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DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Y

TOTALES EN TRES MUESTRAS DE AGUA: RESIDUAL,


POZO Y MINERAL

OVERALL FECAL AND TOTAL COLIFORMS IN THREE


SAMPLES OF WATER: WASTEWATER, AND MINERAL
WELL

SULLCA ARAPA, EDER RAFAEL


Universidad Andina Nestor Caceres Velasquez – CAP. Ingenieria Sanitaria y Ambiental

RESUMEN: El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas


características biológicas - químicas especificas, las cuales están
presentes mayormente en el sistema digestivo de los animales como
también en vegetales (semillas) y esparcidas por el suelo, además,
pueden utilizarse como indicadores de contaminación del agua. El
análisis que se realizo, determino la presencia y ausencia de coliformes
fecales y totales en las tres muestras diferentes de agua, como son:
Agua residual, agua de pozo y agua mineral; a partir de cultivar estos
grupos de microorganismos en agares específicos con implementos
adecuados para su identificación. En la primera muestra mencionada, se
obtuvo que el total de muestras analizadas por dilución, presentan
grupos coliforme, mas no se observo lo mismo en las otras muestras de
agua mineral y de pozo. La determinación de grupos coliforme es una
forma de identificar el grado de contaminación por excretas existente en
el agua.

PALABRAS CLAVE: Grupo coliforme, coliformes fecales, coliformes


totales, agar, dilución, inocularcion, incubación.

ABSTRACT: The coliform group is a set of bacteria with certain


biological characteristics - specific chemicals, which are present mainly
in the digestive system of animals as well as in plants (seeds) and
scattered on the ground also can be used as indicators water pollution.
The analysis is performed, the presence and absence of fecal and total
coliforms in three different samples of water, such as: waste water, well
water and mineral water from these groups of microorganisms growing
on specific agars tools suitable for identification. In the first example
above, we showed that the samples analyzed by dilution, coliform
groups, but there were not the same in the other samples of mineral
water and well water. The determination of coliform group is a way to
identify the extent of existing sewage pollution in water.

KEY WORDS: Group coliform, fecal coliforms, total coliforms, agar


dilution, inocularcion, incubation.

1.- INTRODUCCION:

El grupo coliforme, es un conjunto de bacterias con ciertas


características biológicas - químicas especificas, estas características,
propias de cada organismo que integra este grupo muestran que:

– Son organismos aerobios o anaerobios facultativos


– Son gran negativos
– Producen gas
– Fermentan la lactosa a 35ºC a 48h

Estas características son las relevantes de todos los miembros del grupo
coliforme, la bacteria principal de este grupo es la “Escherichia Coli”. De
la cual deriva el nombre del grupo en general. Estos microorganismos se
encuentran de forma continua y general en el sistema digestivo animal,
específicamente en el intestino, por ende, es muy obvio encontrarlos en
zonas donde haya heces y en restos fecales de animales. A estos se les
llaman: “Coliformes fecales”, que al igual que los “coliformes totales”,
forman parte del grupo coliforme.

Coliformes fecales < coliformes totales = grupo coliforme

Estos microorganismos tienen una continua relación con el medio


ambiente, puesto que, en los lugares donde habita cualquier tipo de
animal, existe coliformes, entonces estarán expuestos a diferentes
alteraciones producidas por estas bacterias, como: intoxicaciones y
enfermedades digestivas (mayormente).

Por otra parte, las bacterias coliformes que la lluvia arrastra, por el
suelo, usualmente quedan atrapadas por las rocas y a medida que el
agua pasa por las rocas llega a los sistemas de agua subterránea, sin
embargo, los pozos que no están bien construidos, son una puerta
abierta para que estas bacterias contaminen el agua que se bebe.
El usar este tipo de análisis por coliformes resulta mucho mas sencillo y
económico, a comparación con el de buscar microorganismos
específicos.

Para la detección de estos microorganismos, se utilizan medios de


cultivos específicos, en los cuales se les inocula una parte de la muestra
a analizar, estos medios garantizan los requerimientos nutricionales del
grupo coliforme. Además, para analizar estos coliformes se plantearon
tres fases, la fase presuntiva, la fase confirmativa y la fase
complementaria, cada una de ella con una función especifica en la
identificación y aislamiento de microorganismos del grupo coliforme de
las demás bacterias que están presentes en la muestra.

2.- MATERIALES Y METODOS:

2.1.- Materiales y reactivos:

 Caldo lauril sulfato


 Caldo verde brillante bilis
 Caldo E.C.
 Envases de vidrio esterilizados
 Matraz Erlenmeyer
 Campanas de Durham
 Probetas
 Pipetas
 Tuvos de ensayo
 Agua destilada
 Mechero de alcohol
 Fiolas
 Papel Craft
 Gasa y algodón
 Detergente

2.2.- Métodos:

2.2.1.- Preparación de Materiales:

Se toman todos los materiales de vidrio, luego son lavados con


agua y detergente varias veces, posteriormente se enjuagan con agua
de caño y luego con agua destilada, esta ultima operación se debe de
realizar múltiples veces para limpiar totalmente los envases, si es
posible esta limpieza puede hacerse también con agua bidestilada, esto
para obtener mejores resultados.

Paralelo a ello se realiza la creación de tapones para tuvo hechos


de algodón y gasa para facilitar la inoculación u observación de los
medios de cultivo.

Luego de lavar y enjuagar los materiales, los tenemos listos para


un análisis físico-químico, o para una preparación de químicos, como ha
de ser la preparación de los tres tipos de caldos que nos servirán de
medio de cultivo.

2.2.2.- Preparación de medios de cultivo:

– Preparación del caldo lauril sulfato:

Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación


entre la porción de caldo y agua es la siguiente:

35.6gr. ----------------------------------> 1000mL


Xgr. ------------------------------------> 600mL

 X= 35.6x6001000 => X= 10.68gr.

El volumen de 600mL, proviene de la cantidad de 60 tubos de


ensayo a utilizar, multiplicado por 10mL que es el volumen de
cada tubo.

– Preparación del caldo verde brillante bilis:

Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación


entre la proporción de caldo y agua es la siguiente:

40gr. --------------------------------->1000mL
Xgr. ---------------------------------> 240mL
 X= 240x401000 => X= 9.6gr

– Preparación del caldo E.C:

Según las condiciones del fabricante de este caldo, la relación


entre la proporción del caldo y agua es la siguiente:

37gr. -------------------------------> 1000mL


Xgr. -------------------------------->110mL

 X= 37x1101000 => X= 1.07

Luego de esta preparación de los medio de cultivo en caldos, se


procedió a distribuir parte de estos a cada tubo de ensayo, cada uno con
una campana de Durham que es el accesorio indispensable para
identificar la existencia de coliformes en nuestras muestras de agua, así
formamos nuestros medios de cultivo específicos, que luego de ellos
serán cubiertos con los tapones creados con algodón y gasa, entonces
se les envolvió con papel craft para su seguida esterilización.

2.2.3.- Esterilización de medios de cultivo:

Los medios de cultivo preparados anteriormente, poseen


microorganismos propios del ambiente, los cuales afectarían nuestro
objetivo general, motivo por el cual, este paso nos lleva a esterilizar
estos medios de cultivo dentro de un autoclave. (la esterilización se a de
realizar antes del cultivo de bacterias).

Las condiciones de esterilización son las siguientes:

15 Lb/cm² por 15 a 20 minutos a una temperatura de 121 ºC.

En las características antes mencionadas, se elimina a toda bacteria


presente en nuestros medios de cultivo.

Luego de la esterilización en autoclave, se procederá a inocular nuestras


muestras de agua con diluciones de: 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000

2.2.4.- Inoculación:
Este paso consiste en la introducción de parte de nuestra muestra de
agua con microorganismos a los medio de cultivo para que se
desarrollen, para realizar la inoculación primero se prepararon diferentes
muestras así:

– Para nuestras tres muestras de agua:

Tomamos 1 sorbo de 3mL en una jeringa, de la muestra de agua


que tenemos en el envase de vidrio y lo inoculamos en un tubo
que contenga caldo lauril sulfato, se repite este procedimiento
dos veces mas hasta tener un grupo de tres tubos inoculados, este
grupo de tres tubos serán denominados disolución de 1/1.

Luego del envase de vidrio que contiene nuestra muestra


problema, tomamos en otra jeringa 10mL del agua y la pasamos a
un matraz que contiene 90mL de agua destilada, entonces este
matraz tendrá una dilución de 1/10, de este matraz y con la misma
jeringa traspasamos 1mL de la solución a cada tubo de un
conjunto de 3 tubos que contiene caldo lauril sulfato, entonces la
inoculación de 1/10 ya había terminado.

Posteriormente, del matraz de dilución 1/10, tomamos otros 10mL


para pasarlo a otro matraz que también contiene agua destilada
en 90mL, entonces se había formado una dilución de 1/100, y
también de la misma forma anterior, sacamos 1mL de solución
para cada tubo de una serie de 3 tubos, entonces la inoculación de
1/100 había terminado.

Por ultimo del matraz de dilución de 1/100 se tomo 10mL de


muestra combinada y se paso dicha cantidad a un tercer matraz
que al igual que los anteriores también contenido de agua
destilada en 90mL, entonces se formo la ultima dilución: 1/1000,
de aquí también se tomaron 3mL de los cuales se pasaron de 1 en
1 a una serie de tres tubos que formaron la dilución en tubos de
1/1000.

Luego de esta inoculación a cada tubo, se procedió a una


incubación para que los microorganismos desarrollen en
condiciones optimas y adecuadas a su medio.
El mismo método es aplicado para todas las muestras de agua
pero con diferentes jeringas para no alterar los resultados que
podamos obtener.

2.2.5.- Incubación:

El proceso de incubación consta de dos etapas:

– La primera etapa es de 24h a 35ºC, en esta etapa se han de haber


formado los primeros indicadores de grupos de coliformes, en caso
no verse resultados entonces se pasa ala segunda etapa.

– Esta segunda etapa consta de seguir incubando los medios hasta


pos 48h a 35ºC, como tiempo máximo por que de no haber
resultados, entonces la muestra no presenta coliformes fecales ni
totales dentro de su medio.

– A partir de los resultados obtenidos luego de este experimento se


podrá determinar el número de coliformes por medio del NMP.

2.2.6.- Lectura:

- Esta etapa solo consta de analizar los tubos con nuestro cultivo y
aceptar o descartar los posibles medios que tengas grupos de coliforme,
es decir analizamos los resultados: gas positivo y gas negativo; de estos
solo tomaremos los resultados: “gas positivos”, por que se sabe que los
coliformes totales tienden a producir gas.

2.2.7.- Prueba confirmativa:

– Todos los pasos anteriores pertenecen a la prueba presuntiva, es


decir, solo determinación de coliformes totales, la siguiente
prueba muestra la presencia positiva o negativa de coliformes
fecales dentro de la muestra analizada.

– Los coliformes Fecales tiende a fermentar la lactosa, y también


producir gas, entonces debido a la ausencia de algún caldo que
presente lactosa en su composición, solo se analizo la producción
de gas de las bacterias a partir del caldo verde brillante bilis, pues
este medio aun inhibe y elimina la presencia de bacterias del tipo
gram positivas que también puedan emanar gases pero que no
tiene nada que ver con el grupo coliforme.

– Este procedimiento se llevo a cabo, tomando 10 micras del caldo


lauril sulfato que contenía microorganismos fecales no puros,
estas 10 micras fueron tomadas gracias a un asa de Colli, luego de
la segunda inoculación, también se llevo a incubadora las
muestras con caldo verde brillante, entonces la incubación es solo
de 24h. a las mismas características antes mencionadas.

3.- RESULTADOS:

Los resultados que obtuvimos, dependieron del trabajo en el primero


caldo, es decir:

– En el caldo de lauril sulfato, todos nuestros tubos presentaron


presencia de produccion de gas, debido a que las campanas de
Durham presentes en el interior de nuestro tuvo, ascendieron por
el gas que los mircroorganismos preoducieron, entonces de
nuestros 4 grupos de 3 tuvos de ensayo a diferente dilucion,
solamente seria necesaria el analisis de 3 de estos grupos,
entonces, los resultados obtenidos los plasmamos asi:

• En el conteo de tuvos con rpesencia de gas, se obutvo el


siguiente orden:
3 – 3 – 3.

• Este orden a de ser analizado en la tabla de determinacion


del NMP.
Según este material, el NMP es de 2 400.

Resolviendo y reemplazando el dato obteniedo en nuestra


formula de NMP/100mL.

2400x101 = 24000 NMP/100mL.


El resultado obtenido nos muestra la cantidad de coliformes
presentes en el agua a rango de 100 mL de muestra
problema.

• Una vez separados estos tuvos con produccion de gas (15),


se procede a analizar la produccion de gas en el segundo
caldo, que es aun mucho mas selectivo que el anterior,
hablamos del caldo: Verde Brillante Bilis; en este caso, la
produccion de gas si se llevo a cabo, pudiendo asi confirmar
la presencia de coliformes fecales y totales dentro de la
muestra de agua residual, en cambio, en las otras 2
muestras no hubo produccion de gas en ninguno de los dos
caldos, solo se denoto una pequeña turvidez en la muestra
de agua de pozo, esta podria ser producida por otros
microorganismos, exepto los coliformes, por ende estas
muestras restantes las separamos de nuestro tema
especifico.

4.- DISCUSIÓN:

- Cabe mencionar, que los resultados obtenidos eran los


esperdos por todos, claro esta en cuanto al agua residual, pero
seria necesario un anilisis mas minucioso en lo que respecta al
analisis del agua de pozo, por que, podemos intuir la presencia
de coliformes dentro de estas aguas, pero tendrian que hacerse
en diluciones mucho mas pequeñas 1/10000, 1/100000, etc.

- Por ultimo la presencia de un medio de cultivo que contengas


lactosa es indispensable, puesto que, solo este azucar, es un
asegurados de al repsencia de coliformes fecales, ya que estos
microorganismos tienen la capacidad defermentar este azucar
de leche, el haber usao el cado VBB es un seleccionador no
eficiente, por que tambien hay otros organismos gram
negativos en cualtquier tipo de ambiente, estos pudieron
tambien ser los productores de una cantidad del gas de las
campanas de Durham.
5.- BIBLIOGRAFIA:

– Manual de los porductos BBL y laboratorios productores.6ta


edition. Editado por Power D.;A.y McCuen P. J.. Cockeysville.
Maryland. 1988.

– Introducción a la microbiología del agua. Distribución de


microorganismos en ambientes acuáticos. Laboratorio de
Microbiología. Instituto de Investigación y Análisis alimentarios.
Universidad de Santiago de Compostela. 1.995

– Métodos microbiológicos rápidos para análisis de aguas y


alimentos. Editado por
Borrego, J. J. . Secretariado de Publicaciones e Intercambio
Científico.Universidad de Málaga 1.992