Anda di halaman 1dari 5

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan


listrik.Kcepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk
danukuran.dengan demikian elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi makromolekul
(sepertiprotein dan asam nukleat).posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi
denganpewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencega terjadinyadifusi karena
timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakanmatriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis yangdibahas di bawah ini
menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE=poli-acrilamida gelelectrophoresis) untuk separasi
sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi mediumdimana
molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik ,molekul biologi yang bermuatan
positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakaidalam elektroforesis untuk
memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel solbermuatan listrik, maka partikel ini
akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebutelektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative,
maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik.Pergerakan ini
dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahanyang diamati dan kondisi
elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik Elektroferesis adalah
peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu elektroda.Elektrotoresis dapat digunakan untuk
mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpuldi elektroda positif berarti koloid bermuatan
negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektrodanegatif berarti koloid bermuatan positif.Prinsip
elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell

1. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Prinsip:

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu medanelektrik. Jenis
elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah elektroforesis zonan (zonalelectrophoresis) di mana
protein dipisahkan dari satu campuran yang kompleks kepada jalur (band)melalui migrasi didalam larutan
penimbal berair melalui satu matrik polimer dipanggil gel. Gelpoliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim
didalam elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan. Matrik gel boleh
dibentuk sama ada didalam tiub kaca ataukeping (slab) diantara dua kepingan kaca.

Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI nya. Suatu proteinbercas negatif
sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala suatu protein itu bercas positif sekiranya pHlarutan dibawah pI nya.
Banyaknya cas dan voltan yang diberikan akan menentukan berapa jauhnya suatuprotein itu akan bergerak
didalam suatu medan elektrik. Semakin tinggi voltan dan semakin besar casyang terdapat pada protein, maka
semakin besarlah pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan bentuk molekul yang menentukan jejari Stokes
suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan didalam matrik gel tersebut. Pergerakan protein perlahan apabila
pergeseran molekul meningkat akibat darimertambahnya jejari Stokes; dengan demikian, protein yang lebig kecil
bergerak lebih pantas didalammatrik gel. Bagitu juga, pengurangan dalam saiz liang (pore) matrik gel akan
memperlahankan pergerakan.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein dipisahkandalam bentuk
aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesisyang selalu digunakan
bagi pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gelpoliakrilamid (PAGE) dengan suatu
detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein
dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yangmengandungi SDS dan agen penurun, merkaptoetanol atau
ditiotreitol, untuk menceraikan proteinmenjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein
bergabung dengan SDS lalu bercasnegartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua
takungan(reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping
danunit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan medanelektrik
dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrodmengawal pH bagi
mengekalkan cas yang sesuai pada protein dan menkonduksikan arus melalui gelpoliakrilamid. Sistem penimbal
yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai
(desolving gel) pada pH
8
.
8
dan penimbal asetat yangkationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% ataukurang)
reagen pempaut silang (cross-linking) N.N¶-metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satumangkin,
tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat sepertiditunjukkan didalam Rajah
3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian (resolution)protein
didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stackinggel) dengan saiz
liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yangmempunyai saiz liang yang
kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya, digunakanuntuk menimbunkan atau
memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). Pada
pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (casnegatif tinggi) dan glisin (cas negatif rendah)
didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkanprotein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion.
Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yangmempunyai pH berlainan (pH8.9) mengganggu kecerunan
voltan ini lalu membenarkan pemisahanprotein menjadi jalur-jalur yang diskrit.

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan bolehdiubah dengan
cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh dipisahkanpada gel pelarian yang
mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunyadigunakan untuk memisahkan
protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000. Protein yangmempunyai berat molekul lebih besar dari
50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang kepekatanakrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan
(gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkatdari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk
memisahkan satu campuran protein yang mempunyaibanjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan disebelahatas gel
penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam larutanprotein. Pewarna ini
molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan.
Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat padagel umumnya divisualkan dengan
menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blueatau pewarna timah (silver stain). Pewarna
enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.

Kegunaan:
Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk makanan.Sebagai
contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang soyadan pekatan
protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan.Elektroforesis boleh juga
digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar
beratmolekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoproteinmungkin
tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rmsubunit protein dengan
Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai proteinyang disediakan secara komersial
boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat
molekul protein piawai diplotkan melawan padananRm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan
dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, proteindipisahkan oleh
cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pHmenggunakan amfolit
(ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimanapH sama dengan pI protein
tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang palingtertinggi untuk sebarang teknik
pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan protein yangmempunyai pI berbeza kurang dari 0.02
unit pH.

Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-kira 5000dalton)
yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiridari beribu-ribu
polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutangel sebelum
pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasilalu membentuk
kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yangbercas positif kearah katod.
Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yangsempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang
lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakanberdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.

Kegunaan:

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu protein dans Zt.
Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang berhubungan rapatdengan
berdasarkan corak proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah
bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini,molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalammatriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gelbiasanya dilakukan untuk tujuan
analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan
dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR,kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting
yang merupakan metode-metode karakterisasi lebihlanjut.

Elektroforesis gel
merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidangbiokimia dan biologi molekular.
Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkancampuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan
sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukanterhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang
berbeda-beda (menggunakan prinsip dalamelektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yangporositasnya dapat diatur
sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleatberukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-
beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkanpertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih
besar dari beberapa ratus basa), gel yangdigunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah
dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yangditempatkan di
dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampeltersebut akan bergerak di
dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.Dalam hal asam nukleat, arah
pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatannegatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asamnukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atauformamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat
berbentuk lurus. Sementara itu, proteindidenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk
membuat protein tersebutberbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampelyang telah
terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassieblue) dapat digunakan
untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet(misalnya setelah "diwarnai" dengan
etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekulsampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat.

Beri Nilai