ABSTRAK
Praktikum ini membahas tentang metode hitung cawan dengan Angka Lempeng Total
(ALT) untuk uji konfrontasi terhadap bakteri patogen yang dapat ditemukan di dalam bahan
pangan hewani. Metode hitung cawan yang digunakan adalah metode tuang (pour plate) dan
metode sebar (spread plate). Metode tuang (pour plate) merupakan suatu cara untuk
menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan mencampurkan media yang
masih cair dengan kultur bakteri. Sedangkan metode sebar (spread plate) merupakan teknik
untuk penumbuhan mikroorganisme dengan kultur bakteri dituang dan disebar di atas media
yang padat. Prinsip dari Total Plate Count (TPC) atau ALT adalah untuk menentukan jumlah
mikroba yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni bakteri yang
ditumbuhkan pada media agar. Dari hasil penelitian di laboratorium, uji konfrontasi terhadap
bakteri patogen dengan metode tuang lebih baik dibandingkan dengan metode sebar. Hal ini
karena permukaan bakteri lebih halus dan merata di seluruh permukaan media sehingga zona
bening kelihatan lebih jelas, pengukuran diameter lebih mudah, durasi waktu yang digunakan
untuk mengkultur satu cawan petri lebih singkat, dan risiko kontaminasinya lebih sedikit.
Kata kunci: angka lempeng total, metode hitung cawan, metode sebar, metode tuang
1
2
PENDAHULUAN
Masalah keamanan pangan merupakan masalah yang kompleks baik di negara maju
maupun di negara berkembang. Sumber protein dari hewan seperti daging dan produk daging,
ikan dan produk ikan umumnya dianggap sebagai komoditas berisiko tinggi sehubungan
dengan adanya kandungan patogen, racun, dan kontaminan lain yang mungkin. Flora mikroba
atau mikroorganisme yang terdapat dilingkungan pada umumnya merupakan populasi
campuran. Pemisahan bakteri diperlukan untuk mengetahui jenis, ciri-ciri kultural,
morfologis, fisiologis, maupun karakteristik. Teknik pemisahan tersebut dinamakan isolasi
yang disertai dengan pemurnian. Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan
mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur
dengan jenis lainnya atau biakan murni.
Teknik pengambilan sampel untuk mendapatkan mikroba yang diinginkan merupakan
suatu aspek penting yang harus diperhatikan ketika melakukan penelitian mikrobiologi.
Sampel yang diambil haruslah merupakan representasi dari seluruh bagian yang diteliti.
Untuk itu diperlukan teknik yang benar agar terhindar dari kesalahan yang mengakibatkan
sampel menjadi bias. Beberapa prinsip pengambilan sampel antara lain adalah; sampel yang
diambil merupakan perwakilan dari keseluruhan bagian yang diteliti; sampel yang diambil
benar-benar dari sumbernya dan sampel tetap terjaga kondisinya seperti saat pengambilan
sampai dilakukan tahap pembiakan dan analisa sampel.
Morfologi mikroba serta jumlahnya dapat diobservasi dengan cara mengisolasi dan
membiakkannya pada media agar nutrisi terlebih dahulu. Koloni bakteri dapat diamati
pertumbuhannya setelah diinkubasi selama 1 x 24 atau 2 x 24 jam pada suhu yang sesuai,
sedangkan jamur dapat diamati setelah 5-7 hari inkubasi. Karakteristik morfologi tiap koloni
perlu dicatat sesuai dengan ciri-ciri yang ditunjukkan sebagai bagian dari proses identifikasi
bakteri.
Mikroba patogen seperti Salmonella, Escherichia coli, Shigella sonnie dan
Listeriamonocytogenes telah ditemukan dalam air yang digunakan untuk mencuci produk
pangan (Agyei dan Maalekuu, 2014). Maka itu, perlu dilakukan uji konfrontasi terhadap
bakteri patogen dengan metode hitung cawan.maupun teknik kultur terhadap bakteri patogen
dengan metode hitung cawan. Uji konfrontasi terhadap bakteri pathogen adalah salah satu
persyaratan yang harus dilalui oleh suatu kandidat probiotik sebelum dinyatakan sebagai
probiotik. Pengujian ini bertujuan untuk melihat kemampuan suatu mikroba dalam
menghambat atau bahkan membunuh bakteri pathogen (Isnansetyo, 2005).
Pelaksanaannya harus dilakukan dengan benar agar hasil yang didapatkan dapat terukur
dengan jelas. Menurut Sumarsih (2011), pengujian konfrontasi terhadap bakteri pathogen
dapat dilakukan dengan menggunakan metode tuang, metode sebar bakteri uji berupa paper
disk. Metode hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup
akan berkembang menjadi suatu koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan
indeks jumlah mikroba yang hidup terkandung dalam sampel. Setelah inkubasi, koloni
masing-masing cawan diamati. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan
jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo,2010).
Metode hitung cawan yang sering digunakan adalah metode tuang (pour plate)
dan metode sebar (spread plate).
Metode tuang (pour plate) merupakan suatu cara untuk menumbuhkan mikroorganisme di
dalam media agar dengan mencampurkan media yang masih cair dengan kultur bakteri. Pada
3
metode ini, perlu adanya pengenceran sebelum proses penumbuhan pada media agar cair di
dalam cawan petri. Setelah proses inkubasi, koloni akan terbentuk di dalam cawan dengan
jumlah yang dapat dihitung. Sedangkan metode sebar (spread plate) juga merupakan teknik
untuk penumbuhan mikroorganisme, hanya saja pada metode ini kultur bakteri dituang dan
disebar di atas media yang padat (Darmayanti, dkk. 2020).
Kedua metode memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing, menurut
Darmayanti, dkk (2020), metode tuang dapat dimanfaatkan untuk memperoleh biakan murni,
namun sel-sel tumbuh berhimpitan dan membentuk satu koloni, sehingga perhitungan jumlah
bakteri pada metode ini tidak konkret. Dan menurut pernyataan Angelia, Ika Okhtora (2020),
metode tuang membutuhkan waktu yang lebih lama dan bahan yang lebih banyak, namun
tidak membutuhkan keterampilan yang tinggi. Selanjutnya jika pada metode sebar, jumlah
bakteri dapat diperkirakan dalam satuan sel. Kekurangan yang dimiliki metode ini adalah
kesulitan saat meratakan suspensi dengan jarum, dengan tujuan menumbuhkan koloni secara
merata, biakan justru terkontaminasi oleh jarum.
METODE TUANG
Prosedur Praktikum
1. Melakukan pembersihan meja praktik dengan etanol
2. Mengambil cawan petri yang telah disteril
3. Melakukan penulisan kode dan tanggal pada bagian bawah cawan dan penomoran
pada bagian atas cawan
4. Mengisi 6 tabung reaksi dengan air steril sebanyak 9 ml
5. Melakukan penomoran pada tabung reaksi yang telah diisi
6. Memutar tabung reaksi yang berisi suspense bakteri dengan gerakan memutar
7. Memasukkan 1 ml campuran biakan ke tabung reaksi 1 dengan pipet mikro secara
aseptik
8. Melakukan pengadukan dengan vortex mixer
4
9. Memasukkan 1 ml cairan tabung reaksi 1 ke dalam tabung reaksi 2
10. Melakukan pengadukan dengan vortex mixer
11. Melakukan hal yang sama untuk kelima tabung lainnya
12. Memindahkan 1 ml campuran biakan dari tiap tabung reaksi ke tiap cawan petri
secara aseptik
13. Memberi penomoran serta keterangan pengenceran sesuai asal biakan
14. Memasukkan media NA cair yang bersuhu ± 40℃ secukupnya ke cawan petri secara
aseptik
15. Memutar cawan petri searah jarum jam sebanyak lima kali, berlawanan jarum jam
sebanyak lima kali, dan putar membentuk angka 8 sebanyak lima kali
16. Membungkus cawan petri dengan kertas pembungkus
17. Melakukan inkubasi pada cawan petri selama 24 jam di dalam inkubator oven dengan
posisi terbalik
18. Mengatur suhu pada inkubator oven
19. Membuka pembungkus setelah diinkubasi
20. Mengamati diameter, warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk, konsistensi, dan aroma
METODE SEBAR
Prosedur Praktikum
1. Membersihkan meja praktik dengan alkohol 70%
2. Membuat media biakan
3. Melakukan pengisian media biakan ke dalam cawan secara aseptik
4. Membiarkan media hingga berubah menjadi padat
5. Melakukan pengenceran bakteri dengan pengenceran bertingkat
6. Memindahkan sampel bakteri ke media padat secara aseptik
7. Meratakan kultur bakteri di atas media padat dengan jarum ose yang membentuk
huruf L dan disterilkan
8. Melakukan inkubasi pada media
5
6
1 ml suspensi pengenceran 10-1 dipindahkan dengan pipet steril ke
dalam larutan 9 ml Buffer Peptone Water (BPW) untuk mendapatkan
pengenceran 10-2
Pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 dan seterusnya dibuat dengan cara yang
sama sesuai kebutuhan
Gambar 2. Metode Sebar (Spread Plate)
7
Metode pengujian Total Plate Count (TPC) menurut SNI 2897 : 2008 adalah sebagai berikut.
9
1. Penghitung koloni spiral (Sistem Spiral) dengan kisi khusus untuk
menghubungkan volume sampel yang diendapkan ke bagian tertentu dari
cawan petri
2. Perangkap vakum untuk pembuangan cairan (botol vakum 2-4 liter sebagai
reservoir vakum dan sumber vakum 50-60 cm Hg)
3. Gelas mikro sekali pakai, 5 ml
4. Cawan petri, plastik atau gelas, 150 × 15 mm atau 100 × 15 mm
5. Plate count agar (metode standar)
6. Kalkulator (opsional), kalkulator tangan elektronik murah direkomendasikan
7. Kantong polietilen untuk menyimpan piring yang sudah disiapkan
8. Larutan natrium hipoklorit komersial, sekitar 5% NaOCl (pemutih)
9. Air pengenceran steril
10. Jarum suntik, dengan ujung Luer untuk penghalang di stylus; kapasitas tidak
kritis
11. Area kerja, ruang penyimpanan, lemari es, termometer, penghitung, inkubator,
seperti yang dijelaskan untuk Metode Hitung Piring Konvensional, di atas.
12. Larutan natrium hipoklorit (5,25%). Tersedia secara komersial.
10
Dari tinjauan jurnal Soesetyaningsih dan Azizah (2020), dilakukan metode hitung
cawan untuk menghitung jumlah bakteri pada daging sapi. Ada tiga metode hitung cawan
yang dilakukan yaitu metode tuang (pour plate), metode sebar (spread plate), dan drop plate.
Penggunaan metode hitung cawan dan larutan pengencer yang berbeda akan menyebabkan
hasil perhitungan yang berbeda juga. Pada penelitian ini menggunakan dua cara preparasi
sampel yaitu daging yang dipotong dan daging yang dihaluskan. Ada tiga larutan
pengenceran yang digunakan yaitu akuades steril, garam fisiologis 0,85 %, dan larutan Buffer
Peptone Water (BPW). Dari hasil penelitian ini dikatakan bahwa cara preparasi sampel
daging sapi yang lebih efisien yaitu dengan cara dihaluskan. Ini ditunjukkan dengan hasil
hitung cawan yaitu 106 CFU/gram dan hasil hitung tidak bervariasi dibandingkan daging sapi
yang dipotong (105 CFU/gram) dengan hasil hitung yang bervariasi. Sedangkan larutan
pengencer yang lebih baik adalah larutan BPW dan garam fisiologis 0,85 % dibandingkan
dengan larutan akuades. Berdasarkan hasil hitung yang didapatkan, larutan BPW
menghasilkan hasil perhitungan jumlah koloni terbesar.
Alamin dan Ahmed (2015) meneliti tentang jumlah bakteri total dan pemeriksaan
organoleptik berbagai jenis sosis di Sudan yang bertujuan untuk mengevaluasi rata-rata
jumlah bakteri pada sampel segar dan beku. Dalam pembuatan sosis, sampel daging yang
digunakan adalah daging unta, daging sapi, dan daging kambing. Pengenceran dibuat untuk
setiap sampel dan setiap pengenceran dilapisi dengan plate count agar standar. Paramater
lama penyimpanan sampel ini adalah 7 hari, 15 hari, 21 hari, dan 28 hari dengan suhu
penyimpanan (-18°C). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penyimpanan pada suhu (-18°C)
selama empat minggu secara signifikan terjadi penurunan jumlah bakteri. Pembekuan dapat
melukai sel bakteri dan menurunkan jumlah sel bakteri yang hidup. Secara umum, jumlah
bakteri total (TBC) menurun untuk semua perlakuan seiring dengan bertambahnya waktu
penyimpanan.
Uji ALT menggunakan media padat untuk memudahkan perhitungan koloni dengan
hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dapat dihitung (Cahya, 2019).
Pada pengujian ALT, sampel dilakukan pengenceran yang bertujuan untuk mengurangi
jumlah populasi mikroorganisme, karena tanpa dilakukan pengenceran koloni yang tumbuh
akan menumpuk sehingga akan menyulitkan dalam perhitungan jumlah koloni (Cahya,2019).
Media yang digunakan untuk pengujian ALT adalah media Plate Count Agar (PCA). PCA
adalah suatu media yang umumnyan digunakan sebagai tempat menumbuhkan koloni yang
dapat dilihat, dihitung dan diisolasi. Masa inkubasi dilakukan selama 1 x 24 jam dengan
membalik cawan petri yang berisi biakan. Hal ini dimaksudkan dengan untuk menghindari
jatuhnya butir air hasil pengembunan disebabkan suhu inkubator. Apabila sampai terdapat air
yang jatuh maka akan merusak pembacaan angka lempeng total dari sampel yang diuji
(Cahya,2019).
KESIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
Agyei PA dan Maalekuu BK. 2014. Determination of Microbial Contamination in Meat and
Fish Products Sold in the Kumasi Metropolis (A Case Study of Kumasi Central Market and
the Bantama Market). Merit Research Journals 2 (3) : 38 – 46. ISSN: 2350-2274.
Alamin SA dan Ahmed DA. 2015. A Study of Total Bacterial Count and Organoleptic
Examination of Different Types of Sausages in the Sudan. IOSR Journal of Agriculture and
Veterinary Science 8 (8) : 18 – 23. DOI: 10.9790/2380-08811823.
Maturin L dan Peeler JT. 2001. BAM Chapter 3: Aerobic Plate Count. U.S. Food & Drug
Administration.
Seniati, Marbiah, dan Nurhayati. 2017. Kajian Uji Konfrontasi Terhadap Bakteri Pathogen
dengan Menggunakan Metode Sebar, Metode Tuang, dan Metode Gores. Jurnal Galung
Tropika. 6 (1) : 42 – 48. ISSN Online : 2407-6279.
SNI Standar Nasional Indonesia 2897 : 2008. Metode Pengujian Cemaran Mikroba dalam
Daging, Telur dan Susu, serta Hasil Olahannya. Badan Standarisasi Nasional.
Soesetyaningsih E dan Azizah. 2020. Akurasi Perhitungan Bakteri pada Daging Sapi
Menggunakan Metode Hitung Cawan. Berkala Sainstek 8 (3) : 75 – 79. ISSN : 2339-0069.
Utami Nadia. 2021. UJI ANGKA LEMPENG TOTAL DAN BAKTERI COLIFORM PADA
MARGARIN YANG DIJUAL DI PASAR TRADISIONAL DI KOTA MEDAN. Fakultas
Farmasi. Sumatra Utara
12
Utami Ulfah, Harianie L, Kusmiyati N, Fitriasari D P. 2018. Buku Panduan Pratikum
Mikrobiologi Umum. Fakultas Sains dan Teknologi. Malang
Maturin L dan Peeler J.T. 2001. Aerobic Plate Count. https://www.fda.gov/food/laboratory-
methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count
LAMPIRAN
13
14
15
16
17