Makalah KS BIOKIMIA I

PRODUCTION OF LOW-DOSAGE LACTOSE MILK USING

LACTASE IMMOBILISED IN HYDROGEL

Nama : Sabar Mula Tua

NPM : 1506670710
Dosen : Prof. Dr. Sumi Hudiyono PWS

Departemen Kimia
Fakultas Matematika & Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Indonesia
2019
 Kata Pengantar

What in the world is not chemistry? Mungkin kalimat inilah yang paling tepat
digunakan untuk menggambarkan pentingnya ilmu kimia. Mulai dari tingkat penyusun
makhluk hidup yang paling sederhana, sampai pada berbagai hal kompleks yang terdapat
pada alam. Dengan memanfaatkan segala jenis bahan kimia, seharusnya manusia mampu
mengembangkan dan memodifikasi setiap jenis bahan kimia yang ada, mulai dari bahan
alam, hingga sintesis suatu zat kimia, untuk memastikan keberlangsungan hidup setiap
makhluk yang ada.
Makalah ini disusun sebagai salah satu persyaratan dalam matakuliah Kapita Selekta
Biokimia I yang diampu oleh Prof. Dr. Sumi Hudiyono PWS. Makalah ini merupakan review
yang didasarkan pada jurnal Production of Low-Dosage Lactose Milk Using Lactase
Immobilised in Hydrogel. Melalui makalah ini, diharapkan pembaca dapat lebih mudah
memahami jurnal tersebut. Saran dan kritik kepada penulis dapat disampaikan melalaui
sabarsitio@gmail.com .

Jakarta, 13 Mei 2019

Sabar Mula Tua

 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Enzim
Enzim adalah suatu makromolekul yang terdapat pada setiap makhluk hidup. Hampir
semua proses metabolisme pada tingkat seluler memerlukan enzim. Enzim berfungsi
sebagai katalis untuk mempercepat suatu reaksi kimia. Enzim telah diketahui dapat
mengatalisis lebih dari 5000 tipe reaksi biokimia. Kebanyakan enzim tersusun dari protein,
meskipun ada beberapa yang tersusun atas molekul RNA (ribozymes). Seperti katalis pada
umumnya, enzim mempercepat suatu reaksi dengan menurunkan energi aktivasi. Bahkan,
beberapa enzim dapat merubah substrat menjadi produk jutaan kali lebih cepat. Salah satu
contohnya adalah orotidine 5’-phosphate decarboxylase, yang dapat membuat reaksi yang
seharusnya berjalan dalam jutaan tahun terjadi hanya beberapa milisekon.

Pada jurnal ini, akan dibahas enzim laktase (ß-galaktosidase, EC 3.2.1.23). Laktase
terdapat pada beberapa makhluk hidup, seperti E.coli ataupun manusia (usus halus). Enzim
laktase berperan penting untuk memecah laktosa pada susu. Laktase berperan sebagai
katalis untuk memecah disakarida laktosa menjadi monomer glukosa dan galaktosa dengan
reaksi sebagai berikut.

C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6 + kalor

Gambar 1. Reaksi penguraian Laktosa oleh enzim Laktase

Pada beberapa kasus, ada beberapa orang yang pada usus halusnya tidak mampu
menghasilkan enzim ini, sehingga ketika meminum susu, laktosa yang ada tidak mampu
dipecah, dan dapat menyebabkan diare dan muntaber. Untuk itu, perlu penelitian lebih
lanjut untuk memecahkan masalah intoleransi laktosa ini.
 Gambar 1. Sturktur Enzim Laktase

1.2 Hidrogel
Hidrogel adalah suatu material polimer jejaring tiga dimensional yang berfungsi
untuk menyerap air ataupun cairang biologis lainnya dengan sangat baik. Polimer hidrogel
biasanya disintesis dengan metode ikat-silang (crosslink). Hidrogel mampu menyerap air
karena strukturnya yang bersifat hidrofilik.
Salah satu contoh senyawa yang dapat digunakan sebagai hidrogel adalah kitosan.
Kitosan merupakan senyawa bahan alam turunan dari kitin. Kitosan banyak digunakan
sebagai bahan dasar pembuatan polimer karena sifatnya yang mudah terurai oleh mikroba
(biodegradable) dan non-toksik. Umumnya, hidrogel berbasis kitosan disintesis dengan
menggunakan asam akrilat, senyawaan persulfat (contoh K2S2O8 ) sebagai inisiator, serta
N,N’-metilenbisakrilamida (N,N’-MBA) sebagai agen pengikat silang.
Pada beberapa studi sebelumnya, hidrogel kitosan telah banyak digunakan baik
sebagai controlled-release processes ataupun untuk imobilisasi enzim. Hidrogel ini juga
dapat digunakan untuk imobilisasi enzim laktase karena sifatnya yang biodegradable dan
non-toksik tersebut. Gaya intermolekul yang terjadi pada hidrogel dengan enzim laktase
memungkinkan proses imobilisasi enzim ini untuk keperluan pembuatan susu rendah
laktosa ataupun makanan bebas laktosa, karena enzim sulit berdifusi keluar dari jejaring
polimer. Bila gaya intermolekulnya dibuat agak lemah, maka hidrogel yang mengandung
laktase terimobilisasi ini dapat digunakan untuk pembuatan kapsul laktosa controlled-
release untuk individu dengan intoleransi laktosa.

Gambar 2. Konformasi Kursi Polimer Kitosan

 BAB II
ISI

2.1. Eksperimental
 Reagen
Ada beberapa reagen yang akan digunakan. Kitosan ( CS - derajat deasetilasi 92%
dari berat), asam akrilat (AAc), N,N’-metilenbisakrilamida (N,N’-MBA), reagen Bradford
dan Bovine serum albumin (BSA), semuanya dibeli dari Sigma-Aldrich. Enzim laktase dari
Kluyveromyces lactis ( EC 3.2.1.23 ) didapatkan dari Prozyn Brazil. Reagen lain yang
digunakan disesuaikan dengan standar analitik dan larutan disiapkan dengan air Milli-Q.

 Sintesis Hidrogel
Hidrogel disintesis dengan melarutkan 0.3 gram kitosan dengan larutan asam asetat
2% sebanyak 30 mL. Kemudian ditambahkan dengan campuran 15 mL air Milli-Q, 0.5215
mmol kalium persulfat, 3.4 mL asam akrilat dan 0.15 gram N,N’-MBA. Setelah
pencampuran dihasilkan larutan yang akan diaduk selama 3 jam pada suhu 70 oC untuk
menyempurnakan pengikatan silang. Hidrogel akan terbentuk, lalu dicuci dengan air
Milli-Q selama 72 jam (air diganti setiap 8 jam). Setelah proses pencucian selesai,
hidrogel akan dikeringkan dengan proses liofilisasi (lyophilisation) pada suhu 60oC ± 1oC
selama 24 jam.

 Derajat pembengkakan (swelling) hidrogel

Nilai swelling dari hidrogel ditentukan dengan meletakkan 100 mg hidrogel pada
beberapa wadah yang mengandung (i) air distilasi , (ii) air minum, (iii) larutan penyangga
asetat 0.1 M pH 4, (iv) larutan penyangga fosfat 0.1 M pH 7 untuk beberapa waktu
kontak berbeda dengan suhu 37oC ± 1oC. Suhu ini digunakan untuk melihat perilaku
hidrogel selama hidrolisis laktosa pada individu. Derajat pembengkakan (DS) dihitung
melalui persamaan :

DS=¿mt – mt=0 / mt=0

 Imobilisasi Laktase
Hidrogel kering dipotong-potong menjadi ukuran 100 mg direndam dalam dua
larutan berbeda, 0.1 M buffer asetat pH 4 ataupun buffer pospat 0.1 M pH 7 serta
dilakukan penambahan 1.5 mL laktase pada suhu ruang, lalu tiap aliquot diambil pada
rentang 0 -sampai 1440 menit. Sisa larutan akan diuji pada spektrofotometer UV – Vis.
qi = Kapasitas imobilisasi Vsolution = volume larutan buffer-enzim
EI (%) = Efisiensi Imobilisasi Cequilibrium = konsentrasi enzim saat setimbang
m(t=0) = berat hidrogel kering C enzyme = konsentrasi enzim tanpa hidrogel

 Hidrolisis Laktase Standar

100 mg hidrogel yang mengandung laktase terimobilisasi direndam dalam 9 mL
larutan buffer pospat 0.1 M pH = 7 dan 1 mL larutan laktosa standar 5 % (w/v) pada suhu
37 ± 1oC. Aliquot diambil pada waktu tertentu untuk penentuan konsentrasi glukosa
yang terbentuk setelah proses hidrolisis laktase. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan
spektrofotometer UV – Vis pada 504 nm serta menggunakan HPLC.

 Siklus Hidrolisis Laktosa dengan Laktase Terimobilisasi

Hidrogel yang terimobilisasi laktase digunakan sebanyak 10x siklus hidrolisis dan
dianalisis efisiensi dari proses hidrolisisnya serta aktifitas enzim untuk setiap siklus.
Aktivitas laktase terimobilisasi untuk tiap siklus ditentukan dengan persamaan berikut.
Enzyme activity ∈n cycle
Relative Enzyme Activity =
Enzyme activity∈ first cycle

 Released Enzyme Fraction

Fraksi enzim yang dilepas pada setiap siklus hidrolisis laktosa dikonfirmasi dengan
merendam hidrogel pada 9 mL larutan buffer pospat pH 7 pada suhu 37 ± 1oC. Aliquot
diambil pada waktu yang berbeda-beda untuk menentukan konsentrasi enzim bebas dengan
menggunakan spektrofotometer UV – Vis dan reagen Bradford. Fraksi enzim yang dilepas
dapat dihitung dengan persamaan berikut.
Amount of Enzyme Released
Released Enzyme Fraction =
Amount of Enzyme Immobilised
2.2 Hasil dan Pembahasan
 Derajat Pembengkakan Hidrogel
Gambar di bawah ini menjelaskan derajat pembengkakan hidrogel pada air distilasi,
air minum, larutan buffer asetat 0.1 M pH 4 dan larutan buffer pospat 0.1 M pH 7, baik
pada suhu ruang (a) maupun pada suhu 37 ± 1oC (b).

Derajat pembengkakan meningkat seiring dengan bertambahnya waktu, suhu dan

pH. Derajat pembengkakan meningkat seiring pertambahan suhu karena terjadi
destabilisasi ikat silang yang ada pada hidrogel. Pengurangan pH akan mengakibatkan
berkurangnya derajat pembengkakan, akibat terjadinya gaya elektrostatik yang kuat
antara proton dan gugus anionik yang ada pada hidrogel. Adanya unsur alkali tanah dari
larutan buffer juga mengurangi derajat pembengkakan, karena adanya gaya
elektrostatik antara kation alkali tanah dengan gugus glukuronat pada hidrogel. Nilai
derajat pembengkakan pada air minum tidak sebesar air distilasi, akibat adanya kation-
kation pada air minum yang menyebabkan tingginya koefisien transfer massa.

 Imobilisasi Laktase
Gambar di bawah ini menjelaskan kapasitas imobilisasi (a) dan efisiensi imobilisasi
(b) enzim laktase yang ada pada hidrogel seiring dengan peningkatan waktu, baik pada
pH 4, pH 7, ataupun suhu ruang. Pada pH 4, nilai kapasitas dan efisiensi imobilisasi
cenderung lebih tinggi akibat struktur dan konformasi enzim laktase. Di bawah pH 4.8
(titik isoelektrik), muatan total laktase menjadi positif dan terjadi interaksi dengan gugus
anionik pada jejaring polimer akibat adanya gaya tolak elektrostatik, sehingga kapasitas
imobilisasi meningkat. Sedangkan pada pH lebih dari 4.8, muatan total laktase menjadi
negatif, sehingga kapasitas imobilisasi menurun.
 Hidrolisis Laktase Standar
Gambar di bawah ini menunjukkan konsentrasi glukosa (a) dan aktifitas enzim (b)
beriringan dengan waktu, pada pH 4 dan pH 7. Konsentrasi glukosa akan meningkat
seiring bertambahnya waktu, baik pada pH 4 ataupun pH 7. Efisiensi hidrolisis dan
aktifitas pada pH 4 terlihat lebih kecil dibandingkan pada pH 7, karena terjadinya
denaturasi enzim akibat rendahnya derajat keasaman. Secara umum, hidrolisis laktase
lebih efisien terjadi pada suhu 37oC dan pada pH 7. pH 4 dipilih untuk ditinjau untuk
melihat hidrolisis laktase pada keadaan asam dan pH ini juga cukup sesuai dengan
sistem pencernaan manusia. Aktifitas enzim akan mengalami pengurangan seiring
bertambahnya waktu. Ini terjadi akibat enzim yang terlepas dari hidrogel akan langsung
terdeaktivasi karena adanya hidrolisis laktase. Akhirnya, laktase yang ada pada pori-pori
hidrogel juga terdeaktivasi saat terjadi hidrolisis laktosa, sehingga aktifitas enzim akan
berkurang.
 Released Enzyme Fraction
Fraksi laktase yang dilepas dari hidrogel dipelajari baik pada pH 4 ataupun pH 7.
Fraksi enzim yang dilepas lebih besar pada pH 7 dibanding pada pH 4, akibat interaksi
intermolekuler yang lebih lemah pada proses imobilisasi. Imobilisasi pada pH 4 lebih
lemah dibanding pada titik isoelektrik (pH 4.8), sehingga terjadi gaya elektrostatik yang
lebih kuat antara gugus positif dari enzim dengan gugus negatif dari polimer. Gaya yang
kuat ini membuat enzim sulit terlepas dari hidrogel, sehingga fraksi yang terlepas juga
lebih lemah. Hal sebaliknya terjadi pada pH 7. Karena gaya elektrostatik yang terjadi
cukup lemah, enzim menjadi lebih mudah terlepas dari hidrogel, sehingga fraksi yang
dilepas menjadi lebih besar.

 Siklus Hidrolisis Laktosa dengan Imobilisasi Laktase

Gambar di bawah ini menunjukkan konsentrasi glukosa (a), aktifitas enzimatis (b),
aktifitas relatif (c) , dan released enzyme fractions (d) selama 10x siklus hidrolisis pada
pH 7 dan suhu 37 ± 1oC. Konsentrasi glukosa sedikit berkurang seiring bertambahnya
jumlah siklus hidrolisis. Aktifitas enzimatis relatif dari laktase setelah 10x siklus hidrolisis
dari laktase standar adalah 56.04 ± 0.17 dan laktosa yang terkandung pada susu UHT
adalah 71.80 ± 0.89%. Ini menunjukkan bahwa imobilisasi enzim dapat diaplikasikan
secara efisien pada siklus hidrolisis laktosa tanpa mengurangi aktifitas enzim secara
signifikan. Efisiensi hidrolisis laktosa pada susu UHT juga dipengaruhi dengan adanya
ion-ion logam seperti Na+ , Mg2+ dan Mn2+ yang berperan sebagai kofaktor enzim.
Kemudian, fraksi enzim laktase yang dilepas terlihat berkurang seiring bertambahnya
siklus hidrolisis, yang menunjukkan enzim terimobilisasi ini juga dapat diterapkan pada
industri reaktor biokatalis.
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Dari beberapa poin yang ada pada bab II, dapat disimpulkan beberapa hal.
Imobilisasi enzim laktase pada hidrogel berbasis kitosan merupakan hal yang baik dalam
mengatasi hidrolisis laktosa dan produksi laktosa dosis rendah dan makanan bebas laktosa
dengan harga murah dan hasil lebih baik dibandingkan dengan penggunaan laktase bebas
yang tidak diimobilisasi. Ada beberapa parameter yang perlu diperhatikan, yakni
temperatur, pH , dan titik isoelektrik dari enzim laktase (pH 4.8). Hidrolisis laktosa akan
semakin efisien dengan adanya ion-ion logam seperti Na+ , Mg2+ dan Mn2+ yang berperan
sebagai kofaktor enzim.

3.2. Saran & Penutup

Penulis menyadari banyaknya kekurangan dalam penulisan makalah ini. Untuk itu,
penulis sangat mengharapkan masukan dan kritik dari pembaca yang dapat disampaikan
melalui surel. Terima kasih kepada pembuat jurnal Production of low dosage lactose milk
using lactase immobilised in hydrogel. Semoga kedepannya penulis mampu mengelaborasi
setiap aspek yang akan dibahas dengan lebih baik.
DAFTAR PUSTAKA
Wolf, M. et al. International Dairy Journal (2019) 92 : 77 – 83
https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2018.12.004
Zhang, Y & Zhong, Q. Food Chemistry (2018) 241 : 397 – 402
https://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.09.004
Ahmed, EM . Journals of Advanced Research (2015) 6 : 105 – 121
https://doi.org/10.1016/j.jare.2013.07.006
https://www.nhs.uk/conditions/lactose-intolerance/ , diakses pada 3 Mei 2019 pukul 2.02
WIB
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/440995 , diakses pada 3 Mei 2019 pukul 2.03
WIB
https://www.uoguelph.ca/foodscience/book-page/lactose , diakses pada 3 Mei 2019 pukul
2.05 WIB