ini bekerja optimal pada suhu tinggi hingga 100 derajat celcius. Taq polymerase
dipanen dari sebuah bakteri bernama Thermus aquaticus yang ditemukan di sumber air panas,
makanya hasil enzyme nya tahan panas dan tidak rusak pada suhu air mendidih.

Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu Denaturing, Annealing dan Extension. 

1. Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Pada tahap ini, ikatan
hidrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-masing akan
menjadi untai tunggal. Biasanya suhu Denaturing berkisar antara 92-94 derajat celcius.
2. Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari pasangannya di
untai-untai DNA. Jika pas..... maka dia akan melekat. Suhu Annealing biasanya
berkisar antara 40-55 derajat Celcius. Suhu yang biasanya umum dipakai adalah 50-52
derajat C.
3. Setelah itu, mesin PCR akan kembali memanaskan 'sup DNA' lagi ke suhu 72 derajat
celcius agar Taq polymerase bekerja menggandakan potongan DNA. Pertama ia,
maksudnya si Taq, membaca primer seperti layaknya pesawat terbang lari di landasan
pacu sebelum take off. 
Biasanya ketiga tahap ini diulang sebanyak 30 kali untuk mendapatkan 1.073.741.766 atau
satu miliar tujuh pulih tiga juta tujuh ratus empat puluh satu ribu tujuh ratus enam puluh
enam  -

PCR ALAT AMPUH DIAGNOSA PENYAKIT

PCR singkatan dari Polymerase Chain Reaction yang merupakan suatu teknik atau uji positip
terhadap adanya virus melalui reaksi berantai suatu primer dari sequence DNA dengan bantuan
enzym polymerase, sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara invintro. Teknik PCR
ditemukan oleh Dr.Kary Mullis pada tahun 1985 dan mendapatkan hadiah nobel atas temuannya
pada tahun 1993. system kerja mesin PCR dimaksudkan untuk memperjelas bagian dari DNA
mikroorganisma patogen sehingga dapat mendiagnosa penyebab penyakit secara akurat sedini
mungkin.
Pengujian PCR mempunyai keunggulan dalam mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh virus,
bakteri atau parasit sebanyak satu (1) orgamisma. Keunggulan yang paling utama adalah
hasilnya bisa langsung dilihatpada hari itu juga. Unutk menjalankan tes ini penggunaan asam
nucleus (DNA/RNA) sebagai symbol sangatlah kecil.
PCR mempunyai keunggulan dibandingkan dengan tes-tes lain seperti tes serological (ELISA,
CF, IFT dll) karena pada tes serologicalbisa terjadi reaksi silang, kurang sensitive dan berbasis
pada antibodi. Padahal antibodi dapat diseleksi dalam darah mulai hari ke lima (5) setelah terjadi
infeksi, sedangkan dengan PCR dapat digunakan mulai hari pertama terjadinya infeksi. Metoda
konfensional seperti kultur biakan atau identifikasi dengan menggunakan mikroskope atau reaksi
boikimia merupakan metoda yang cukup sulitdan memerlukan waktu yang lama. Dengan
menggunakan PCR makadapat mendeteksi infeksi pada atahap yang paling dini/awal. Sehingga
bisa sesegera mungkin diambil tindakan pencegahan agar penyakit tidak semakin parahdan
kerugian bisa ditekan seminim mungkin.
Dengan metoda ini dapat diketahui tingkat serangan penyakit apakah masih dalam tahip ringan,
sedang sampai penyakit sudah parah dari sampel ikan/udang yang diuji dengan cara
membandingkannya dengan plsamid standart yang ada.
Semua bagian tubuh ikan/udang dapat dipergunakan sebagai sampel dalam uji PCR kecuali
bagian yang keras (cangkang/rostum) serta hepatopancreas karena disini merupakan organ yang
kaya akan enzym sehingga dapat merusak DNA virus pada saat proses ekstraksi. Cukup dengan
sedikit sampl oleh karenanya tinggkat keberhasilan maupun kegagalan suatu terapi dapat
diperkirakan hasilnya.
 
APA SAJA YANG DAPAT DILAKUKAN DENGAN PCR
Aplikasi PCR berkembang untuk :
1. Identifikasi microorganisma.
2. Aplikasi forensik seperti identifikasi DNA baik pada manusia maupun binatang.
3. Identifikasi mutasi.
4. Identifikasi kecacatan genetik.
5. Perselingkuhan.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

         
             Mesin PCR (Thermocycle)
 
 
PROSEDUR PCR
System kerja PCR terjadi pada siklus yang berulang-ulang sebanyak 20-30 kali. Dimana setiap
siklus terdiri atas 3(tiga) tahapan reaksi, sebagai berikut :
1. Denaturasi :disini terjadi pemecahan DNA target (virus ikan/udang) dari ntaian ganda
(double-stranded DNA) menjadi untai tunggal (single standed DNA) dengan cara
pemanasan 95°C
2. Annealing : terjadinya penempelan primer pada DNA untai yunggal pada suhu 56°C,
primer akan menempel pada pangkal dan ujung dari masing-masing DNA untai tunggal
yang komplementer sehingga menjepit suatu daerah tertentu dari sequence DNA target.
3. Extension : proses pemanjangan primer dengan bantuan enzym polymerase pada suhu
74°C. proses ini merupakan akhir yang hasilnya adalah terbentuk 2 buah DNA untai
tunggal baru yang komplemen terhadap sequence DNA target
 
Hasil sintesa DNA dalam satu siklus berperan sebagai cetakan (template) siklus berikutnya
sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat pada setiap akhir siklus. Dengan proses ini DNA
target meningkat secara ekponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran (2 30)
amplifikasi DNA target. Selanjutnya DNA penyakit (virus dll) jumlahnya akan menjadi berlipat
ganda sehingga dapat dideteksi dengan menggunakan electroporesis, gel agarosa, setelah diberi
pewarna Ethidium Bromida (ETBr). Hasil electroforesis yang berupa band DNA dan dapat
dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator dan didokumentasikan dengan camera
digital atau biasa/polaroid.
 
PCR alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh mikroorgamisma patogen yang unggul dalam
hal kecepatan, spesifitas dan sensitifitasnya sehingga bisa dijadikan metoda unggulan dalam
mendiagnosa suatu penyakit pada ikan/udang, manusia, tanaman maupun binatang lainnya. PCR
dapat melihat adanya kandungan virus dalam tubuh ikan secara tepat, cepat, dan praktis. Hasil uji
PCR juga dapat dipakai untuk pernyataan tingkat kesehatan ikan/udangdalam bentuk sertifikasi
benur/benih bebas virus WSSV, TSV, KHV dan IHHNV.
Dimasa mendatang PCR akan menjadi metoda pilihan /andalan untuk mendiagnosa berbagai
macam penyakit dengan cakupan yang sangat luas.(PRATIWI)